郭錚蕾，谷 強(qiáng)，韓 玥，徐 姍，李 偉（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 10026）

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質(zhì)量控制圖在藍(lán)舌病競爭ELISA檢測中的應(yīng)用

郭錚蕾，谷 強(qiáng)，韓 玥，徐 姍，李 偉
（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 10026）

摘 要：［目的］建立藍(lán)舌病競爭ELISA檢測的質(zhì)量控制圖。［方法］采用即刻法與Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖法結(jié)合，繪制連續(xù)20次檢測結(jié)果的質(zhì)控圖。更換質(zhì)控血清批號和試劑盒批號時，采用雙質(zhì)控法對前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控，再轉(zhuǎn)入常規(guī)質(zhì)控圖。 ［結(jié)果］用即刻法對質(zhì)控物進(jìn)行3次連續(xù)測定后，就可對第3次檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，用此方法積累20次質(zhì)控物的檢測結(jié)果后，可用Excel繪制出Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖，用以實(shí)驗(yàn)室日常質(zhì)控。若實(shí)驗(yàn)室更換質(zhì)控血清批號和試劑盒批號，采用雙質(zhì)控法對前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控。［結(jié)論］采用雙質(zhì)控法對前3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果做質(zhì)控，改進(jìn)了即刻法只能從第3次結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控的缺點(diǎn)，加強(qiáng)了即刻法在ELISA檢測中的質(zhì)控作用。

關(guān)鍵詞：質(zhì)量控制圖；即刻法；雙質(zhì)控；ELISA；藍(lán)舌病

控制圖是對檢測過程中質(zhì)量的特征值進(jìn)行測定、記錄、評估，從而觀察檢測過程是否處于控制狀態(tài)的、采用統(tǒng)計(jì)方法設(shè)計(jì)的圖。實(shí)驗(yàn)室使用控制圖是為了預(yù)防不符合工作的發(fā)生，這是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的重要方法。CNAS- CL52：2014 《CNAS-CL01＜檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則＞應(yīng)用要求》［1］5.9.2規(guī)定，“適用時，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用質(zhì)量控制圖來監(jiān)控檢測或校準(zhǔn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度”。質(zhì)量控制圖多用于實(shí)驗(yàn)室定量分析的質(zhì)量控制，在免疫學(xué)方面多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，但應(yīng)用于動檢領(lǐng)域的ELISA方法未見報(bào)道。

與一般定量分析的質(zhì)控方法相比，ELISA檢測的室內(nèi)質(zhì)控有其特殊性。ELLSA檢測試劑盒的有效期短，批號更換較頻繁，因此實(shí)驗(yàn)室在短期內(nèi)很難積累20次質(zhì)控物的檢測結(jié)果，所以對同一批號試劑在常規(guī)條件下連續(xù)檢測20次，難度大，易造成數(shù)據(jù)不足，難以做出完整的質(zhì)控圖，進(jìn)而不能即時進(jìn)行試驗(yàn)監(jiān)控，失去了質(zhì)控意義。

目前，對ELISA試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控，常規(guī)上采用即刻法（Grubbs 法）和Levey-Jennings 常規(guī)質(zhì)控圖（簡稱L-J圖）結(jié)合的方法［2-3］。用即刻法連續(xù)測量3次就可對第3次結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，彌補(bǔ)了L-J圖需要連續(xù)測定20次才能進(jìn)行質(zhì)控的局限，但是使用即刻法無法判斷前2次的檢測結(jié)果是否在控，而采用雙質(zhì)控法［4-5］對前3次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，再按即刻法處理，即可達(dá)到控制的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與 試劑

酶標(biāo)儀（Multiskan FC）、洗板機(jī)（Wellwash Versa ）、藍(lán)舌病競爭試劑盒（IDVET，批號656、680）。

1.2 即刻法繪制質(zhì)控圖

按ELISA試劑盒說明書操作，以450 nm波長比色，按說明書計(jì)算臨界值（cut-off值，CO），每個板測兩個陰性對照，CO=OD陰*0.4，每個板測兩個陽性對照，S=OD陽，用S/CO值表示質(zhì)控值，從第3次測量開始用“即刻法”對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，計(jì)算3次S/CO值的均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），再計(jì)算SI上限和SI下限，查SI值表判斷質(zhì)控結(jié)果有無失控［6］，按照Grubbs剔除異常值的方法［6］，若結(jié)果處于“告警”或“失控”狀態(tài)應(yīng)舍去，并重新測定質(zhì)控血清；若結(jié)果處于控制范圍內(nèi)，繼續(xù)檢測并計(jì)算，積累20次測定結(jié)果后，用Excel畫出L-J質(zhì)控圖。具體做法是：

在Excel中輸入20次測量的OD陽、OD陰，用AVERAGE函數(shù)公式計(jì)算D陽、D陰，編輯函數(shù)公式，計(jì)算CO值和S/CO值。從第3次的測量結(jié)果開始，用AVERAGE函數(shù)計(jì)算S/CO的平均值（），用SDTV函數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（s）。從第3次的測量結(jié)果開始，用MAX函數(shù)和MIN函數(shù)分別計(jì)算最大值和最小值。編輯函數(shù)（xmax-）/s計(jì)算SI上限，編輯函數(shù)（-xmin）/s計(jì)算SI下限。根據(jù)SI值表，用IF函數(shù)編輯上限結(jié)果和下限結(jié)果的在控狀態(tài)，當(dāng)SI上限和SI下限均小于n2s時，表示結(jié)果“在控”；當(dāng)SI上限或SI下限處于n2s和n3s之間時，表示結(jié)果“告警”；當(dāng)SI上限或SI下限大于n3s時，表示結(jié)果“失控”。處于“告警”和“失控”狀態(tài)的數(shù)值應(yīng)舍去。

以測量次數(shù)作為橫坐標(biāo)、以S/CO值作為縱坐標(biāo)，用Excel繪制L-J常規(guī)質(zhì)控圖，系列分別選擇“質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（S/CO）” “上控制限UCL（+3s）” “UWL上警戒限（+2s）” “中心線CL（）” “下警戒限LWL （-2s）” “LCL下控制限（-3s）”。設(shè)置縱坐標(biāo)的最大值為+4s、最小值為—x-4s、主要刻度單位為s值、次要刻度單位為s/10的值。

表1 SI值表

1.3 雙質(zhì)控法繪制質(zhì)控圖

在更換質(zhì)控血清批號時，將新批號的質(zhì)控血清在舊批號質(zhì)控血清即將結(jié)束使用時與舊批號質(zhì)控血清一起測定3次，也就是在同一酶標(biāo)板上分別加新、舊批號的質(zhì)控血清。舊批號質(zhì)控血清數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)上一質(zhì)控圖計(jì)算，新批號血清的質(zhì)控結(jié)果按即刻法分析。在更換試劑盒批號時，在舊批號的試劑盒即將結(jié)束使用時將新批號試劑盒的部分孔位與舊批號試劑盒同時測定3 次，兩種試劑盒均加入同一批號的質(zhì)控血清，舊批號試劑盒的質(zhì)控結(jié)果點(diǎn)進(jìn)質(zhì)控圖，新批號血清的質(zhì)控結(jié)果按即刻法分析。

2 結(jié)果

2.1 即刻法繪制質(zhì)控圖

從表2中看出，第4次和第5次數(shù)據(jù)出現(xiàn)了“失控”的情況。按照Grubbs法剔除異常值，將第4次的測量結(jié)果剔除掉后，以下的測量結(jié)果均在控。剔除異常值后的測量結(jié)果見表3，畫L-J質(zhì)控圖，如圖1所示。

表2 即刻法所得20次測量結(jié)果及數(shù)值在控狀態(tài)

根據(jù)控制圖的判斷原則［7］，未出現(xiàn)判穩(wěn)準(zhǔn)則和判異準(zhǔn)則中的以下異常情況：21個點(diǎn)中有1點(diǎn)落在3s以外；連續(xù)9點(diǎn)落在中心線同一側(cè)；連續(xù)6點(diǎn)遞增或遞減；連續(xù)14點(diǎn)中的相鄰點(diǎn)交替上下；連續(xù)3點(diǎn)中的2點(diǎn)落在中心線同一側(cè)2s以外；連續(xù)5點(diǎn)中的4點(diǎn)落在中心線同一側(cè)1s以外；連續(xù)15點(diǎn)落在中心線兩側(cè)的1s以內(nèi)；連續(xù)8點(diǎn)落在中心線兩側(cè)，且無一在1s以內(nèi)。因此，本批次20次質(zhì)控值建立起的質(zhì)控圖是有效的。

2.2 雙質(zhì)控法繪制質(zhì)控圖

2.2.1 兩種批號質(zhì)控血清雙質(zhì)控法的結(jié)果見表3，舊批號40～42 次的質(zhì)控血清與新批號1～3 次的質(zhì)控血清對應(yīng)同板試驗(yàn)。

2.2.2 兩種批號試劑盒雙質(zhì)控法結(jié)果見表4，舊批號試劑盒31～33次與新批號試劑盒1～3 次對應(yīng)同批質(zhì)控血清試驗(yàn)。

表3 Grubbs法剔除異常值后的20次測量結(jié)果

3 討論

在檢測工作中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制是降低實(shí)驗(yàn)誤差、保證檢測質(zhì)量的重要手段。對于定量檢測項(xiàng)目，大多采用Levey-Jenings質(zhì)控方法或Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法繪制質(zhì)控圖。免疫學(xué)很多檢測項(xiàng)目采用ELISA法定性，但因手工法和半自動化等特點(diǎn)導(dǎo)致其難以標(biāo)準(zhǔn)化，且檢測頻次低、試劑盒有效期短、批號更換頻繁，因此ELISA試驗(yàn)的質(zhì)控圖多采用即刻法與常規(guī)質(zhì)控圖結(jié)合的方法。

圖1 藍(lán)舌病競爭ELISA質(zhì)控圖

圖2 藍(lán)舌病競爭ELISA舊批次質(zhì)控血清24～42次質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控圖

表4 不同批次質(zhì)控血清質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

表5 不同批次試劑盒質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

圖3 藍(lán)舌病競爭ELISA舊批次試劑盒15～33次質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控圖

不同于定量檢測項(xiàng)目選取被測性能在重復(fù)試驗(yàn)中相對穩(wěn)定的值作為特征值，免疫學(xué)試驗(yàn)中臨界于cut-off值（CO值）的低值弱陽性質(zhì)控物是質(zhì)控的關(guān)鍵，低值弱陽性-臨界值血清是質(zhì)控精密度觀測的最敏感的窗口，也是提示試驗(yàn)是否成功的標(biāo)識，因此選擇S/CO值作為質(zhì)控的特征值。

Grubbs法是一種離群值檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，一組測定值中的明顯偏離測定值群體的過大或過小值稱為離群值，其既可能是測定結(jié)果隨機(jī)波動的極值，也可能是與群體測定值非屬同質(zhì)總體的異常值。如果事先給定一個小概率事件臨界點(diǎn)作為隨機(jī)因素影響的最大波動值（即SI界值表），那么凡是測定偏差超過臨界值的離群值將被視為異常值，反之被視為極值加以保留。使用即刻法在出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，對于結(jié)果的取舍有兩種意見，一是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，剔除末次測定值；二是出現(xiàn)“告警”或“失控”值時，剔除最大偏離值。Grubbs法用公式SI上限=（Xmax-）/s，SI下限=（-Xmin）/s計(jì)算SI上限和SI下限值，然后與臨界值表（即SI值表）進(jìn)行比較，以判斷臨界值是否為異常值，因此Grubbs法是判斷一組測定值中的極大或極小值是“在控極值”還是“異常值”的方法，不能用末次測定值作為異常值。

在表2中，從第4次測定結(jié)果開始，連續(xù)出現(xiàn)了2個“失控” 值，由于第4次的測量結(jié)果與前3次比是最大值，第4次極值引發(fā)了第5次測量值的失控，因此剔除了第4次極大值后，以下結(jié)果均變?yōu)椤霸诳亍薄?/p>

由于即刻法是從當(dāng)天和以前的所有測定值中找出最大值和最小值，因此在測定次數(shù)較少時，用即刻法有些離群值不一定會顯示失控，但隨著測定次數(shù)的增加，測定值逐漸趨于穩(wěn)定，這時之前的離群值就會暴露顯示為“告警”或“失控”，因此Grubbs法判斷異常值有一定的滯后性，也被稱為“回顧性失控檢出”。即刻法的另一個缺點(diǎn)是結(jié)果容易受到前3個測定值的影響，因?yàn)樵诮y(tǒng)計(jì)學(xué)中，樣本量少時易出現(xiàn)抽樣誤差。因此會出現(xiàn)即刻法未檢出失控值，但是用L-J質(zhì)控圖分析時發(fā)生失控的現(xiàn)象，這是由于前3次質(zhì)控結(jié)果精密度差引起的。因此在質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)較多的情況下，L-J質(zhì)控圖法優(yōu)于即刻法，所以在20次測定結(jié)果完成后，應(yīng)及時制作L-J質(zhì)控圖進(jìn)行分析。

由于即刻法是從第3次測定才開始進(jìn)行質(zhì)控，雙質(zhì)控法就解決了前2次結(jié)果無法進(jìn)行質(zhì)控的問題。從表4、表5和圖2、圖3中可以看出，原試劑盒和原血清均處于“在控”狀態(tài)，這也就說明所換試劑盒和質(zhì)控血清的前3次結(jié)果也處于“在控”狀態(tài)，保證了即刻法的所有結(jié)果處于連續(xù)可靠狀態(tài)。在免疫學(xué)檢測中，不同批號試劑盒，甚至同一批號試劑盒的不同板次所檢測的樣品或質(zhì)控血清的OD值都會有一定的差異，不同批次質(zhì)控血清的試驗(yàn)結(jié)果也不一定一樣，在更換試劑盒或質(zhì)控血清時，試驗(yàn)結(jié)果常處于不穩(wěn)定狀態(tài)，且ELISA 試驗(yàn)的影響因素較多，因此更需要建立有效的質(zhì)控分析。此前，ELISA試驗(yàn)質(zhì)控圖多用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上，如HBsAg的初篩、抗HIV的初篩等，在動物檢疫領(lǐng)域中尚未見報(bào)道。本研究將ELISA試驗(yàn)質(zhì)控圖初試于動檢領(lǐng)域的藍(lán)舌病毒檢測上，為動檢領(lǐng)域其它疫病的ELISA檢測提供了質(zhì)控方法的參考。但是，目前還沒有ELISA檢測的確切質(zhì)控方法，因此以藍(lán)舌病為初探的質(zhì)控圖方法有待于在動檢領(lǐng)域的進(jìn)一步驗(yàn)證和擴(kuò)展。

參考文獻(xiàn)：

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［7］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.常規(guī)控制圖：GB/T4091-2001［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Application of Quality Control Chart for Detection of Bluetongue Disease Virus by Competitive ELISA

Guo Zhenglei，Gu Qiang，Han Yue，Xu Shan，Li Wei
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026 ）

Abstract ：［Objective］ To establish the quality control chart for detecting bluetongue virus by competitive ELISA.［Methods］The instant method with Levey-Jennings routine quality control chart method was applied to draw an instant-added L-J quality control chart after 20 results were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three detection results and then the routine quality control chart method was used to control the subsequent results.［Results］The three primary quality control data were calculated statistically by instant method.The instant-added L-J quality control chart could be drawn by Excel software after 20 datas were accumulated.While making changes of agent batch number or quality control serum，the double quality control method was used to control the fi rst three results.［Conclusion］The double quality control method solved the problem of uncontrolled test results in the initial times with the instant method and strengthened the quality control with the instant method in ELISA test.

Key words：quality control chart；instant method；double quality control；ELISA；bluetongue

中圖分類號：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）02-0077-05

基金項(xiàng)目：質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK009）——質(zhì)量控制圖在動檢血清學(xué)檢測應(yīng)用的示范性研究