李積成,祁美英,魏柏青,熊浩明,楊曉艷,靳　娟,金　泳,李　翔,趙小龍,代瑞霞

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青海省烏蘭縣鼠疫病原學(xué)分析及流行病學(xué)意義

李積成,祁美英,魏柏青,熊浩明,楊曉艷,靳娟,金泳,李翔,趙小龍,代瑞霞

青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫預(yù)防控制科,西寧811602

摘要：目的分析青海省烏蘭縣鼠疫菌株生物學(xué)特性及流行病學(xué)意義，為該地區(qū)的鼠疫防治提供科學(xué)依據(jù)。方法對1966—2011年青海省烏蘭縣分離的65株鼠疫菌株進(jìn)行生化試驗、毒力測定、毒力因子鑒定、質(zhì)粒分析、鼠疫菌差異區(qū)段(Different Region，DFR)分型等研究。結(jié)果65株被試菌株生物型為古典型、生態(tài)型均為青藏高原型。菌株基因組型為8型、5型、1b型、37型、44型，主要基因組型為8型。攜帶3種質(zhì)粒譜，83.08%(54/65)菌株攜帶分子質(zhì)量為6×106、45×106、52×106的質(zhì)粒譜。93.85%(61/65)的鼠疫菌具備4個毒力因子，96.97%(32/33) 的鼠疫菌為強(qiáng)毒菌。結(jié)論青海省烏蘭縣分離的鼠疫菌具備青藏高原鼠疫病原體特性, 鼠疫菌的毒力強(qiáng)，因此該地區(qū)的鼠疫防治工作不容松懈。

關(guān)鍵詞：鼠疫；病原學(xué)；流行病學(xué)；烏蘭縣

烏蘭縣位于青海省中部，海西蒙古族藏族自治州和柴達(dá)木盆地東部,海拔2 725～5 031米，總面積1.2萬km2，人口10.1萬人，轄銅普鄉(xiāng)、賽什克鄉(xiāng)、柯柯鎮(zhèn)、希里溝鎮(zhèn)、茶卡鎮(zhèn)。烏蘭縣交通發(fā)達(dá)，青藏鐵路、青藏公路、青新公路橫穿縣境。自1966年首次從喜馬拉雅旱獺體內(nèi)分離出鼠疫菌，證實為鼠疫自然疫源地。到目前為止，疫點(diǎn)分布占全縣面積的80%以上，人間鼠疫也時有發(fā)生。從1966年至今，烏蘭縣共發(fā)生人間鼠疫7起，發(fā)病7例，治愈5例，死亡2例。為全面了解該地區(qū)鼠疫菌的生物學(xué)特性及鼠疫流行規(guī)律，作者對1966—2011年青海省烏蘭縣境內(nèi)分離的鼠疫菌進(jìn)行病原學(xué)研究，旨在為制訂該地區(qū)的鼠疫防治對策提供依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1材料試驗用鼠疫菌65株，系1966—2011年從烏蘭縣境內(nèi)不同宿主及媒介體內(nèi)分離的鼠疫菌。其中喜馬拉雅旱獺44株，牧犬1株，患者及人尸3株，斧形蓋蚤6株，謝氏山蚤4株，腹竇纖蚤深廣亞種2株，草原硬蜱1株，血紅扇頭蜱2株，古北擬額虱2株。所有菌株均由青海省國家鼠疫菌種保藏中心提供。實驗動物為昆明系小白鼠，清潔級，990只，體質(zhì)量18～20 g，由青海省實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌表型特征按常規(guī)方法進(jìn)行鼠疫菌生化、糖醇類酵解試驗、毒力因子等表型特征的研究，根據(jù)傳統(tǒng)的鼠疫菌生態(tài)型6項指標(biāo)進(jìn)行鼠疫菌生態(tài)型分析[1]。

1.2.2毒力測定選取33株菌，將每株菌的37 ℃24 h培養(yǎng)物用滅菌生理鹽水制成菌懸液，比濁后稀釋為2×101、2×102、2×103、2×104、2×105、2×106個/mL菌懸液，分別取0.5 mL皮下注射于小白鼠鼷部，每組5只動物，分籠飼養(yǎng)觀察14 d，動物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，以分離出鼠疫菌為特異性死亡，并計算半數(shù)致死量(LD50)。鼠疫菌株毒力等級分類，參照文獻(xiàn)[1]。

1.2.3質(zhì)粒分析參照文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行，質(zhì)粒DNA相對分子質(zhì)量(Mr)的測定采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對照法。

1.2.4鼠疫菌DNA的提取DNA提取按照經(jīng)典的苯酚-氯仿混合抽提法進(jìn)行[3]。

1.2.5細(xì)菌差異片段(different region，DFR)分型

用23對DFR(DFR01～DFR23)分型引物和1對PMT1質(zhì)粒驗證引物，同時檢索中國鼠疫菌自然分離菌株的DFR分型數(shù)據(jù)庫[3-4]，對被試菌株DNA進(jìn)行分型驗證，以82 009、620 024菌株DNA的等量混合物為陽性對照，同時設(shè)置陰性對照，引物序列及結(jié)果分析方法參見文獻(xiàn)[3]。

2結(jié)果

2.1鼠疫菌生化特性被試的65株鼠疫菌均能分解阿膠糖、麥芽糖和甘油，不分解鼠李糖和密二糖，脫氮陽性， 65株鼠疫菌的生物型為古典型，生態(tài)型為青藏高原型。

2.2毒力因子被試65株菌均能產(chǎn)生Fl和PstI，60株具有VW抗原因子，另外5株則不能產(chǎn)生；Pgm+菌株占93.85%(61/65)、Pgm ±菌株占1.54%(1/65) 、Pgm-菌株占4.62%(3/65)。

2.3毒力測定被試的33株菌中有29株菌的LD50為1～99個菌，3株LD50為100～999個菌，均屬于強(qiáng)毒菌；1株LD50大于10 000個菌，為弱毒菌。結(jié)果顯示，96.97%(32/33) 的鼠疫菌為強(qiáng)毒菌。

2.4鼠疫菌質(zhì)粒譜試驗顯示，攜帶相對分子質(zhì)量為6×106、45×106、65×106質(zhì)粒的菌株為3株，6×106、45×106、52×106的菌株為54株，6×106、23×106、45×106、65×106菌株為8株。

2.5鼠疫菌的基因分型采用23個DFR和1個PMT進(jìn)行PCR擴(kuò)增后顯示，被試的65株鼠疫菌共發(fā)現(xiàn)有5個基因組型。其中8型52株，1b型9株，5型2株，37型1株，44型1株，主要基因組型為8型，均為青藏高原喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地所特有的基因組型。見表1。

表1　23個DFR和PMT1在烏蘭縣65株鼠疫菌中的分布狀態(tài)

注:“1”為檢出, “0”為未檢出

Note：“1”means PCR amplification showed positive；“O”means PCR amplification showed negative．

3討論

本研究結(jié)果顯示，青海省烏蘭縣境內(nèi)分離的65株鼠疫菌的生物型為古典型，生態(tài)型為青藏高原型，有5個基因組型，分別為8型、1b、5型、37型、44型1株，其主要基因組型為8型。共攜帶3種質(zhì)粒譜，83.08%(54/65)菌株攜帶分子質(zhì)量為6×106、45×106、52×106的質(zhì)粒譜。93.85%(61/65)的鼠疫菌

具備4個毒力因子，96.97%(32/33) 的鼠疫菌為強(qiáng)毒菌。表明該地區(qū)分離的鼠疫菌株具有青藏高原喜馬拉雅旱獺鼠疫疫源地病原特性，鼠疫菌的毒力強(qiáng)，因此該地區(qū)的鼠疫防治工作不容松懈。

烏蘭縣是以旱獺為主要宿主的單宿主疫源地，旱獺4月下旬出蟄、10月下旬入蟄，旱獺檢菌率高，檢菌面積大[4]，其體外寄生蚤以斧形蓋蚤和謝氏山蚤為主。1966—2011年烏蘭縣從動物間和人間鼠疫流行過程中分離65株鼠疫菌，說明該地區(qū)動物鼠疫流行十分活躍，并造成人間鼠疫流行。2004年10月，烏蘭縣發(fā)生兩起人間鼠疫，均為接觸染疫旱獺所致，并從患者、死者及家中查獲的旱獺體內(nèi)分離出鼠疫菌，且對這兩起疫情進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)捕食旱獺人員1 252人，旱獺皮張55張，獺爪3 000余只，這些情況的存在增加了該地區(qū)發(fā)生人間鼠疫的潛在威脅。

近年來，由于旱獺及其產(chǎn)品地下交易市場價格飆升，該地區(qū)部分農(nóng)牧民受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，私自進(jìn)入疫源地獵捕旱獺并長途販運(yùn)旱獺及其制品的情況時有發(fā)生，捕獺地點(diǎn)甚至遠(yuǎn)至甘肅、新疆、西藏和青海省動物鼠疫流行高發(fā)的青南地區(qū)。另外，青藏鐵路格拉段開通后，大量外來游客進(jìn)入當(dāng)?shù)兀黾恿送鈦砣藛T接觸染疫動物的機(jī)會和感染鼠疫的可能性。因此，做好該地區(qū)的鼠疫防治工作顯得非常重要。建議：①當(dāng)?shù)乇仨毟叨戎匾暿笠叻揽毓ぷ?，不斷增加人、財、物投入力度，保證鼠疫防控工作正常開展。②加大宣傳教育和健康促進(jìn)工作力度，提高群眾對鼠疫防控知識的知曉率。③加強(qiáng)動物間鼠疫疫情監(jiān)測，嚴(yán)格按照《全國鼠疫監(jiān)測方案》要求開展工作，掌握當(dāng)?shù)貏游镩g鼠疫流行狀況，對動物間鼠疫及時進(jìn)行處理。④完善鼠疫疫情應(yīng)急處理系統(tǒng)，一旦發(fā)生人間鼠疫，及時進(jìn)行科學(xué)、規(guī)范、有序處置，防止疫情傳播和蔓延。⑤加強(qiáng)各級衛(wèi)生人員和專業(yè)技術(shù)人員業(yè)務(wù)培訓(xùn)，穩(wěn)定專業(yè)隊伍，提高防治水平。⑥做好交通檢疫工作，嚴(yán)防鼠疫通過鐵路、公路遠(yuǎn)距離傳播。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.019

通訊作者：代瑞霞，Email:drx200907@163.com

Corresponding author:Dai Rui-xia, Email: drx200907@163.com

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0200-02

收稿日期：2015-05-05；修回日期:2015-09-12

Etiological research and epidemiological significance of Yersinia pestis in Wulan County, Qinghai Province, China

LI Ji-cheng,QI Mei-ying,WEI Bai-qing,XIONG Hao-ming,YANG Xiao-yan,JIN Juan,JIN Yong,LI Xiang,ZHAO Xiao-long,DAI Rui-xia

(Plague Prevention and Control Department, Qinghai InstituteforEndemicDiseasesPreventionandControl,Xining811602,China)

Abstract:We discussed the biological characteristics and epidemiological significance of Yersinia pestis in Wulan County, Qinghai Province, in order to provide scientific basis for plague prevention and control in this area. We chose 65 strains separated in Wulan County, Qinghai Province during 1966 to 2011 to conduct biochemical test, toxicity test, virulence factors evaluation, plasmid analysis and DFR genotype. Results showed that all the strains’ biovars were antique, the ecotype were Qinghai-Tibet Plateau. The strains’ genotype were genomovar8, genomovar5, genomovar1b, genomovar37 and genomovar44, and the genomovar8 was the main genomovar. The strains had three kinds of plasmid spectrum, and 83.08% (54/65) strains’ plasmid spectrum was 6×106, 45×106, and 52×106. The 93.85%(61/65) strains contained all the four virulence factors--Fl, PstI, VW and Pgm, and 96.97%(32/33) were velogenic strains. Strains separated in Wulan County, Qinghai Province had the characteristics of Qinghai-Tibet plateau plague’s pathogen, strains’ toxicity were strong.

Keywords:plague; etiology; epidemiology; Wulan County

國家自然科學(xué)基金(No.81160211)資助

Supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No. 81160211)