王德君　　閆　軍▲　　高淵濤　　李鵬飛　　王春芳.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西太原　0000；.南昌大學瑪麗女王學院，江西南昌　00；.山西醫(yī)科大學實驗動物中心，山西太原　0000

?

microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷模型對胃腸動力障礙的修復作用

王德君1閆軍1▲高淵濤2李鵬飛3王春芳3
1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，山西太原030001；2.南昌大學瑪麗女王學院，江西南昌330031；3.山西醫(yī)科大學實驗動物中心，山西太原030001

［摘要］目的探討microRNA-31對脊髓損傷后胃腸動力因素的作用。方法將36只microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠和36只FVB小鼠分別設(shè)為對照組和模型組，用Impactor M-Ⅲ脊髓撞擊器建立小鼠脊髓損傷模型。用BBB運動功能評分評估小鼠下肢的恢復情況。HE染色觀察脊髓組織的變化。用Real-time PCR法檢測生長抑素受體（SSTR2）mRNA的表達，用免疫熒光法檢測一氧化氮合酶（iNOS）蛋白和SSTR2蛋白的表達。結(jié)果 造模后第3天、第7天和第14天，脊髓組織破壞、壞死、空泡形成，膠原纖維明顯增加。造模后第14天，F(xiàn)VB模型組與對照組比較，SSTR2 mRNA的表達明顯升高（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達量明顯升高；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與對照組比較，SSTR2 mRNA的表達明顯升高（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達量明顯升高；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與FVB模型組比較，SSTR2 mRNA的表達明顯降低（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達量明顯降低。結(jié)論 脊髓損傷后胃腸動力障礙的發(fā)生可能與SSTR2 mRNA的表達上調(diào)、SSTR2蛋白和iNOS蛋白的表達增高有關(guān)。高表達的microRNA-31可能與脊髓損傷后胃腸動力障礙的恢復有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］脊髓損傷；胃腸動力因素；microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠；生長抑素受體（SSTR2）；一氧化氮合酶（iNOS）

▲通訊作者

外科手術(shù)，尤其是腹部手術(shù)導致的胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的改變，對胃腸動力影響很大，術(shù)后常發(fā)生不同程度的胃腸動力障礙。胃腸動力障礙大多與胃腸功能蠕動減弱有關(guān)，而在調(diào)節(jié)胃腸運動中，胃腸激素是重要介質(zhì)［1］。脊髓損傷后胃腸動力障礙與microRNA的調(diào)控作用相關(guān)，microRNA作為具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，在體內(nèi)廣泛參與新陳代謝、細胞分化、細胞凋亡等過程［2-4］。已有文獻報道，microRNA-31對脊髓損傷有修復作用［5］，在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步研究microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃腸動力的變化，目前，國內(nèi)外尚未見到microRNA-31在脊髓損傷后胃腸動力方面的研究，本文通過研究miRNA-31對胃腸激素生長抑素和一氧化氮合酶的影響，探討其對胃腸動力障礙的作用。以期為手術(shù)創(chuàng)傷后microRNA-31對胃腸動力障礙具有調(diào)控作用，為臨床上治療術(shù)后胃腸動力障礙提供更好的幫助。

1　材料與方法

1.1實驗動物

FVB小鼠（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供），36只，體重25～30 g，雌雄不限，許可證號為：［SCXK（晉）2015-0001］。microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供），36只，體重25～30 g，雌雄不限，許可證號［SCXK（晉）2015-0001］。小鼠級別：清潔級。

1.2試劑

RNA提取試劑（LifeTechnologies），逆轉(zhuǎn)錄（Takara），熒光定量PCR試劑（Life Technologies），SSTR2兔抗鼠一抗（北京博奧森），iNOS兔抗鼠一抗（北京博奧森），Cy3標記的羊抗兔二抗（北京博奧森），引物（Takara），HE染色試劑盒（北京索萊寶），DEPC（Sigma）。

1.3方法

1.3.1動物分組及處理 各取36只FVB小鼠和36只microRNA-31 FVB小鼠，分為A、B兩組，A組為轉(zhuǎn)基因小鼠，B組為FVB小鼠，每組隨機抽取21只作為造模組，剩下的作為對照組。對A、B兩組需要造模的小鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉，麻妥后，背部朝上固定小鼠，根據(jù)浮肋連接的是第13胸椎進行定位，常規(guī)消毒，用剪刀在小鼠背部正中剪開1.5 cm左右的縱向切口，逐層分離直至暴露棘突，再用剪刀小心剔除T10～T13的椎板，暴露脊髓，用Impactor-3撞擊器對準T10～T13的中間進行垂直打擊，高度為25 cm，重量為5 g。打擊后，小鼠出現(xiàn)尾部痙攣搖擺，雙下肢癱瘓，表明造模成功。

1.3.2小鼠運動學評分分別取造模成功的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只，對造模前和造模后第1天、第3天、第7天和第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠采用Basso，Beattie&Bresnahan Locomotor rating scale（BBB）［6］運動功能評分法對其進行后肢運動功能的評分。將小鼠放在寬闊平坦的地方活動，每日6點左右進行雙盲評分，并記錄評分結(jié)果。

1.3.3小鼠脊髓HE染色 分別取3只FVB小鼠、3只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第3天、第7天和第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各3只，解剖小鼠并取下T10～T13節(jié)段脊髓，放入4%的多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，7 μm組織切片，HE染色，鏡下觀察。

1.3.4免疫熒光檢測iNOS和SSTR2蛋白 分別取6只FVB小鼠、6只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只。解剖小鼠并取出胃竇及結(jié)腸組織各1 cm，放入4%的多聚甲醛固定24 h。常規(guī)組織脫水、石蠟包埋，7 μm組織切片，組織脫蠟，微波爐熱修復，7%的山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，Hochest復染，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5RT-qPCR檢測SSTR2 mRNA分別取6只FVB小鼠、6只miRNA-31 FVB小鼠以及造模后第14天的FVB和miRNA-31FVB小鼠各6只。分別處死，取出結(jié)腸組織，Trizol法提取總RNA，作為模板使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。分別對目的基因和β-actin進行實時定量PCR檢測。

SSTR2上游引物5‘TGAGCATCGACCGCTACCT 3‘，下游引物5'CAAAATGACGAGCAGAGACACAC 3‘。β-actin上游引物為5‘CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC 3‘，下游引物為5‘ATGGAGCCACCGATCCACA 3‘。Real-time PCR反應條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 sec，60℃1 min，循環(huán)40次，95℃15 sec，60℃1 min，95℃15 sec，60℃15 sec。

1.4統(tǒng)計學方法

應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件完成統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較先采用單因素方差分析，方差齊時，組間比較采用t檢驗。α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1BBB運動功能評分

小鼠在術(shù)前的評分均為21分，無差異；在7 d和14 d，microRNA-31模型組評分明顯高于FVB模型組（P＜0.05）。microRNA-31組與FVB組每組各6只小鼠，其中在第1天時，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），3 d時，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t=1.81，P＞0.05），7 d時，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.48，P＜0.05），14 d時，microRNA-31模型組與FVB模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.89，P＜0.05）；microRNA-31模型組，3 d、7 d和14 d三個時間點之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=902.6，P＜0.05）；第7天與第3天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t= 24.0，P＜0.05），第14天與第7天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.80，P＜0.05）；FVB模型組，3 d、7 d和14 d三個時間點之間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=777.6，P＜0.05），第7天與第3天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=25.70，P＜0.05），第14天與第7天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=17.14，P＜0.05），見表1。

2.2脊髓打擊前后組織形態(tài)學改變

正常組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細胞形態(tài)正常，分布均勻，尼氏體清晰，細胞膜、細胞核及組織間隙均正常，脊髓損傷后，組織出血、疏松水腫、細胞空泡變性、部分細胞細胞核固縮、神經(jīng)纖維溶解、消失，膠原纖維增多伴淀粉樣變性，灰質(zhì)增生侵入白質(zhì)。見圖1。

2.3免疫熒光檢測

從免疫熒光檢測結(jié)果可以看出，正常組胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2的陽性細胞數(shù)比較少，脊髓損傷后14 d時，胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2的陽性細胞數(shù)明顯增多，同時可以看出，microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與FVB小鼠比較，F(xiàn)VB小鼠的陽性細胞數(shù)量比microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠的陽性細胞數(shù)量相對較多。見封三圖1。

2.4RT-qPCR檢測SSTR2 mRNA

RT-qPCR檢測SSTR2 mRNA的表達量，第3組與第1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脊髓損傷后SSTR2 mRNA的表達明顯增加；第4組與第2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脊髓損傷后SSTR2 mRNA的表達明顯增加；第2組與第1組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩個對照組之間無差異；第3組與第4組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠SSTR2 mRNA的增加量明顯低于FVB小鼠。見圖2。

表1　不同時間點各組BBB評分比較（±s，分）

表1　不同時間點各組BBB評分比較（±s，分）

組別　　樣本數(shù)（只）microRNA-31模型組FVB模型組術(shù)前評分　術(shù)后評分1 d　3 d　7 d　14 d 66 21.00±0.00 21.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.52±0.02 0.50±0.02 5.80±0.53 4.10±0.35 10.00±0.30 7.70±0.37

圖1　脊髓T10～T13節(jié)段橫斷面各時間點擊打處HE染色

3　討論

microRNA具有基因轉(zhuǎn)錄后的負性調(diào)節(jié)作用，抑制多種蛋白的表達，通過上調(diào)和下調(diào)microRNA的表達，可以對胃腸動力產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，新近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可以調(diào)控胃腸平滑肌細胞合成干細胞因子［7］。有研究［8，9］發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)相應microRNA的表達，可以影響腸平滑肌及上皮組織的完整性，表明不同microRNA參與調(diào)控了消化道黏膜上皮細胞及平滑肌細胞的增生、分化及成熟。近年研究證明，microRNA在炎癥反應時骨髓肥大細胞的分化、增殖和功能上起重要作用，調(diào)節(jié)腸易激綜合征的免疫應答過程［10］。目前，microRNA-31對胃腸動力有關(guān)的下游基因的調(diào)控還未見報道。

小鼠脊髓損傷后，BBB評分由0分逐漸增大，組織學觀察損傷初期脊髓組織出現(xiàn)出血、壞死、水腫，符合臨床脊髓損傷的病理變化。說明脊髓損傷的模型已成功建立。胃腸運動信息系統(tǒng)由信號分子如胃腸肽、信號接收系統(tǒng)如胃腸肽受體、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)共同組成。信號分子如有抑制作用的生長抑素異常，可導致胃腸動力障礙［11］。結(jié)腸SSTR2的表達較高，尤其是肌細胞和黏膜上皮細胞［12］。一氧化氮合酶是一氧化氮合成過程中的唯一限速酶，在胃腸道分布廣泛，與消化道的生理調(diào)控和發(fā)病機制關(guān)系密切。

有實驗發(fā)現(xiàn)［13］，脊髓損傷后小鼠組織中的生長抑素和一氧化氮合酶均增高，它們均可以調(diào)節(jié)脊髓損傷后的胃腸運動。本實驗結(jié)果表明，與對照組比較，模型組結(jié)腸組織SSTR2 mRNA明顯增高（P＜0.05），胃竇組織iNOS和結(jié)腸組織SSTR2蛋白表達量明顯增高。由此可見，SSTR2基因表達異常以及iNOS和SSTR2蛋白表達異?？赡軈⑴c了脊髓損傷后胃腸動力障礙的發(fā)生。microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠模型組與FVB模型組比較，SSTR2 mRNA的表達明顯降低（P＜0.05），iNOS蛋白和SSTR2蛋白的表達量明顯降低，由此可以推斷出，高表達的microRNA-31對iNOS和SSTR2具有抑制作用，可以促進胃腸動力障礙的恢復。

生長抑素是一種廣泛分布的抑制性腦腸肽，可抑制胃固體排空和胃張力性收縮［14］，另外生長抑素可參與調(diào)節(jié)胃腸蠕動，其作用機制包括：①通過D細胞旁分泌效應直接抑制大多數(shù)肌間叢神經(jīng)元的沖動發(fā)放，在神經(jīng)和神經(jīng)元連接處釋放引起腸運動抑制；②通過神經(jīng)內(nèi)分泌作用直接抑制胃腸道的運動；③通過抑制乙酰膽堿作用和抑制胃腸道激素起間接作用［15］。胃腸運動是受興奮性和抑制性神經(jīng)雙重支配，當兩者失衡時，就會發(fā)生病理生理紊亂。NO是其中一種重要的抑制性遞質(zhì)，當其含量發(fā)生改變時，就會打破這種平衡使胃腸動力紊亂。NOS作為NO合成的唯一限速酶，在生理狀態(tài)下iNOS分布于胃竇肌層的平滑肌細胞的胞漿內(nèi)，在病理狀態(tài)下，胃腸內(nèi)的細胞可由誘導因子作用產(chǎn)生iNOS的表達。由于NOS與胃腸動力障礙的發(fā)生機理密切相關(guān)，NOS的改變會影響胃腸的運動功能，所以選擇了神經(jīng)遞質(zhì)NOS。從結(jié)果中可以推斷出，高表達量的microRNA-31通過抑制生長抑素和一氧化氮合酶的表達，促進了神經(jīng)元對腸運動沖動的發(fā)放，促進了胃張力性收縮，維持了胃腸動力的平衡，使胃腸動力障礙得到恢復。

綜上所述，手術(shù)創(chuàng)傷后結(jié)腸組織SSTR2 mRNA的表達上調(diào)，SSTR2蛋白iNOS蛋白的表達增高可能參與了胃腸動力障礙的發(fā)生，通過microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與FVB小鼠的比較，可以推測出高表達的microRNA-31參與了脊髓組織損傷后胃腸動力障礙的恢復。為此，我們可以設(shè)計出microRNA-31芯片或者膠囊，為臨床上治療手術(shù)創(chuàng)傷后胃腸動力障礙提供一個良好的治療方案。

圖2　SSTR2 mRNA的檢測結(jié)果

［參考文獻］

［1］黃保民，李穎，馬仲麗，等.大承氣湯對里實熱證大鼠胃腸激素GAS、MTL、VIP、NT的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2010，335（10）：683-687.

［2］Chen X，Xia J，Xia Z，et al.Potential functions of microRNAs in starch metabolism and development revealed by miRNA transcriptome profiling of cassava cultivars and their weild progenitor［J］.BMC Plant Biol，2015，15（1）：33.

［3］Xie M，Zhang S，Yu B.microRNA biogenesis，degradation and activity in plants［J］.Cellul Molecul Life Sci，2015，72 （1）：87-99.

［4］Das A，Ganesh K，Khanna S，et al.Engulfment of apoptotic cells by macrophages：A role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation［J］.J Immunol，2014，192（3）：1120-1129.

［5］田峰.小鼠標準化脊髓損傷模型的建立及miR-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷機制研究［D］.山西醫(yī)科大學，2015.

［6］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rate［J］. J Neurotrauma，1995，12（1）：1-21.

［7］Wu B，Liu L，Gao H，et al.Distribution of interstitial cells of cajal in meriones unguiculatus and alterations in the development of incomplete intestinal obstruction［J］.Histol Histopathol，2013，28（12）：1567-1575.

［8］Zeng L，Carter AD，Childs SJ.miR-145 directs intestinal maturation in zebrafish［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（42）：17793-17798.

［9］Hino K，Tsuchiya K，F(xiàn)ukao T，et al.Inducible expression of micro-RNA-194 is regulated by HNF-alpha during intestinal epithelial cell differentiation［J］.RNA，2008，14（7）：1433-1442.

［10］Mayoral RJ，Pipkin ME，Pachkov M，et al.Micro-RNA-221-222 regulate the cell cycle in mast cells［J］.J Immunol，2009，182（1）：433-445.

［11］劉凱，齊清會.胃腸肽受體及受體后信號傳導與胃腸動力［J］.世界華人消化雜志，2002，10（12）：1445-1449.

［12］Iyo T，Kaneko H，Konagaya T，et al.Effect of intragastric ammonia on gastrin，somatostatin and somatostatin receptor subtype 2 positive-cells in rat antral mucasa［J］.Life Sci，1999，64（26）：2497-2504.

［13］洪麗莉.脊髓損傷模型大鼠的胃腸動力障礙及其電針調(diào)整的研究［D］.廣州中醫(yī)藥大學，2008.

［14］De Herder WW，Lam berts SW.Somatostatin analog the rapy in treatment of gastro intestinal disorders and tumors［J］.Endocrine，2003，20（3）：285-290.

［15］Cuomo R，Samelli G，Grasso R，et al.Functional dyspepsia symptoms，gastric emptying and satiety provocative test analysis of relationships［J］.Scand Jgasroenterol，2001，36（9）：1030-1039.

［中圖分類號］R651.2

［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-9701（2016）13-0031-05

［基金項目］國家自然科學基金項目（81371384）；山西省實驗動物專項資金項目［20（12k01）、2014（k06）、2014（k15）］

收稿日期：（2016-03-15）

Repairing effect of microRNA-31 transgenic mice on gastrointestinal motility disorder in spinal cord injury model

WANG Dejun1YAN Jun1GAO Yuantao2LI Pengfei3WANG Chunfang3
1.Shanxi Medical University First School of Clinical Medicine，Taiyuan030001，China；2.Nanchang University Queen Mary School，Nanchang330031，China；3.Shanxi Medical University Laboratory Animal Center，Taiyuan030001，China

［Abstract］Objective To discuss the effect of microRNA-31 on gastrointestinal motility factors after spinal cord injury. Methods 36 microRNA-31 transgenic mice and 36 FVB mice were divided into control group and model group，respectively.Spinal cord injury model was established by Impactor M-Ⅲ spinal cord striker.The recovery condition of lower limbs in mice was evaluated by BBB locomotion score，and the changes of spinal cord tissues were observed by HE staining.Expression of SSTR2 mRNA was detected by real-time PCR and expressions of iNOS protein and SSTR2 protein were detected by immunofluorescence method.Results At day 3，day 7，and day 14 of modeling，the spinal cord tissues were destroyed and necrotic with vacuolization，and collagenous fiber was markedly increased.At day 14 of modeling，when compared with the control group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly higher（P＜0.05），and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly higher in the FVB group（P＜0.05）.In the microRNA-31 transgenic mice model group，when compared with the control group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly higher（P＜0.05），and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly higher（P＜0.05）.When compared with the FVB model group，the expression of SSTR2 mRNA was significantly lower（P＜0.05）and the expression quantities of iNOS protein and SSTR2 protein were significantly lower in the microRNA-31 transgenic mice model group.Conclusion Gastrointestinal motility disorder after spinal cord injury is possibly related to up-regulation of SSTR2 mRNA expression and increase of SSTR2 protein and iNOS protein expressions.High-expressive microRNA-31 is possibly related to remission of gastrointestinal motility disorder after spinal cord injury.

［Key words］Spinal cord injury；Gastrointestinal motility factors；MicroRNA-31 transgenic mice；SSTR2；iNOS