黃銀云++胡新崗++郭廣富

摘要：鵝副黏病毒病由副黏病毒科禽副黏病毒Ⅰ型鵝副黏病毒感染引起，主要表現(xiàn)為消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和病變。通過臨床病例觀察該病的臨床癥狀和病理變化，利用RT-PCR方法鑒定病原，采用病理組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，鵝副黏病毒是一種泛嗜性病毒，可在鵝體內(nèi)的多種器官中復(fù)制，并造成多器官組織的損傷，從而引起患鵝消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和病變。

關(guān)鍵詞：鵝；副黏病毒；RT-PCR；鑒定；病理組織；觀察

中圖分類號(hào)： S858.335.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0302-03

鵝副黏病毒病是由副黏病毒科禽副黏病毒Ⅰ型鵝副黏病毒感染引起的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病。患鵝主要表現(xiàn)為消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和病變[1]，以腸道糠麩樣潰瘍、胰腺腫脹且表面有灰白色壞死灶、脾臟腫大并有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征[2]。鵝副黏病毒病于1997年在江蘇省發(fā)現(xiàn)，不同日齡的各品種鵝群不分季節(jié)均易感，發(fā)病率為40%～100%，死亡率達(dá)30%～100%，2周齡以內(nèi)雛鵝的發(fā)病率、死亡率均可達(dá)100%，現(xiàn)已成為嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[3]。2014年夏季，蘇北地區(qū)某肉鵝場(chǎng)飼養(yǎng)的7周齡獅頭鵝發(fā)生疑似副黏病毒病，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨診癥狀觀察、分子生物學(xué)診斷，確診為鵝副黏病毒感染，并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，為該病的正確診斷提供分子生物學(xué)及病理組織學(xué)方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料病料采自蘇北地區(qū)某肉鵝場(chǎng)，該場(chǎng)疑似感染鵝副黏病毒，病鵝的臨床癥狀及肝、脾、胰、肺、腎、腸等病理變化明顯。

1.1.2主要設(shè)備RM2235型徠卡切片機(jī)，PTC-200rev型PCR儀，DYY-7C型電泳儀，DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳槽，Mikro200R型冷凍高速離心機(jī)，JS-380A型自動(dòng)凝膠圖像分析儀，恒溫箱，微量移液器等。

1.1.3常用試劑10%福爾馬林、乙醇、石蠟、二甲苯、蘇木精、伊紅、鹽酸、樹膠等均為國(guó)產(chǎn)試劑。200 bp DNA Ladder Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Lamp MasterMix（含染料）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。Murine RNase Inhibitor、HiScriptReverse Transcriptase均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。6 nt隨機(jī)引物購自Fermentas公司。

1.1.4RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)EMBL/GenBank上已公布病毒的相關(guān)基因序列，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司采用Primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)NDV-F引物1對(duì)，目的基因片段大小為970 bp。F1：5′-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3′；F2：5′-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3′。

1.2方法

1.2.1流行病學(xué)調(diào)查通過約談鵝場(chǎng)飼養(yǎng)員和技術(shù)人員、查看養(yǎng)殖檔案、進(jìn)行群體觀察和個(gè)體檢查，了解該鵝群發(fā)病的具體情況，為鵝副黏病毒病的正確診斷提供流行病學(xué)信息。

1.2.2臨床癥狀觀察重點(diǎn)觀察病鵝消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的癥狀。觀察病鵝的運(yùn)動(dòng)姿態(tài)，有無扭頸、仰頭、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀，有無甩頭、咳嗽等呼吸癥狀。觀察糞便的狀態(tài)及顏色、眼睛有無分泌物等。

1.2.3大體病理剖檢重點(diǎn)檢查肝臟、脾臟、胰腺，特別是全部腸道、盲腸扁桃體。

1.2.4病理組織學(xué)觀察采集新鮮病死鵝的消化器官（腺胃、腸）、免疫器官（脾臟、胸腺、法氏囊）、神經(jīng)器官（腦）等；以福爾馬林溶液固定后，利用乙醇經(jīng)脫水機(jī)自控脫水、二甲苯透明、石蠟包埋；采用切片機(jī)切成片厚為4～6 μm的薄片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色（H·E染色）后鏡檢拍照。

1.2.5雙抗PBS的配制將OIE推薦的配方[4]略作調(diào)整，采用pH值為7.2的PBS溶液配制運(yùn)輸液，溶液中青霉素（penicilin）、鏈霉素（streptomycin）的劑量分別為 10 000 unit/mL、10 mg/mL。采用濃度為1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.2。

1.2.6RNA提取及cDNA轉(zhuǎn)錄將疑似副黏病毒感染的雛鵝器官病料剪碎，加入預(yù)冷雙抗的PBS研磨，反復(fù)凍融3次后以3 000 r/min離心10 min，每份吸取200 μL上清液用于病毒基因組的提取。根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取，測(cè)其含量為320 μg/μL。采用6 nt隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（于65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上驟冷并靜置2 min）。根據(jù)HiScript Reverse Transcriptase說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得病毒的cDNA（置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 45 min、85 ℃ 5 min）。

1.2.7基因片段的擴(kuò)增根據(jù)2×Lamp MasterMix（含染料）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；退火溫度為55 ℃，72 ℃下延伸時(shí)間為1.0 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1流行病學(xué)特點(diǎn)

該鵝場(chǎng)約有7周齡獅頭鵝2 100羽，至送檢時(shí)已發(fā)病 7 d，約900羽發(fā)病，發(fā)病率約為43%；病死320余羽，病死率約為36%。部分病鵝發(fā)病5～6 d后逐漸好轉(zhuǎn)，10 d左右康復(fù)。發(fā)病期間未采取隔離措施，僅以氟苯尼考等藥物治療，效果不理想。

2.2臨床癥狀

患鵝病初食欲下降、精神沉郁，糞便稀薄呈白色。隨著病情加重，稀糞呈暗紅或微黃色，直至變?yōu)樗畼狱S白色。病程中期，患鵝表現(xiàn)為厭食、飲水增加、羽毛逆亂且無光澤、站立不穩(wěn)，病情嚴(yán)重的鵝質(zhì)量明顯減輕。病程后期患鵝嚴(yán)重脫水、迅速消瘦、翅膀下垂，多數(shù)呈癱瘓狀，多排綠色糞便，直至衰竭死亡。瀕死期的患鵝體溫下降、食欲廢絕、蹲地，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。部分死亡后的鵝表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭頸扭曲或昂頭，倒提從口中流出水樣黏液。

2.3大體剖檢病變

剖檢病死鵝可見口腔有大量黏液，氣管和支氣管環(huán)充血、出血，內(nèi)有大量黏液。食道和腺胃交界處出血、潰瘍，食道黏膜附著的纖維性結(jié)痂塊呈灰白色或黃色；腺胃黏膜充血、出血、潰瘍；肌胃和腺胃交界處有出血斑點(diǎn)，肌胃角質(zhì)層下充血、出血、潰瘍。十二指腸、空腸、回腸黏膜附有特征性的黃色纖維性結(jié)痂（圖1）；直腸泄殖腔黏膜出血、潰瘍，痂塊表面附著的膿汁樣分泌物呈灰白色、淡黃色；盲腸扁桃體出血、腫大、潰瘍，部分病鵝的盲腸黏膜也有淡黃色痂塊、潰瘍?cè)?；胰腺黏膜充血、出血。部分病鵝的肝臟質(zhì)地較硬、腫大、瘀血；膽囊擴(kuò)張，充盈膽汁；脾臟瘀血、腫大，表面布滿灰白色壞死灶（圖2）；肺臟有不同程度的充血、出血；腎臟略腫大、色淡，輸尿管擴(kuò)張，充滿白色尿酸鹽；胸腺、法氏囊萎縮；大腦和小腦充血、水腫。

2.4顯微病理變化

腎小管上皮嚴(yán)重顆粒變性，部分細(xì)胞壞死崩解（圖3）。肺組織廣泛性充血、出血（圖4）。胸腺髓質(zhì)胸腺小體結(jié)構(gòu)破壞，周圍上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞、胸腺細(xì)胞數(shù)量減少（圖5）。肝細(xì)胞廣泛發(fā)生顆粒變性、渾濁腫脹（圖6）。脾紅髓部局部淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，散布大量紅細(xì)胞（圖7）。十二指腸絨毛黏膜層、固有層局部壞死脫落（圖8）?；啬c黏膜層、固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖9）。

2.5基因片段的擴(kuò)增結(jié)果

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，NDV-F的條帶大小（圖10）與預(yù)期結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

病理組織學(xué)研究顯示，鵝副黏病毒可在肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、腸道、胸腺等全身多種器官和組織中復(fù)制，并對(duì)其造成損傷，造成較為典型的顯微及大體病理變化。此外，鵝副黏病毒還能導(dǎo)致患鵝心肌纖維廣泛發(fā)生顆粒變性，并使氣管黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落、固有層充血、毛細(xì)血管瘀血[5]，使大腦和小腦充血，法氏囊萎縮?？梢?，鵝副黏病毒是一種泛嗜性病毒，其泛嗜性是導(dǎo)致鵝副黏病毒病在臨床上具有較高發(fā)病率和病死率的主要原因?；践Z臨床表現(xiàn)出的消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面的癥狀，是由相應(yīng)器官和組織發(fā)生病理變化所致，癥狀的輕重與病理變化的程度密切相關(guān)。

鵝副黏病毒病對(duì)各日齡鵝均有易感性，日齡越小則發(fā)病率和病死率越高，發(fā)病率和病死率均隨日齡的增長(zhǎng)有所下降，2周齡以內(nèi)雛鵝的發(fā)病率和病死率可達(dá)100%[6]。鵝副黏病毒對(duì)患鵝免疫系統(tǒng)的侵害比較嚴(yán)重，日齡越小的鵝其免疫系統(tǒng)發(fā)育越不成熟，自身免疫能力越低，感染后的發(fā)病率和病死率越高；日齡越大的鵝其免疫系統(tǒng)發(fā)育越成熟，免疫能力越強(qiáng)，感染后的發(fā)病率和病死率有所降低，發(fā)病后約7 d有可能逐漸痊愈康復(fù)。對(duì)小日齡鵝群加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，嚴(yán)格執(zhí)行消毒措施，處理好患鵝所污染的飼料、飲水、墊草、墊料、用具，無害化處理死鵝、內(nèi)臟、羽毛等，謹(jǐn)防該病通過消化道和呼吸道感染。

鵝副黏病毒屬于禽副黏病毒Ⅰ型F基因Ⅶ型毒株，與新城疫常用的弱毒苗、中等毒力苗的毒株基因型不同；因此，僅用這些疫苗進(jìn)行免疫不能防治鵝副黏病毒病，只有選用經(jīng)過基因鑒定的毒株制備滅活苗，才能有效預(yù)防本病的發(fā)生[7-8]。鵝場(chǎng)應(yīng)制定科學(xué)合理的免疫程序，做好鵝群的免疫監(jiān)測(cè)工作，定期檢測(cè)鵝副黏病毒病的抗體（HI抗體）水平，做到科學(xué)免疫。遏制鵝副黏病毒病的發(fā)生和流行，必須采取綜合防治措施。雞群也能感染鵝副黏病毒病，因此鵝場(chǎng)須遠(yuǎn)離雞場(chǎng)、村戶，鵝群內(nèi)不飼養(yǎng)雞，避免相互傳播[5]。鵝群一旦發(fā)病應(yīng)該立即隔離或淘汰病鵝，同時(shí)對(duì)假定健康鵝進(jìn)行緊急免疫接種。

參考文獻(xiàn)：

[1]萬洪全，劉海俠，吳力力，等. 鵝副黏病毒對(duì)鴿的致病性研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，32（5）：5-8.

[2]張偉，刁有祥，徐福亮，等. 鵝副黏病毒LS-1株的分離鑒定及F基因分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，33（4）：31-35.

[3]王永坤，朱國(guó)強(qiáng)，金山，等. 水禽病診斷與防治手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：36-45.

[4]Anonymous. OIE Manual of standard ford：agnostic tests and vaccines[M]. 2nd ed. Paris，F(xiàn)rance：Office International des Epizooties，1992.

[5]李鵬飛，李盛強(qiáng)，郭劍英，等. 廣東地區(qū)幾例鵝副黏病毒病的剖檢變化[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2009（11）：57.

[6]張偉，季艷菊，陳芳艷，等. 鵝副黏病毒病的診斷與防控[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)，2008，26（12）：28-29.

[7]王永坤，田惠芳，周繼宏，等. 鵝副黏病毒病的研究[J]. 江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，15（6）：12.

[8]吳民. 鵝副黏病毒F基因的克隆和序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（7）：35-36.