袁玲，董福祿，季，陸錦標(biāo)，陳苗苗，季菊玲，王愛婷，鄂群,Δ

(1.江蘇省靖江人民醫(yī)院 內(nèi)科，江蘇 靖江 214500；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室，江蘇 南通 226001；3.江蘇省靖江人民醫(yī)院 普外科，江蘇 靖江 214500；4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系，江蘇 南通 226001)

自制組織微陣列儀及其在肝癌分子病理研究中的應(yīng)用

袁玲1，董福祿2，季3，陸錦標(biāo)4，陳苗苗2，季菊玲4，王愛婷2，鄂群2,4Δ

(1.江蘇省靖江人民醫(yī)院 內(nèi)科，江蘇 靖江 214500；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室，江蘇 南通 226001；3.江蘇省靖江人民醫(yī)院 普外科，江蘇 靖江 214500；4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系，江蘇 南通 226001)

目的 自主研發(fā)制備一種新型的結(jié)構(gòu)合理、使用方便的石蠟組織微陣列手動裝置，以解決現(xiàn)有的石蠟組織芯片工具由于結(jié)構(gòu)、組合等原因在實驗、研究工作中存在使用不便等問題。方法 自主研發(fā)制備石蠟組織微陣列手動裝置，并利用此裝置將62例肝癌組織及匹配的癌旁組織標(biāo)本制備組織芯片，并對其進(jìn)行HE染色及AFP、CD34、Ki67和HIF alpha等蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)實驗，分析肝癌組織及癌旁組織的表達(dá)差異性。結(jié)果 對自制組織芯片進(jìn)行多種蛋白的免疫組織化學(xué)檢測和分子病理分析結(jié)果顯示，染色清晰完整；統(tǒng)計分析顯示，Ki67和HIF alpha在肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P=0.0003，P=0.0144)，與文獻(xiàn)的報道一致。結(jié)論 本文自制組織微陣列儀具有較高的實用價值，是生物化學(xué)藥物分子機(jī)制和病理研究應(yīng)用的有效工具。

組織微陣列儀；組織芯片；肝癌；免疫組織化學(xué)

組織芯片(tissue chip，TC),又稱組織微陣列( tissue microarray, TMA)[1], 是將數(shù)十、數(shù)百個乃至上千個小的組織標(biāo)本按照一定的規(guī)律有序排列在某一個固相載體上而成，其目的是為了研究同一種基因或同一種蛋白質(zhì)分子在不同的組織或細(xì)胞中的表達(dá)狀況。具有體積小、高通量、大樣本、高效率、誤差小,可實現(xiàn)自動化和微型化及可與其他生物技術(shù)相結(jié)合的特點[2]。組織芯片是由Barrifora等[3]在1986年最早提出的；其后，Kononen等[4]于1998年在 Nature Medicine雜志發(fā)表組織芯片論文，并首次成功運用組織芯片技術(shù)研究6種基因在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，證實了該技術(shù)的實用價值，并宣告組織芯片概念的誕生。在如今的生物醫(yī)學(xué)研究中，組織芯片技術(shù)已經(jīng)在癌癥研究中廣泛應(yīng)用，是生物化學(xué)藥物分子機(jī)制和病理研究應(yīng)用的有效工具[5-8]?，F(xiàn)有的石蠟組織芯片工具，由于結(jié)構(gòu)、組合等原因，在實驗、研究工作中存在使用不便等問題，為了改善這些不便之處，本實驗利用自制組織微陣列儀制作肝癌及癌旁樣本組織芯片,并對多種蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分子病理研究。

1 材料與方法

1.1 樣本 本實驗所用石蠟標(biāo)本取自2000年～2010年在江蘇省南通地區(qū)多家醫(yī)院接受肝細(xì)胞肝癌手術(shù)切除的患者62例。患者入選標(biāo)準(zhǔn)包括:①原發(fā)性肝癌并采用根治性手術(shù)切除；②病理確診為肝細(xì)胞肝癌；③術(shù)前未接受任何相關(guān)抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1 通用組織微陣列儀制備[9]:石蠟組織微陣列手動裝置包括；石蠟組織微陣列定位版和實驗支架；芯棒；取樣針；熔合板；多功能框和芯片種植平面檢測板。石蠟組織微陣列定位板與實驗支架活動式安裝匹配，上述部件放置于一個盒體中，所述實驗支架為C型軌道型金屬件。

石蠟組織微陣列定位版周邊標(biāo)記有自然數(shù)字及相對應(yīng)的英文字母，用作對呈正三角形陣列和正方形陣列排列孔陣列中的孔進(jìn)行二維定位；石蠟組織微陣列定位版的另一面標(biāo)有“石蠟組織微陣列定位板”等字樣。版的兩側(cè)中央有U 型凹槽，是實驗支架的嵌入固定部位；一側(cè)版面的四角有缺口式入槽口。

芯棒為粗段短而細(xì)段長的形式，粗段與細(xì)段的長度比例為1:5～1:6，細(xì)段不銹鋼圓柱體Φ <石蠟組織微陣列定位版上的孔徑；粗段不銹鋼圓柱體長約為4～6 mm，其Φ >石蠟組織微陣列定位版上的孔徑；芯棒的細(xì)段插入石蠟組織微陣列定位版上的孔，組成芯棒陣列(芯棒的細(xì)段和粗段)；芯棒一體兩端的圓柱體段均可為鑄造受體石蠟芯片芯穴的部位。另設(shè)有多功能框及與其匹配在恒溫室進(jìn)行熔合操作的熔合板。

取樣針為兩用雙鉆頭取樣針：為一根有銅套的不銹鋼毛細(xì)管，其兩端管口呈圓周鋸齒狀或刀刃樣銳口，可用于對石蠟組織塊和人體或動物組織的固定標(biāo)本進(jìn)行取樣；管口呈齒形相似大小一致的圓周鋸齒口，有4～7個鋸齒狀凸；或銳利刀刃樣的管口；是鉆取石蠟組織和人體或動物等生物組織樣品的關(guān)鍵部位；取樣針不銹鋼毛細(xì)管體外有固定聯(lián)體的銅套管，其表面有波浪樣凸凹紋理，是旋轉(zhuǎn)取樣針進(jìn)行取樣的手持工作面；銅套管表面一端有間隙疏密有致的粗細(xì)淺凹槽，是與取樣針柄的圓端平面Φ 標(biāo)識有相同意義的特定標(biāo)識。讀數(shù)從銅套端第一粗凹起；有細(xì)凹槽時，讀數(shù)以細(xì)凹槽為準(zhǔn)，精確到0.1 mm；無細(xì)凹槽時，則以粗凹槽為準(zhǔn)，讀數(shù)精確到1 mm。粗凹槽間距10 mm，粗凹數(shù)量代表毫米數(shù)量單位；細(xì)凹位于兩粗凹間，代表0.1毫米數(shù)量單位，其位于兩粗凹間的位置代表0.1毫米倍數(shù)的讀數(shù)精確單位。如；粗凹槽(僅有)2條時，讀數(shù)為Φ=2 mm；共有3條粗凹槽標(biāo)識時，并有細(xì)凹槽位于第二與第三條粗凹槽的(中央)1/2處，此時讀數(shù)Φ=2.5 mm；取樣針芯桿匹配于取樣針管內(nèi)，為用于輔助取樣針管推出供體樣本石蠟芯的不銹鋼圓柱體。一端為針尖，是推出樣本石蠟芯的部位。另一端為銅柄，銅柄端的圓平面有Φ和數(shù)字標(biāo)識(與銅套管表面的凹槽代表的Φ讀數(shù)相同)；從針芯尖起與不銹鋼取樣針管等長的針芯桿表面位置起始(向針尖方)，有10條窄凹痕，間隔/窄凹痕=1 mm，為取樣時取樣深度的度量標(biāo)識；在針芯桿銅柄端與針芯桿的連接口嵌有嵌有環(huán)形的橡膠樣墊圈，其Φ ≥取樣針管口，起保護(hù)取樣針管口的作用。

熔合板，為一塊薄的金屬材料板，承置安放多功能框，是石蠟組織微陣列芯片坯在恒溫臺或恒溫室進(jìn)行熔合操作的中介平臺。

多功能框，為一呈距形的無底不銹鋼金屬框，框分成上口部與下口部，上口部內(nèi)側(cè)的四周邊有與通用型組織包埋盒吻合的直角凹，是支架安置通用型組織包埋盒的接口和進(jìn)行石蠟組織微陣列芯片包埋的區(qū)域；下口部的四周壁呈斜坡梯形，其底口與熔合板和檢測板接合匹配使用，是執(zhí)行石蠟組織微陣列芯片空穴坯的鑄模、芯片的種植、芯片切片面的觀測校正和芯片熔合的區(qū)域。

芯片種植平面檢測板，是一種透明非金屬材料板，襯托于多功能框下口部匹配使用時，可檢測芯片種植質(zhì)量，即；所有已種植的芯片是否到達(dá)同一平面(亦稱切片平面)。

1.2.2 通用組織微陣列儀制備組織芯片流程:通用組織微陣列儀制備組織芯片流程見圖1。

圖1 通用組織微陣列儀制備組織芯片流程Fig.1 Process of general tissue microarray instrument for preparing tissue microarray

制備空穴微陣列模塊：①將微組織陣列定位版插入實驗支架；②在定位版表面敷設(shè)薄紙，按預(yù)設(shè)陣列插入芯棒；③加熱芯棒陣列(用芯片儀熔合包埋組合件的暖風(fēng)機(jī))；④用鑄?？蚩蜃⌒景絷嚵校虎輰⑿景絷嚵兄糜谑灲M織芯片制備機(jī)流蠟咀下灌注石蠟；⑥待石蠟冷凝后，去除浮蠟并退出芯棒；⑦充分冷卻后退出空穴微陣列模塊，修整后待用。

取樣與種植：①將待用供體石蠟組織塊37 ℃～42 ℃預(yù)熱；②用取樣針鉆取樣品；并種植于微陣列模塊空穴(23 ℃～4 ℃，可在冷凍臺上進(jìn)行)；③將種植完畢的芯片模塊移置到透明檢測板上待修整。

檢查及調(diào)整空穴中芯片陣列(芯片熔合前處理)：①透過檢測板觀察并調(diào)整芯片至同一水平面(可提高得片率)；②將芯片模塊移置到芯片熔合板上，再平放到芯片熔合室中進(jìn)行芯片熔合。

芯片熔合與包埋(涉及芯片儀熔合包埋組合件熔合室冷凍臺和流蠟包埋功能)：①(30 min左右)密切觀察至芯穴中蠟芯溶融而芯穴/管壁不溶(為最佳)時中止熔合；②小心平穩(wěn)取出微陣列芯片模塊待石蠟冷凝；③待芯穴中蠟芯完全凝固后，即加蓋包埋盒并快速灌注包埋石蠟；④移出充分冷卻后，即退出石蠟組織芯片塊并修整待用。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色步驟:石蠟切片脫蠟,酒精梯度水化；用PBS沖洗3次，每次3 min；pH6.0檸檬酸緩沖液熱修復(fù)10～15 min；3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，滴加第一抗體(AFP，兔多克隆抗體，1:100倍稀釋；CD43，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋；HIF-1，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋；KI67，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋)，室溫下孵育60 min后4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 uL酶標(biāo)廣譜第二抗體，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB溶液(酶底物顯色劑)，顯微鏡下觀察；自來水沖洗，蒸餾水洗后蘇木素復(fù)染；自來水沖洗，0.3%鹽酸酒精分化；自來水沖洗返藍(lán)；切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 結(jié)果判定:根據(jù)空白、陽性和陰性對照的顯色情況，在確定無假陽性和假陰性的前提下，以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿染成棕黃及棕褐色為陽性。將按照其染色強(qiáng)度判為：無著色(0分)，淺黃(1分)，棕黃(2分)及棕褐色(3分)；按照陽性信號比例判為：陰性(0分)，1%～24%(1分)，25%～49%(2分)，50%～74%(3分) 75%～100%(4分)。總體評分值為染色強(qiáng)度×陽性信號比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌手術(shù)標(biāo)本組織芯片制備質(zhì)量和普通HE染色病理分型 本次實驗共成功制備肝癌組織芯片1枚，其中包含62例肝癌組織及其癌旁組織和2列正常肝臟組織標(biāo)本。組織芯片經(jīng)過切片后仍然排列整齊，層次分明，厚薄均勻，對比明顯，未出現(xiàn)漂移，且芯片具有較好的完整性,見圖2。

圖2 肝癌組織芯片HE染色Fig.2 HE staining for hepatocellular carcinoma tissue microarray

2.2 肝癌手術(shù)標(biāo)本組織芯片免疫組化染色 利用構(gòu)建的組織芯片,首先檢測了 AFP和CD34兩種蛋白在肝癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況。鏡下對2種蛋白染色觀察可見，陽性信號清晰可辨，染色定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，且AFP和CD34在肝癌的腫瘤組織中均有廣泛表達(dá),見圖3?？梢姡ㄟ^自制組織微陣列儀制作的組織芯片可以高通量得到完整清晰的免疫組織化學(xué)結(jié)果。

圖3 肝癌組織芯片AFP和CD34免疫組化染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of AFP and CD34 in tissue microarray of hepatocellular carcinoma

2.3 肝癌手術(shù)標(biāo)本組織芯片免疫組化染色結(jié)果分析 利用自主制備的肝癌組織芯片，對細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和細(xì)胞缺氧指標(biāo)HIF alpha進(jìn)行了免疫組化檢測，并且對62例實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和細(xì)胞缺氧指標(biāo)HIF alpha在肝癌組織中的表達(dá)都顯著高于癌旁組織(P=0.0003，P=0.0144)，見圖4。

圖4 肝癌及癌旁組織芯片Ki67和HIF alpha免疫組織化學(xué)染色結(jié)果統(tǒng)計T: 肝癌組織, NT: 癌旁組織Fig.4 Statistical analysis of immunohistochemical staining of AFP and CD34 in tissue microarray of hepatocellular carcinoma and adjacent tissuesT: HCC tumor tissues; NT: HCC adjacent tissues

3 討論

組織芯片的原理是：將采集的幾十到上千個的圓柱形小組織樣本整齊的排放到另一個空白蠟塊中制成組織芯片蠟塊。然后對其進(jìn)行切片；再將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上而制成組織芯片。之后，用制好的組織芯片可進(jìn)行HE染色、組織化學(xué)、熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)等一系列檢測。組織芯片是將基因、蛋白表達(dá)水平檢測與組織形態(tài)學(xué)有機(jī)地結(jié)合起來，克服了傳統(tǒng)分子病理學(xué)技術(shù)和病理組織學(xué)技術(shù)操作復(fù)雜、工作效率低等缺點，可同時對幾十甚至幾百個樣品同時進(jìn)行檢測，大大提高了工作效率[10-11]?，F(xiàn)有的石蠟組織芯片工具，由于結(jié)構(gòu)、組合等原因，在實驗、研究工作中存在使用不便等問題。我們自主研發(fā)了一種石蠟組織微陣列手動裝置，包括；多功能框、石蠟組織微陣列定位板、實驗支架、芯棒、取樣針，熔合板和芯片種植平面檢測板，其中石蠟組織微陣列定位版與支架活動式安裝匹配。

為了證實自主研發(fā)石蠟組織微陣列手動裝置的有效性及準(zhǔn)確性，我們使用自制的肝癌及癌旁組織芯片對Ki67，HIFalpha，NF-κB和p65等多種蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，并對部分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。Ki67是一種在增殖細(xì)胞中表達(dá)的核蛋白，與細(xì)胞的周期密切相關(guān)，覆蓋于除G0期外的各細(xì)胞周期，其表達(dá)水平反映了腫瘤細(xì)胞的增殖狀況[12]。本實驗結(jié)果與之前報道實驗結(jié)果相似[13-14]：在肝癌組織芯片樣品中，Ki67免疫組化指數(shù)顯著高于癌旁組織芯片樣品組，說明肝癌的發(fā)生發(fā)展需要細(xì)胞的大量增殖。而腫瘤細(xì)胞的快速增殖，必然需要消耗大量的能量和氧氣，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)中，而低氧誘導(dǎo)因子HIF alpha是腫瘤在低氧環(huán)境下調(diào)控的關(guān)鍵因子，所以我們對HIF alpha的表達(dá)水平進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測。與大量研究報道一致[15-16]，本實驗結(jié)果顯示在肝癌組織芯片樣品中HIF alpha的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，說明肝癌組織需要上調(diào)HIF alpha的表達(dá)水平來適應(yīng)低氧環(huán)境。

綜上所述，本文利用自主設(shè)計的石蠟組織微陣列手動裝置成功制備肝癌及癌旁組織芯片。對自制組織芯片進(jìn)行多種蛋白的免疫組織化學(xué)檢測和分子病理分析，染色結(jié)果清晰完整，并且對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)與大量報道具有高度的一致性，說明自制組織微陣列儀具有較高的實用價值，是生物化學(xué)藥物分子機(jī)制和病理研究應(yīng)用的有效工具。

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(編校：吳茜)

Self-developed tissue microarray instrument and its application in hepatocellular carcinoma

YUAN Ling1?, DING Fu-lu2?, JI Yong3, LU Jin-biao4, CHEN Miao-miao2, JI Ju-ling4, WANG Ai-ting2, E Qun2,4Δ

(1.Department of Medicine, Jingjiang People’s Hospital, Jingjiang 214500, China; 2.Center for Basic Medical Research, Nantong University School of Medicine, Nantong 226001 China; 3.Department of Surgery, Jingjiang People’s Hospital，Jingjiang 214500, China; 4.Department of Pathology, Nantong University School of Medicine, Nantong 226001, China)

ObjectiveTo make a novel paraffin wax tissue microarray manual device with reasonable structure and handy function，and resolve the inconvenience showed in the usages of existing paraffin tissue microarray tools due to its unreasonable structure, combination and so on in the research work.MethodsA novel paraffin wax tissue microarray manual device was made, and 62 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) and adjacent tissue array was prepared, then the tissue array was stained by H&E, also AFP, CD34, Ki67 and HIF alpha by immunohistochemistry.ResultsThe HCC and adjacent tissue microarray was successfully prepared by self-developed paraffin tissue microarray device. The result of staining is very clear and convenient for molecular pathology analysis. Statistical analysis showed that Ki67 and HIF alpha expression in HCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues (P=0.0003,P=0.0144), consistent with reports.ConclusionThis self-developed tissue microarray manual device with high practical value is an effective tool for the study of the molecular mechanism of biochemical drugs and pathology.

tissue microarrays; tissue microarray instruments; Hepatocellular carcinoma; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.006

袁玲，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：病毒性肝炎，E-mail：1015726785@qq.com;董福祿，共同第一作者，男，講師，博士，研究方向：腫瘤生物學(xué)，E-mail：dongfulu@ntu.edu.cn；鄂群，通信作者，男，本科，高級實驗師，研究方向：腫瘤病理，E-mail：nestle@ntu.edu.cn。

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