時建立，徐勝男，彭 喆，張玲玲，徐紹建，鄭書軒，吳曉燕，于 江，孫文博，杜以軍，吳家強，李 ?。?山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 5000；.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 6609）

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圓環(huán)病毒2型抗體膠體金檢測試紙條的初步研制及應(yīng)用

時建立1，徐勝男1，彭 喆1，張玲玲2，徐紹建1，鄭書軒2，吳曉燕1，于 江1，孫文博1，杜以軍1，吳家強1，李 俊1
（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109）

摘 要：為快速檢測豬群中豬圓環(huán)病毒2型抗體，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，并標(biāo)記純化的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白和兔IgG，包被至玻璃纖維膜上制備金標(biāo)墊，將純化抗原和羊抗兔IgG分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線與質(zhì)控線上，建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的膠體金免疫層析方法并組裝檢測卡。結(jié)果顯示，組裝的檢測卡只與圓環(huán)病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，陽性血清稀釋10倍后仍然能夠檢出。用此檢測卡與商品化ELISA試劑盒對100份臨床血清進(jìn)行平行檢測，陽性率分別為89%和93%，兩種方法符合率在95%以上。該方法操作簡便、特異性強，可廣泛應(yīng)用于基層，也為圓環(huán)病毒疫苗效果評價提供了良好的試劑選擇。

關(guān)鍵詞：PCV2抗體；膠體金免疫層析；快速診斷

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是對豬群危害較嚴(yán)重的病毒性傳染病［1］，在豬群病原中所占比例較高。PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎炎綜合征（PDNS）、幼齡仔豬的先天性震顫、豬呼吸道綜合征、滲出性皮炎、繁殖障礙和增生性壞死性肺炎等。隨著病毒基因組不斷變異，病毒的致病性也在發(fā)生變化，對豬群的危害越來越大，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展［2-4］。

目前，隨著國內(nèi)圓環(huán)病毒疫苗的上市，疫苗在規(guī)?；i場的應(yīng)用越來越廣泛。由于不同廠家的疫苗質(zhì)量參差不齊，所以對圓環(huán)病毒特異性抗體的檢測顯得尤為重要。目前檢測PCV2抗體的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗（IFA）等［5］。這些方法都需要昂貴的儀器設(shè)備、操作熟練的技術(shù)人員、較長的檢測時間等，很難在基層推廣。膠體金免疫層析技術(shù)做為一種快速、方便、特異的診斷方法，具有獨特的應(yīng)用優(yōu)勢。本研究應(yīng)用實驗室純化的Cap蛋白，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，研制了檢測PCV2抗體的膠體金試紙條，為豬圓環(huán)病毒抗體的快速檢測提供了候選方法。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料與儀器

Cap蛋白由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室截短表達(dá)純化［6］。BSA購自Roche公司；氯金酸購自Sigma公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維膜、吸水紙、PVC板均購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；一次性無菌濾器（Millipore產(chǎn)品）；磁力攪拌器購自金壇市醫(yī)療儀器廠；膠體金點樣系統(tǒng)（噴涂機）購自Bio Dot 公司；豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體試劑盒購自瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司（批準(zhǔn)文號：獸藥生字（2010）030388095）。檸檬酸鈉、氯化鈉、碳酸鉀均為常規(guī)分析純試劑。

1.2 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，步驟參照課題組發(fā)表文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。

1.3 膠體金標(biāo)記抗原標(biāo)記量和標(biāo)記pH值的選擇

取25支潔凈小試管，各加入1 mL膠體金，按表1所示正交表，用0.2M K2CO3調(diào)節(jié)pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0后，加入不同濃度純化后的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白50 μL，使其終濃度分別為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、12.5 μg/mL、15 μg/mL，混勻后室溫靜置反應(yīng)15 min，然后向各管中加入100 μL 10%NaCl溶液，觀察顏色變化，從而確定最佳的抗原標(biāo)記量和標(biāo)記pH值。

1.4 金標(biāo)抗原的封閉和純化

在確定最佳抗原標(biāo)記量和標(biāo)記PH值的金標(biāo)溶液中加入兔IgG，使其終濃度為1 mg/mL，然后加入1/10體積的10%BSA溶液（終濃度1%）封閉，混勻并靜置15 min，于4℃，8 000 rpm離心20 min，離心完全，上清清澈，棄上清后用原體積1/20且含有10%蔗糖的0.1M Tris-HCl（pH值8.5）儲存液重新懸浮沉淀。

1.5 樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊與NC膜的預(yù)處理

將金標(biāo)結(jié)合墊用Tween-20，樣品墊、NC膜預(yù)用封閉液37℃浸泡處理30 min，然后用PBS溶液洗三次，37℃干燥備用。

1.6 噴膜

金標(biāo)結(jié)合墊用噴膜儀將膠體金復(fù)合物以5 μL/cm的噴涂量噴金，干燥備用。將純化后的豬圓環(huán)病毒Cap蛋白和羊抗兔IgG稀釋到1mg/mL，按1μL /cm的量分別噴至NC膜的檢測線（T-線）和對照線（C-線）上，37℃干燥備用。

1.7 免疫膠體金試紙條的簡易組裝

將處理好的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜和吸水墊以相應(yīng)順序粘貼在預(yù)先裁好的PVC膠板上：即結(jié)合墊疊加在NC膜上端，樣品墊邊緣附著在結(jié)合墊上，吸水墊邊緣疊加在NC膜下端，彼此銜接緊密，裁剪制作試紙條，寬度為6 mm，組裝膠體金檢測卡備用。

1.8 特異性試驗

分別取豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）陽性血清、豬偽狂犬病毒（PRV）陽性血清、豬流感病毒（SIV）陽性血清、乙腦病毒（JEV）陽性血清、豬細(xì)小病毒（PPV）陽性血清和豬口蹄疫病毒（FMDV）陽性血清滴加于已初步制備成的膠體金試紙條樣品墊上，5～10 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.9 靈敏度試驗

將豬圓環(huán)病毒2型陽性血清分別做2倍、4倍、6倍、8倍、10倍稀釋，將組裝好的免疫膠體金診斷試紙條平放在桌面上，向樣品墊上滴加已稀釋好的陽性血清樣品，靜置5～10 min后觀察結(jié)果。

1.10 臨床樣品檢測

共對臨床送檢的100份注射過PCV2滅活疫苗的血清樣品分別用瑞普公司ELISA試劑盒和膠體金試紙條方法進(jìn)行檢測，對比兩種方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的選擇

選用膠體金顆粒直徑約為40 nm的膠體金，用紫外分光光度計測制備的膠體金在520 nm和535 nm處的吸光度值分別為0.94和0.89。

2.2 膠體金標(biāo)記抗原標(biāo)記量和標(biāo)記pH值的確定

正交表的顏色變化如表1所示。

表1 不同PH值和抗原量標(biāo)記膠體金時顏色變化情況

上述實驗結(jié)果說明，飽和標(biāo)記量為10 μg/mL，在標(biāo)記pH為8.0條件下，金標(biāo)抗原復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定。

2.3 免疫膠體金試紙條的簡易組裝

將處理好的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜和吸水墊按照相應(yīng)順序粘貼在PVC膠板上，彼此連接緊密，組裝膠體金檢測卡，成品如圖1所示。將組裝好的試紙條用實驗室保存的PCV2陽性血清進(jìn)行檢測驗證，在T-線和C-線都出現(xiàn)特異性紅棕色條帶，檢測結(jié)果為陽性（圖2）。

圖1 實驗室初步組裝的膠體金檢測試紙條

圖2 不同PCV2陽性血清的檢測卡檢測結(jié)果

2.4 特異性結(jié)果

分別取PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、SIV、JEV、PPV和FMDV陽性血清滴加于已初步制備成的膠體金試紙條樣品墊上，5～10 min內(nèi)觀察結(jié)果。發(fā)現(xiàn)除了豬圓環(huán)病毒2型陽性血清試紙條的T-線和C-線出現(xiàn)兩條特異性紅棕色條帶外，其余均只有C-線出現(xiàn)一條紅棕色條帶（圖3），表明制備的膠體金試紙條有著很好的特異性。

圖3 組裝檢測卡特異性試驗檢測結(jié)果

2.5 靈敏度試驗結(jié)果

將組裝好的免疫膠體金診斷試紙條平放在桌面上，向樣品墊上滴加80 μL已稀釋好的PCV2陽性血清樣品B3和G5，結(jié)果顯示，將陽性血清稀釋10倍后此膠體金試紙條仍然能夠檢測出。

圖4 組裝檢測卡靈敏性試驗檢測結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

分別用ELISA和膠體金試紙條方法對臨床送檢的100份樣品進(jìn)行檢測對比，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠體金試紙條檢測陽性數(shù)為89份，ELISA檢測陽性數(shù)為93份，兩種方法符合率在95%以上。雖然應(yīng)用膠體金試紙條方法檢測陽性率較ELISA方法略低，但是ELISA檢測方法需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，而且操作程序復(fù)雜、檢測時間長，難以在基層推廣應(yīng)用。膠體金試紙條作為一種快速、簡便的檢測方法，無需專門人員培訓(xùn)，非常適合于基層推廣應(yīng)用。

3 討論

目前我國大部分豬群中存在PCV2感染，同時PCV2常與多種病原混合感染豬，造成形式多樣、病理復(fù)雜的臨床癥狀。隨著感染的病原不同，死亡率也有很大差異［7］。常規(guī)的抗原抗體檢測方法主要是PCR和ELISA方法。這些方法在臨床應(yīng)用時有很大的局限性，而且隨著商品化疫苗的使用，如何對疫苗效果進(jìn)行快速檢測評價成為廣大養(yǎng)殖戶面臨的重要問題。因此，簡便、快速、靈敏的圓環(huán)病毒抗體檢測方法具有良好的應(yīng)用前景。

膠體金免疫層析技術(shù)作為一種將膠體金標(biāo)記、免疫檢測和層析分析技術(shù)等多種方法有機結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)，具有操作簡便、敏感、耗時短等優(yōu)點［8］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于激素或多種疾病相關(guān)蛋白檢測、疫病病原抗原抗體檢測、藥物濃度檢測、食品和環(huán)境中相關(guān)物質(zhì)檢測等多個方面［9］，在實際臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

本課題組曾經(jīng)建立過檢測圓環(huán)病毒抗體的葡萄球菌蛋白A（SPA）膠體金免疫層析方法［7］，其具有良好的靈敏性，但是SPA具有和人及多種動物（豬、兔、犬、小鼠、豚鼠）的IgG Fc片段結(jié)合的能力，使得建立的檢測方法在特異性方面具有一定的局限性。本研究應(yīng)用實驗室純化的PCV2 Cap蛋白抗原和成熟的膠體金標(biāo)記技術(shù)建立了快速、簡便檢測PCV2抗體的膠體金免疫層析方法，成功組裝試紙條。此方法與常用ELISA方法符合率在95%以上，而且此檢測卡在金標(biāo)液中使用雙抗原，可使對照線更加明顯。該方法具有較好的靈敏度和特異性，操作簡便，可廣泛應(yīng)用于基層。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Development and Application of Gold Immuno-chromatographic Assay for PCV2 Antibody Detection

Shi Jianli1，Xu Shengnan1，Peng Zhe1，Zhang Lingling2，Xu Shaojian1，Zheng Shuxuan2，Wu Xiaoyan1，Yu Jiang1，Sun Wenbo1，Du Yijun1，Wu Jiaqiang1，Li Jun1
（1.Research Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Science，Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100；2.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract ：To detect specifi c antibodies of porcine circovirus type 2（PCV2）with gold immuno-chromatographic assay，purifi ed PCV2 capid protein and rabbit IgG were labeled with colloidal gold prepared with the tri-sodium citrate reduction method，meanwhile capid protein and goat anti-rabbit IgG were striped in the test line position and quality control line position respectively.The results indicated that the assembled test card reacted exclusively with PCV2 positive sera and the test sensitivity was up-to 10 fold dilutions.The coincidence rate of this test card with commercial ELISA kid was up to 95%.The method was rapid，specifi c and simple in operation，and it could be extended at grass-roots.

Key words：porcine circovirus type 2 antibodies；colloidal gold immuno-chromatography；rapid diagnosis

中圖分類號：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）02-0073-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201889）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制崗位（SDAIT-06-021-07）；山東省科技發(fā)展計劃（2014GNC111011）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項目（2014QNM40）

通訊作者：李 俊