任 璐，周曉翠，范偉興，武 瑞（.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 6334；.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 6603）

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牛布魯氏菌四種血清學檢測方法的比較

任 璐1，周曉翠2，范偉興2，武 瑞1
（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163314；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

摘 要：［目的］為在布魯氏菌病臨床檢疫中選擇可靠的血清學檢測方法提供參考。［方法］對采集的294份牛血清樣品用虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和補體結合試驗（CFT）進行布魯氏菌病抗體檢測，比較RBT與ELISA，SAT與CFT的符合率及Kappa值，以CFT作為判定標準，比較四種檢測方法的敏感性和特異性。［結果］ RBT與ELISA、SAT與CFT檢測方法的符合率高達到95%以上，且Kappa值均大于0.75。以CFT作為判定標準，RBT和ELISA的敏感性較好，但有假陽性；SAT的特異性較好，但有假陰性。綜合比較認為ELISA的敏感性和特異性都比較理想。［結論］臨床工作中使用RBT或ELISA對布魯氏菌病進行初篩，用CFT進行復核確診，通過兩種或兩種以上的血清學檢測方法聯(lián)合診斷，結果較為理想。關鍵詞：牛布魯氏菌?。籖BT；SAT；ELISA；CFT，比較

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是由布魯氏桿菌引起的一種可威脅公共衛(wèi)生和食品安全的嚴重人獸共患病，是國際貿易檢疫中必檢的一種傳染病。布魯氏菌可感染人類及多種家畜和野生動物，引起相似的臨床癥狀與病理損傷，如發(fā)熱、流產與不育、慢性關節(jié)炎及神經損害等，嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產［1］。選擇可靠的布病診斷方法是防治布病的基礎。目前用于布病診斷的常規(guī)技術有病原分離和血清學診斷。作為布病診斷“金標準”的病原分離技術存在采樣困難、培養(yǎng)條件苛刻、易造成實驗人員感染等缺點。因此，在現階段的大規(guī)模檢疫檢測中，血清學仍是最常用的布病診斷技術。本文采用RBT、SAT、ELISA和CFT四種常規(guī)血清學技術對294份牛血清進行了布病檢測，并對檢測結果進行了對比分析，以便為當前布病血清學診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

采自某地的未免疫牛血清樣本294份，冷凍保存。

1.2 試劑

布魯氏菌虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、補體結合抗原，布魯氏菌ELISA試劑盒，購自法國IDEXX公司；補體、溶血素，購自鄭州百基生物技術有限公司；標準陽性血清和標準陰性血清，購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 主要儀器

酶標儀、超純水純化系統(tǒng)、電熱恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、離心機、移液槍等。

1.4 試驗方法

1.4.1 虎紅平板凝集試驗。參照動物布魯氏菌病診斷技術（GB/T18646-2002）和法國的世界動物衛(wèi)生組織（OIE）布病參考實驗室培訓要求進行操作與結果判定［2］：即試驗前將抗原、待檢血清樣品及陰陽性對照平衡至室溫（22±4）℃后，取25 μL待檢血清，滴于潔凈的玻璃板，然后取等體積虎紅平板凝集抗原與血清充分混勻，室溫作用4 min，判定結果。白色背景，自然光下觀察，出現肉眼可見的凝集現象者判為陽性，完全不凝集者為陰性。每次檢測只做8份血清樣品，同時做陰陽性對照。

1.4.2 試管凝集試驗和補體結合試驗。參照法國OIE布病參考實驗室培訓要求進行操作與結果判定［2］。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗。嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書進行操作與結果判定。

1.5 Kappa值的計算

Kappa值是醫(yī)學上常用的一種用于測評計數資料一致性的方法，是評價一致性的測量值，是一致性的統(tǒng)計指標，能夠反映出測量方法的相關程度。一般認為，Kappa值≥0.75，說明已經取得相當滿意的一致程度，若Kappa值＜0.4，則說明一致程度不夠理想［3］。

2 結果

2.1 四種血清學檢測陽性率結果

用RBT、SAT、ELISA和CFT分別對294份牛血清樣品進行布病抗體檢測。根據《布氏桿菌病防治技術規(guī)范》要求，對RBT檢測為陽性和可疑的血清樣品，再進行SAT檢測；結果為陰性的，則間隔30～45天對這部分牛進行重新采樣檢測，轉陽性的則按照陽性統(tǒng)計，如果仍為陰性，則按照陰性統(tǒng)計。四種檢測方法中SAT檢測出的陽性樣品最多，陽性檢出率為31.29%；ELISA次之，陽性檢出率為29.93%；SAT檢測出的陽性樣品數最少，陽性檢出率為19.73%。四種檢測方法檢出的陽性數和陽性率結果見表1。

表1 四種檢測方法的陽性數和陽性率

2.2 RBT與ELISA檢測結果比較

用RBT和ELISA同時檢測294份牛血清樣品，通過RBT檢測陽性數為92份、陰性為202份。對RBT檢測為陽性的92樣品通過ELISA檢測，結果84份為陽性、8份為陰性；但RBT檢測為陰性的，ELISA檢測有4份為陽性，兩種檢測方法的符合率為95.97%，Kappa值為0.91。結果見表2。

表2 RBT與ELISA檢測結果

2.3 SAT與CFT檢測結果比較

對294份牛血清樣品，通過SAT檢測，結果陽性數為58份、陰性為236份。對SAT檢測為陽性的58份樣品通過CFT檢測，結果全部為陽性；對SAT檢測為陰性的236份樣品，通過CFT檢測，結果有陽性12份、陰性224份。兩種檢測方法的符合率為95.92%，Kappa值為0.88。結果見表3。

表3 SAT與CFT檢測結果

2.4 四種檢測方法相關性比較

在OIE參考手冊中，CFT為牛布病國際貿易指定試驗和血清學的確診試驗。本試驗中以CFT檢測結果作為判定標準，比較四種檢測方法的相關性。70頭CFT檢測為陽性的牛，用RBT和ELISA也全部檢出，二者的敏感性都為100%；用SAT檢出58頭，其敏感性為82.86%（58/70）。224頭CFT檢測陰性牛中，用RBT檢出陰性202份，特異性為90.18%（202/224）；用SAT全部檢出，特異性為100%；用ELISA檢出206份，特異性為91.96%（206/224）。在本試驗中，以CFT作為判定標準，RBT和ELISA都有一定的假陽性率，SAT有一定的假陰性率［3］。RBT的假陽性率為9.82% （22/224），ELISA的假陽性率為8.04%（18/224），SAT的假陰性率為17.14%（12/70）。結果見表4。

表4 四種檢測方法相關性比較

3 討論

本試驗采用OIE布病參考實驗室培訓的RBT、SAT、ELISA和CFT血清學方法對492份牛血清樣品進行檢測，與我國現有國標《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2002）相比，差異較大。SAT和CFT的血清稀釋度不同，判定標準不同。通過對四種血清學檢測方法的比較，發(fā)現無論是用于初篩的RBT和ELISA，還是用于復核試驗的SAT和CFT，二者一致率都達到95%以上，Kappa值均大于0.75，說明已達到了相當滿意的程度［4］。但與CFT檢測結果相比，SAT、RBT和 ELISA都有一定的假陰性和假陽性。假陰性的存在，表明在檢測過程有漏檢的陽性畜，有引起疾病的蔓延的風險，不利于布病的凈化；假陽性的存在，會造成對陰性畜的錯判和誤殺，從而造成不必要的經濟損失。

目前布病血清學診斷方法種類較多，但還沒有任何一種方法無論在敏感性、特異性還是在操作簡便、易行、快速等方面都完美無缺。RBT操作簡便并且用時短，敏感性高，但特異性低，只能作為初篩試驗，環(huán)境和人為主觀因素對結果影響較大；SAT檢測的主要是IgM抗體，其容易受到動物體內其它交叉反應細菌產生的IgM抗體的干擾，導致其敏感性和特異性不高。在我國現行國標中，SAT仍作為確診試驗，但由于其敏感性和特異性較低，對牛布病的檢測結果并不令人滿意，OIE在國際貿易中己放棄使用該方法。但一些歐盟成員國一直要求，在國際貿易中用 SAT 檢測個體動物，反應不得超過 30 IU［5］；ELISA是OIE標準中規(guī)定的國際貿易中布病檢測指定試驗方法，其具有高敏感性、高通量特點；CFT比SAT特異性強，也有標準化體系，但試驗操作復雜，需有良好的實驗設施和訓練有素的人員做準確地滴定和試劑維護，這是世界公認的確診方法。

在臨床應用中，常需兩種或兩種以上的方法相互配合使用。要在國家或地區(qū)水平上控制布病，必須用快速而簡單的試驗進行普查，對檢出的陽性反應樣品要用更為特異的試驗重檢，予以確證。RBT 和ELISA都適用于布病普查。RBT檢測成本較小，建議用于流行率較高、檢測數量較大地區(qū)的布病初篩；ELISA的檢測成本較高，但敏感性好于RBT，建議用于流行率較低、檢測量較小地區(qū)的布病初步篩選；SAT是國標中法定的布病診斷方法，但此法過程較為繁瑣，操作繁雜、費時，不適于現場應用和大批量樣品的檢測。

應強調的是，血清學檢測方法雖然較多，但沒有任何一種血清學試驗適合于所有個體或群體的流行病學調查，特別是對個體進行篩查

時，所有的方法都有局限性，血清學檢測方法的敏感性和特異性會因試驗樣本量的不同而有所不同［6-7］。本文采用的是以CFT 檢測結果為陽性判定標準，因此在本試驗中可能會存在假陽性的情況。

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［7］ Nielsen K，Smith P，Yu W，et al.Serological discrimination by indirect enzyme immunoassay between the antibody response to Brucella sp.and Yersinia enterocolitica O∶9 in cattle and pigs［J］.Vet.Immunol.Immunopathol，2006，109：69-78.

（責任編輯：朱迪國）

Comparison of 4 Serological Tests for Bovine Brucellosis Detection

Ren Lu1，Zhou Xiaocui2，Fan Weixing2，Wu Rui1
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163314；2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：In order to provide a reference for choosing an appropriate serological test method for bovine brucellosis in clinical detection，4 serological tests for bovine brucellosis detection were compared and analyzed.294 bovine serum samples were tested by Rose Bengal Plate Agglutination Test （RBT），Serum Agglutination Test（SAT），Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）and Complement Fixation Test（CFT），respectively.The coincidence rate and Kappa were compared between RBT and ELISA，SAT and CFT，respectively.The sensitivity and specifi city of the 4 tests were compared using CFT as a standard.The coincidence rate of RBT and ELISA，SAT and CFT was over 95% as well as the Kappa values ＞ 0.75.Taking CFT as a standard，the sensitivity of RBT and ELISA was better，but it exised a certain false positive.The specifi city of SAT was better，but it existed a certain false negative.ELISA had better sensitivity and specifi city than RBT and SAT.RBT and ELISA were suitable for screening，and CFT was suitable for defi nite diagnosing in clinical detection.It was better to choose more than two tests for diagnosis of bovine brucellosis.

Key words：bovine brucellosis；RBT；SAT；ELISA；comparison

中圖分類號：S852.5

文獻標識碼：A

文章編號：1005-944X（2016）03-0074-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.025

通訊作者：武 瑞