梅玲玲，張俊彥，龔　璞，潘軍航，占　利，張云怡，楊　勇,吳嘉南

?

香港海鷗型菌TaqMan-MGB探針實時熒光PCR檢測技術(shù)研究

梅玲玲1，張俊彥1，龔璞1，潘軍航1，占利1，張云怡1，楊勇1,吳嘉南2

1.浙江省疾病預(yù)防控制中心, 杭州310005；;2.浙江大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，杭州310058;

摘要：目的利用TaqMan-MGB探針的實時熒光定量PCR方法，建立一種簡便、快速、特異、靈敏的香港海鷗型菌檢測方法。方法根據(jù)香港海鷗型菌16S rDNA的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針。用不同濃度、不同溫度對反應(yīng)體系引物濃度、探針濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。用添加已知量的香港海鷗型菌樣本驗證方法敏感性；用香港海鷗型菌以及大腸桿菌、沙門菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等致病菌驗證方法特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果當(dāng)25 μL反應(yīng)體系中上、下游引物(10 μmol/L)各為0.6 μL，探針(10 μmol/L)為0.4 μL，模板DNA量為5.0 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 20 s ，變性95 ℃10 s，退火57 ℃ 40 s，40個循環(huán)時，香港海鷗型菌TaqMan-MGB探針實時熒光PCR反應(yīng)Ct值與待檢菌濃度對數(shù)具有良好線性關(guān)系[Ct=-3.538×log(菌濃度)+13.56，r=0.999]，方法的最低檢測濃度達(dá)到36 cfu/mL。23株香港海鷗型菌檢測Ct值均小于35，而104株非香港海鷗型菌檢測Ct值大于35或擴(kuò)增曲線成一平滑直線。隔天連續(xù)5 d重復(fù)試驗Ct值變異系數(shù)小于3。20件活鯉魚、18件活草魚香港海鷗型菌檢測率實時熒光PCR檢測技術(shù)顯著高于常規(guī)檢測方法(P <0.01，χ2=21.50)。且后者所需時間為5 d，前者僅需10 h。結(jié)論TaqMan實時熒光定量PCR法是一種快速簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的香港海鷗型菌檢測方法，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：香港海鷗型菌；TaqMan-MGB探針；實時熒光PCR

香港海鷗型菌(Laribacterhongkonggensis)是近20年來醫(yī)學(xué)界發(fā)現(xiàn)的首種可致人腹瀉，甚至嚴(yán)重腸胃炎的新的致病菌，屬奈瑟氏科，為需氧及兼性厭氧，革蘭陰性無芽孢桿菌。該菌最早見報于2001年，由Yuen等人從一位肝硬化病人的胸腔膿血中分離出(菌株號HKU1)[1]?？梢鹕鐓^(qū)性胃腸炎和旅行者腹瀉，其臨床表現(xiàn)與沙門菌和空腸彎曲菌引起的病征相似，多數(shù)病人出現(xiàn)水樣腹瀉，偶有血便，目前在香港、中國大陸、日本、瑞士、非洲及中美洲相繼被發(fā)現(xiàn)，淡水魚已被證實為香港海鷗型菌宿主[2-5]。

目前香港海鷗型菌的檢測和鑒定方法采用改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂篩選可疑菌落，用API 20NE作生化鑒定，并用紙片法進(jìn)行藥敏實驗作進(jìn)一步確診[2-6]。操作步驟復(fù)雜，周期長，不便于快速確診。本次研究在16S rDNA保守區(qū)域序列設(shè)計特異性引物和TaqMan-MGB探針，運(yùn)用實時熒光PCR技術(shù)，建立了一種快速簡便、特異、靈敏的香港海鷗型菌檢測方法。

1材料與方法

1.1試驗菌株23株香港海鷗型菌分離至草魚或鯉魚，所有菌株的API 20NE生化鑒定結(jié)果與HKUl菌株一致，經(jīng)16S rDNA基因序列分析，與HKUl株同源性在99.4%～100%[6]。痢疾志賀菌CMCC 51570、宋內(nèi)志賀菌CMCC 51334、副溶血性弧菌ATCC 17802、大腸桿菌ATCC 25922、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單增李斯特菌CMCC 54002、大腸桿菌0157：H7 CMCC 43888、傷寒沙門菌CMCC 50097、金色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 25873、變形桿菌CMCC 49072、鴨沙門菌CMCC 50083、擬態(tài)弧菌ATCC 33653購自中國藥品生物制品鑒定所和上海漢尼生物公司。13株單增李斯特菌，25株副溶血性弧菌，12株大腸桿菌，18株沙門菌，22株金色葡萄球菌及1株銅綠假單胞菌由本中心分離自各類食品或腹瀉病人糞便。

1.2主要試劑與儀器MX3000P熒光定量PCR儀為美國Stratagne公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑(DRR039S)購自寶誠生物工程(大連)有限公司，TaqMan-MGB(FAM)探針、引物由美國生物系統(tǒng)(ABI)公司合成。改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂干粉、營養(yǎng)肉湯干粉、營養(yǎng)瓊脂干粉購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司，均經(jīng)質(zhì)量鑒定合格，并在有效期內(nèi)使用。

1.3引物的設(shè)計、合成在GenBank檢索香港海鷗型菌16S rDNA的保守區(qū)域，并通過NCBI網(wǎng)站BLAST確定與其它物種基因非同源的DNA核酸片段。運(yùn)用Primer Express3.0軟件設(shè)計獲得1組引物和探針(表1)。

表1　引物和探針序列

1.4Taq Man-MGB探針實時熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.4.1引物、探針的優(yōu)化總反應(yīng)體系為25 μL，包括Premix EX Taq(2×) 12.5 μL，ROX Reference Dye II(2×)0.2 μL，DNA模板5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)分別采用0.3 μL，0.6 μL，0.9 μL，1.2 μL 4種濃度，探針(20 μmol/L)分別采用0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL 4種濃度按矩陣排列方式組合，在Stratagene Mx3000P 熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性20 s。95 ℃變性10 s、57 ℃退火及延伸40 s，40個循環(huán)，于57 ℃處采集熒光。根據(jù)Ct值和熒光值選擇合適的引物、探針濃度。

1.4.2退火及延伸溫度優(yōu)化將退火及延伸溫度分別設(shè)置為55 ℃，56 ℃，57 ℃，58 ℃，60 ℃，61 ℃，62 ℃，63 ℃，在熒光定量PCR儀進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果選擇最佳退火及延伸溫度。

1.4.3模板DNA的制備

1.4.3.1煮沸法在普通營養(yǎng)瓊脂上挑取1～3個單菌落，置于100 μL滅菌dd H2O中，100 ℃加熱10 min，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.2試劑盒提取法按試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.5靈敏性試驗取香港海鷗型菌新鮮液，用生理鹽水10倍稀釋成10-1～10-7，取10-4～10-74種稀釋液采用平板計數(shù)法作菌量計數(shù)。同時每個稀釋度各取1.5 mL菌液，用熱裂解法提取DNA后進(jìn)行熒光PCR檢測。根據(jù)計數(shù)及PCR結(jié)果評價方法的檢測靈敏度。

1.6特異性試驗用23株香港海鷗型菌以及痢疾志賀菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌等13種標(biāo)準(zhǔn)菌株、13株單增李斯特菌，25株副溶血性弧菌，12株大腸桿菌，18株沙門菌，22株金色葡萄球菌、1株銅綠假單胞菌DNA，通過實時PCR檢測來驗證方法的特異性。

1.7重復(fù)性試驗對3株香港海鷗型菌、1株銅綠假單胞菌ATCC 25873和1株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922連續(xù)5 d重復(fù)進(jìn)行實時PCR檢測，通過計算反應(yīng)Ct值變異系數(shù)驗證方法的重復(fù)性。

1.8檢測方法比較從市場上采集20件活鯉魚、18件活草魚樣品，香港海鷗型菌常規(guī)檢驗方法按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。實時PCR檢測樣本處理，用無菌棉纖挑取少量腸中段內(nèi)容物，接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃需氧培養(yǎng)8 h后，吸取1.5 mL，6 000 r/min 10 min，取沉淀用熱裂解法提取DNA，用最佳的優(yōu)化條件進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增。

1.9診斷標(biāo)準(zhǔn)Ct值小于等于35者為陽性，Ct值大于35或擴(kuò)增曲線成一平滑直線者為陰性，每次試驗均設(shè)陰陽性對照。

2結(jié)果

2.1引物、探針濃度優(yōu)化結(jié)果上、下游引物(10 μmol/L)采用0.3 μL，0.6 μL，0.9 μL，1.2 μL，探針(20 μmol/L)采用0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL按矩陣排列方式組合進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)結(jié)果，隨著PCR反應(yīng)體系中探針濃度的增加，熒光值不斷提高,但Ct值不斷增大。上、下游引物量為0.3 μL時，Ct值偏大，在0.6～1.2 μL范圍時，對Ct值及熒光值影響不明顯(圖1)。

1: primers 1.2 μL, probe 0.4 μL; 2: primers 0.9 μL, probe 0.4 μL; 3: primers 0.6 μL, probe 0.4 μL.

圖1引物、探針濃度優(yōu)化結(jié)果

Fig.1Optimization of the concentration of the primers and the probe

2.2退火溫度的優(yōu)化結(jié)果將退火溫度分別設(shè)置為55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃，用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)結(jié)果，與退火溫度相對應(yīng)的實時熒光PCR擴(kuò)增Ct值分別為14.05、14.91、12.05、14.19、15.14、15.18、16.15。其中溫度為57 ℃時，Ct值最小，熒光值最高。

2.3模板DNA提取方法的比較結(jié)果將煮沸法與試劑盒提取法制備的模板進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)(圖2)結(jié)果，煮沸法制備的2份DNA模板Ct值分別為22.70，24.47，試劑盒提取法的Ct值依次為15.91，15.55。兩種方法的擴(kuò)增熒光強(qiáng)度相當(dāng)。

1, 2: heating method; 3, 4: DNA extraction kit method.

圖2不同模板DNA提取方法的實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2Amplification results using fluorescent real-time PCR with template DNA extracted by different methods

1-7: concentration of bacteria were 3.6×107cfu/mL, 3.6×106cfu/mL, 3.6×105cfu/mL, 3.6×104cfu/mL, 3.6×103cfu/mL, 3.6×102cfu/mL, 3.6×10cfu/mL, respectively.

圖3-1TaqMan-MGB探針實時熒光PCR反應(yīng)靈敏性試驗擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3-1Results of sensitivity tests of TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR

2.4靈敏性試驗結(jié)果用平板計數(shù)法對36 ℃培養(yǎng)20 h香港海鷗型菌肉湯計數(shù)結(jié)果為3.6×107cfu/mL。分別取濃度為3.6×107cfu/mL，3.6×106cfu/mL，3.6×105cfu/mL，3.6×104cfu/mL，3.6×103cfu/mL，3.6×102cfu/mL，3.6×10cfu/mL 7種濃度菌培養(yǎng)物進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果，Ct值與待檢菌濃度對數(shù)具有良好線性關(guān)系，Ct=-3.538×log(菌濃度)+13.56，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999。方法的最低檢測濃度達(dá)到36 cfu/mL(圖3-1、圖3-2)。

X-axle means the concentration of bacteria, Y-axle means Ct value.

圖3-2Taq Man-MGB探針實時熒光PCR反應(yīng)靈敏性試驗擴(kuò)增結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.3-2Standard curve for sensitivity tests of TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR

2.5特異性試驗結(jié)果對23株香港海鷗型菌分離株以及志賀菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、沙門菌、金色葡萄球菌等104株非香港海鷗型菌進(jìn)行實時PCR反應(yīng)結(jié)果，23株香港海鷗型菌Ct值均小于35，而104株非香港海鷗型菌Ct值大于35或擴(kuò)增曲線成一平滑直線(圖4)。

圖4　不同菌株實時熒光PCR反應(yīng)結(jié)果

Fig.4Amplification results of fluorescent real-time PCR for different bacteria strains

2.6重復(fù)性試驗結(jié)果取3株香港海鷗型菌、1株銅綠假單胞菌ATCC 25873和1株大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25922隔天連續(xù)5 d重復(fù)進(jìn)行實時PCR檢測結(jié)果如表1所示。

表2　實時熒光PCR檢測的重復(fù)性檢測結(jié)果

注：S為標(biāo)準(zhǔn)差；CV(%)為變異系數(shù)。

*S: Standard Deviation; CV(%): Coefficient of Variation

由表1可見，3種細(xì)菌均能夠正確判定。3株香港海鷗型菌PCR反應(yīng)平均Ct值分別為14.03、16.42和21.00，Ct值的變異系數(shù)均<5%。銅綠假單胞菌和大腸埃希菌PCR反應(yīng)Ct值最小為37.39，且有6批次擴(kuò)增曲線成平滑直線。

2.7檢測方法比較結(jié)果對20件活鯉魚、18件活草魚同時采用實時熒光PCR檢測技術(shù)與常規(guī)檢測方法進(jìn)行香港海鷗型菌檢測結(jié)果，常規(guī)檢測方法在2件活鯉魚、1件活草魚分離到香港海鷗型菌。實時熒光PCR檢測5件陽性、33件陰性。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析實時熒光PCR檢測技術(shù)顯著高于常規(guī)檢測方法(P<0.01，χ2=21.50)。前者所需時間為5 d，后者僅需10 h。

3討論

香港海鷗型菌(Laribacterhongkongensis)是2001年香港大學(xué)發(fā)現(xiàn)并命名的食源性致病菌，為廣東淡水魚輸往香港的必檢致病菌之一[1-5]。雖然至今尚未出現(xiàn)香港海鷗型菌引起的食源性疾病暴發(fā)，但由于污染源為人群消費(fèi)量極大的淡水魚產(chǎn)品，我國存在暴發(fā)香港海鷗型菌食源性疾病的可能性。建立快速、簡便、特異、敏感的香港海鷗型菌檢測方法對該食源性疾病的預(yù)防、控制和快速診斷具有重要意義。

本次研究針對香港海鷗型菌該菌的16S rDNA保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和TaqMan-MGB探針建立的TaqMan-MGB探針實時熒光PCR方法避免了常規(guī)PCR檢測存在假陽性和PCR污染等弊端。實驗采用的TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，在探針的3′端增加了MGB(minor groove binder)分子，探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，從而大大降低實時熒光PCR反應(yīng)本底信號。同時MGB的修飾將探針的退火溫度提高10 ℃左右，提高了PCR反應(yīng)過程中的特異性[7]。通過反復(fù)實驗，最終優(yōu)化得到的反應(yīng)體系為Premix Ex TaqTM(2×) 12.5 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50×) 0.5 μL ，上、下游引物(10 μmol/L )0.6 μL，熒光探針溶液(20 μmol/L) 0.4 μL， 模板 2 μL，再用d H2O 補(bǔ)足至25 μL 。PCR 反應(yīng)條件(兩步法)：95 ℃ 10 s,1個循環(huán)；95 ℃ 5 s,57℃ 20 s，40個循環(huán)，整個反應(yīng)過程不到1 h，檢測靈敏度達(dá)到36 cfu/mL，對香港海鷗型菌以及志賀菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、沙門菌、金色葡萄球菌等細(xì)菌檢測具有很好的特異性，穩(wěn)定性高。此方法的建立為香港海鷗菌的檢測提供了有效的工具。

不同的引物不僅影響方法的特異性，且影響擴(kuò)增效率，選擇適合的引物對建立快速、簡便、特異、敏感的香港海鷗型菌檢測方法致關(guān)重要?？紤]到TaqMan-MGB探針合成價格較高，本次試驗前期利用SYBR GreenⅠ熒光染料對3組引物進(jìn)行篩選，效果同樣明顯，卻節(jié)約了2條TaqMan-MGB探針合成成本。在DNA模板的制備上，試劑盒提取法的Ct值雖小于煮沸法，但考慮到煮沸法操作簡便、快速、廉價，且不影響檢測結(jié)果。因此，作者認(rèn)為DNA模板的制備可采用煮沸法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yuen KY, Woo CY, Teng LL, et al.Laribacterhongkongensisgen. nov., sp. nov., a novel gram-negative bacterium isolated from a cirrhotic patient with bacteremia and empyema[J].J Clin Microbiol, 2001, 39(12): 4227-4232.

[2]Woo PC, Kuhnert P, Burnens AP, et al.Laribacterhongkongensis: a potential cause of infectious diarrhea[J].Diagn Microbiol Infect Dis, 2003, 47(4): 551-556.

[3]Teng LL, Woo CY, Ma SL, et al. Ecoepidemiology ofLaribacterhongkongensis, a novel bacterium associated with gastroenteritis[J].J Clin Microbiol, 2005, 43(2): 919-922.

[4]Ren SH, Ni XP, Sun JR, et al. A report onLaribacterhongkongensisisolated from a patient with community-acquired gastroenteritis[J].Chin J Epidemiol, 2006,(27): 614-617.(in Chinese)

任淑華，倪曉平，孫建榮，等．社區(qū)獲得性胃腸炎患者中分離出香港海鷗形菌的研究報告[J].中華流行病學(xué)雜志，2006，(27)：614-617.

[5]Xu J, Zhang J, Liu XM, et al. Survey ofLaribacterhongkongensisin fish from coastal areas of China in 2005[J].Chin J Food Hyg, 2006, 18(6): 517-520.(in Chinese)

徐進(jìn)，張靜，劉秀梅，等．2005年中國5個沿海省份魚類產(chǎn)品中香港海鷗菌的污染調(diào)查[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18(6)：517-520.

[6]Mei LL, Gao WJ, Zhu M, et al, Survey ofLaribacterhongkongensiscontamination with 369 samples of freshwater fish and marine fish caught in Zhejiang Province[J].Chin J Food Hyg, 2007, 19(4): 300-303.(in Chinese)

梅玲玲，高雯潔，朱敏，等．浙江省369份淡、海水魚香港海鷗型菌污染狀況研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2007，19(4)：300-303.

[7]Zhao HY, Bao JF. The principle and application of fluorescent real-time PCR[J].Chin J Histochem Cytochem, 2007, 16(4): 492-497.(in Chinese)

趙煥英，包金風(fēng).實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國組織學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16(4)：492-497.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.012

Corresponding author:Mei Ling-ling, Email:llmei@cdc.zj.cn

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)02-0160-05

收稿日期：2015-05-04；修回日期:2015-08-14

TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR method for detection of Laribacter hongkonggensis

MEI Ling-ling1,ZHANG Jun-yan1,GONG Pu1,PAN Jun-hang1,ZHAN Li1,ZHANG Yun-yi1,YANG Yong1,WU Jia-nan2

(1.Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310005, China;2.ZhejiangUniversityCollegeofBiosystemsEngineegringandFoodScience,Hangzhou310058,China)

Abstract:A TaqMan-MGB probe fluorescent real-time PCR method was developed for the detection of Laribacter hongkonggensis with high specificity and sensitivity. Primers and probe were designed based on the conservative sequence region of 16S rDNA. Meanwhile, the concentration of both primers and probe in amplification system and annealing temperature were optimized. The sensitivity, specificity and stability of this method were tested. Under the optimal amplification conditions, a strong linear relationship between the Ct and the logarithm of the bacteria concentration was obtained [Ct-3.538 log(concentration of bacteria)+13.56, r=0.999], the detection limitation attained 36 cfu/mL. The Ct of 23 L. hongkonggensis strains were all less than 35, to contrast, the Ct of most of the 104 strains, which belong to other species, were above 35, even no typical amplification curve was detected in some strains. The coefficient of variation of this method was exhibited less than 3 according to repeated experiments that were performed 3 times in 5 days. The detection rate of L. hongkonggensis from either 20 living carps or 18 living grass carps by using fluorescent real-time PCR was significantly higher than that by using traditional detection method(P<0.01, χ2=21.50). The fluorescent real-time PCR method was demonstrated to be specific, sensitive and simple for the detection of Laribacter hongkonggensis.

Keywords:Laribacter hongkonggensis; TaqMan-MGB probe; fluorescent real-time PCR

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(No.2013KYB055)資助

Email: llmei@cdc.zj.cn

Supported by the Medicine and Health Science-technology Project of Zhejiang Province(No. 2013KYB055)