苗浩，龐沖，左彥珍，于海榮

(承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

小檗堿聯(lián)合環(huán)磷酰胺化療抗小鼠Lewis肺癌作用

苗浩，龐沖，左彥珍，于海榮Δ

(承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

目的 探討小檗堿(berberine，BBR)聯(lián)合環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞C57BL/6小鼠皮下移植瘤的作用。方法 建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌腫瘤模型，10 d后，將80只模型成功荷瘤小鼠隨機(jī)分成4組：CON組、BBR組、CTX組和BBR+CTX組，每組20只分別接受灌胃給藥，均連續(xù)給藥10 d。每4天測(cè)量一次瘤體體積，測(cè)量4周截止，并繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線，同時(shí)觀察70 d內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組小鼠生存情況，繪制生存曲線。末次給藥后，眼眶取血，用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)濃度。結(jié)果 與CON組、BBR組及CTX組相比較，BBR+CTX組對(duì)Lewis肺癌有較好的抑瘤效應(yīng)，并能顯著提高荷瘤小鼠的生存時(shí)間(P<0.05)。BBR+CTX組血清中VEGF濃度較CON組、BBR組及CTX組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 BBR聯(lián)合CTX通過(guò)降低荷瘤小鼠血清VEGF濃度，抑制腫瘤血管生成，從而產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤的作用。

小檗堿；環(huán)磷酰胺；Lewis肺癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)已成為我國(guó)城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位[1]。手術(shù)是治療肺癌的主要方法，但有其局限性，患者經(jīng)手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象仍經(jīng)常發(fā)生。所以人們迫切地尋找到一種在肺癌手術(shù)切除后抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的方法。與傳統(tǒng)化療即大劑量沖擊療法相比，抗血管生成化療(antiangiogenic chemotherapy，ACT)[2]，即小劑量、短間隙、持續(xù)化療不僅能明顯提高化療藥物的藥效，而且還能明顯緩解傳統(tǒng)化療所引起的毒副作用[3]。

小檗堿(berberine, BBR)又名黃連素，異喹啉類生物堿，是中藥黃連中的主要生物堿。近年來(lái)由于其廣泛的生物學(xué)效應(yīng)而受眾多研究者的青睞，已有治療腹瀉、高血壓、糖尿病、腫瘤等多方面的臨床應(yīng)用[4]。Jie等[5]探討了小檗堿對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2血管生成的作用。結(jié)果顯示，小檗堿具有下調(diào)VEGF mRNA表達(dá)和抑制血管生成的作用，是一種腫瘤血管生成抑制劑。本實(shí)驗(yàn)擬將小檗堿與臨床上常用的腫瘤血管生成抑制類藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)聯(lián)合使用對(duì)抗Lewis肺癌小鼠腫瘤，一方面，考察聯(lián)用小檗堿是否可以降低環(huán)磷酰胺的用量，減輕其所帶來(lái)的不良反應(yīng)，另一方面，考察聯(lián)用小檗堿對(duì)環(huán)磷酰胺抗腫瘤效果是否存在協(xié)同增效的作用，為低毒高效的抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，具有較大的研究意義和開(kāi)發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)用C57BL/6雌性健康小鼠80只：6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2007-0009。飼養(yǎng)觀察室溫度23 ℃～27 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，消毒級(jí)飼料購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 細(xì)胞株：小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(上海酶研生物科技有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑：環(huán)磷酰胺(CTX)每支200 mg(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20110718)；鹽酸小檗堿(上海將來(lái)生化試劑有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20150311，規(guī)格：2 g)。VEGF ELISA測(cè)定試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、胎牛血清(FBS)(HyClone公司)；0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器：TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BJ-2CD型超凈工作臺(tái)(上海博迅生物科技有限公司)；150i型恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)；B160A型水平離心機(jī)(河北白洋離心機(jī)廠)。91501型世達(dá)機(jī)械式游標(biāo)卡尺

1.2 方法

1.2.1 Lewis肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：將Lewis肺癌細(xì)胞置于RPMIl640中，于37 ℃，5%CO2條件中培養(yǎng)并傳代，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、PBS洗滌后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至107個(gè)/mL以供注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立[6]：取120只C57BL/6小鼠，將細(xì)胞濃度為107個(gè)/mL Lewis肺癌細(xì)胞分別接種于每只小鼠右側(cè)背部皮下，接種量為0.1 mL，推藥后見(jiàn)一皮丘形成，即表明接種成功。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤實(shí)驗(yàn)[7-8]：接種后第10天，當(dāng)荷瘤小鼠腫瘤體積達(dá)到0.05～0.1 cm3后，將80只造模成功小鼠隨機(jī)分成4組：小檗堿組(BBR組)、環(huán)磷酰胺組(CTX組)、小檗堿聯(lián)合環(huán)磷酰胺組(BBR+CTX組)、對(duì)照組(CON組)，每組20只。其中BBR組給予小檗堿10 mg/(kg·d)灌胃；CTX組給予環(huán)磷酰胺30 mg/(kg·d)灌胃； BBR+CTX組給予環(huán)磷酰胺30 mg/(kg·d)+小檗堿10 mg/(kg·d)灌胃；CON組給予等體積0.9%NaCl注射液灌胃，灌胃體積約0.4 mL。所有實(shí)驗(yàn)組均每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。自第一次給藥后每4天測(cè)量一次小鼠瘤體長(zhǎng)徑和短徑(每組取5只小鼠)，測(cè)量4周截止。計(jì)算瘤體積(應(yīng)用公式：體積=0.53×短徑2×長(zhǎng)徑，cm3)，繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。同時(shí)觀察小鼠自接種開(kāi)始70 d內(nèi)的生存情況，繪制生存曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.4 血清VEGF濃度檢查[9]：末次給藥24 h后, 每組取5只小鼠經(jīng)眼眶取血約0.5 mL，置于無(wú)菌干燥管內(nèi)，室溫放置20 min，待析出血清后，1500 r/min離心20 min后取上清液置于無(wú)菌管內(nèi)，-20 ℃保存，3 d內(nèi)檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測(cè)血清中VEGF的濃度，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)曲線 在細(xì)胞接種后的第10天，各組C57BL/6小鼠均可見(jiàn)腫瘤形成，然后各組小鼠分別接受不同藥物或0.9%NaCl注射液的治療，并于給藥后的第4、8、12、16、20、24、28天測(cè)量腫瘤體積大小(每組取5只)，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(見(jiàn)表1、圖1)，從接種第14天開(kāi)始，lewis細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，小鼠腫瘤體積越來(lái)越大，與對(duì)照組相比，CTX組和BBR+CTX組腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢，在治療后的第28天，4組小鼠的腫瘤體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CTX組、BBR+CTX組小鼠的腫瘤體積顯著小于COX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.0196和0.007)；并且BBR+CTX組小鼠腫瘤體積較CTX組更小，2組差異顯著(P=0.039)。

表1 各組小鼠經(jīng)治療后不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積Tab.1 The tumor volume of different time points of mice in each group after treatment(±s)

*P<0.05，與CON組比較，compared with CON group；#P<0.05，與CTX組比較，compared with CTX group

圖1 腫瘤生長(zhǎng)曲線Fig.1 Tumor growth curve(±s)

2.2 荷瘤小鼠生存曲線 各組C57BL/6小鼠自接種后觀察70 d，統(tǒng)計(jì)生存時(shí)間，得到各組中位生存期和95%置信區(qū)間(見(jiàn)圖2、表2)。BBR組和CTX組與CON組平均生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9889、P=0.2844)。BBR+CTX組平均生存期與CON組比較顯著提高(P=0.0005)，表明CTX聯(lián)合BBR應(yīng)用可顯著提高腫瘤小鼠的生存期，達(dá)到協(xié)同抗腫瘤的作用。

圖2 小鼠的生存曲線Fig.2 Mice survival curve

組別平均生存期中位生存期95%置信區(qū)間下限上限CON組42.05±2.574137.0147.09BBR組43.60±2.314139.0748.13CTX組45.60±2.554340.6150.59BBR+CTX組55.45±2.695750.1760.73

2.3 小鼠血清中VEGF表達(dá)值 由表3可知，4組血清VEGF濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與CON組比較，BBR組血清VEGF濃度有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.269)，CTX組、BBR+CTX組血清VEGF濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、P=00048)；與CTX組比較，BBR+CTX組血清VEGF濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。

表3 小鼠血清VEGF濃度比較Tab.3 Serum VEGF concentration in mice(±s)

*P<0.05，與CON組比較，compared with CON group；#P<0.05，與CTX組比較，compared with CTX group

3 討論

肺癌患者的病死率較高，且常用化療藥環(huán)磷酰胺毒副作用較大，因此，尋找協(xié)同CTX減輕其毒性的藥物是肺癌聯(lián)合化療的重要研究方向[10-11]。為研究小檗堿能否有協(xié)同增效環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用，本課題組首先建立Lewis肺癌細(xì)胞C57BL/6小鼠移植瘤模型。各組C57BL/6J小鼠在細(xì)胞接種后10d均可觸及皮下腫瘤，移植瘤形狀多位圓形或橢圓形，包膜完整，與周邊組織分界清楚。接下來(lái)隨即將造模成功的80只荷瘤小鼠分為4組，分別接受不同方案的治療，并在第一次治療后第4、8、12、16、20、24、28 d對(duì)移植瘤體積進(jìn)行在體測(cè)量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。同時(shí)自接種開(kāi)始70 d內(nèi)觀察小鼠生存情況，繪制小鼠生存曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組和單用組相比較，BBR聯(lián)合CTX對(duì)Lewis肺癌有更好的抑瘤效應(yīng)，并能顯著提高荷瘤小鼠的生存時(shí)間。說(shuō)明2藥合用產(chǎn)生協(xié)同增效的作用。

腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展離不開(kāi)腫瘤血管生成，抑制血管生成能有效地控制腫瘤的進(jìn)展，已經(jīng)逐漸成為一種腫瘤靶向治療的手段[12]。腫瘤血管生成的過(guò)程受到多種血管生成激活因子和血管抑制因子的調(diào)控，促進(jìn)血管生成因子與抑制血管生成因子失衡，是促進(jìn)腫瘤新生血管發(fā)生與腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[13]。其中，VEGF作為一種關(guān)鍵的、功能強(qiáng)大的腫瘤血管生成刺激因子發(fā)揮著中樞性的調(diào)控作用，參與多種生物學(xué)效應(yīng)，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。因此本研究應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)荷瘤小鼠血清VEGF濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠血清VEGF濃度均有不同程度降低，且BBR+CTX組更為明顯(P<0.05)。因此，推測(cè)BBR聯(lián)合CTX可能通過(guò)降低荷瘤小鼠血清VEGF濃度，抑制腫瘤血管生成，從而提高CTX對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用。本課題組下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將對(duì)聯(lián)合效應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行深入探索，為小檗堿協(xié)同化療藥物治療腫瘤提供更可靠的依據(jù)。

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(編校：王儼儼)

Inhibit of berberine combined with cyclophosphamide on Lewis pulmonary carcinoma in mice

MIAO Hao, PANG Chong, ZUO Yan-zhen, YU Hai-rongΔ

(College of Basic Medicine, Chengde Medical University, Chengde 067000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of berberine (BBR) combined with cyclophosphamide (CTX) on the growth of Lewis pulmonary carcinoma in the C57BL/6 mice.MethodsThe subcutaneous transplanted tumor model of Lewis cell in C57BL/6 mice was established.After 10 days, the 80 mice models were randomly divided into four groups (n=20).CON group, BBR group, CTX group and BBR+CTX group that

intragastric administration therapy respectively lasting for 10 days.The tumor sizeinvivowas measured every 4 days lasting for 4 weeks and the growth curve of transplanted tumor was drawed.Meanwhile, the survival of mice within 70 days was observed, then drawing survival curve.After the last administration, took 5 mice from each group for drawing blood, then serum VEGF concentration of mice was detected by ELISA.ResultsCompared with CON, BBR or CTX group, the BBR+CTX group showed better antitumor effect, and increased the survival time of model mice significantly (P<0.05).The serum VEGF concentration in BBR+CTX group decreased significantly than CON, BBR and CTX group (P<0.05).ConclusionBBR combined with CTX could significantly inhibit the growth of Lewis cell tumor in C57BL/6 mice through reducing the serum VEGF concentration.

berberine; cyclophosphamide; Lewis lung cancer; vascular endothelial growth factor (VEGF)

河北省教育青年基金(2014036)；承德醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)項(xiàng)目(201510)

苗浩，男，碩士，助教，研究方向：中藥藥理研究，E-mail: miaohao_1986@126.com；于海榮，通信作者，女，碩士，副教授，研究方向：中藥藥理研究，E-mail: 2821978755@qq.com。

R322.35

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.10