韓霜

摘要：以國(guó)慶小菊金陵豐收為試驗(yàn)材料，使用的培養(yǎng)基是ME3+150 g/L PEG4000）+100 g/L 蔗糖），添加不同濃度鈣和硼酸，研究不同濃度的鈣和硼酸對(duì)國(guó)慶菊花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響，旨在獲得菊花花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：硼酸對(duì)花粉萌發(fā)率影響明顯，當(dāng)硼酸濃度是100 mg/L時(shí)，花粉培養(yǎng)2 h時(shí)花粉萌發(fā)率達(dá)到最高，為1005%。外源鈣能促進(jìn)花粉的萌發(fā)，并影響花粉管的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)質(zhì)量，一定濃度的鈣使花粉管生長(zhǎng)筆直，在鈣濃度為400 mg/L時(shí)金陵豐收花粉管生長(zhǎng)狀況最佳。外源鈣濃度過(guò)高和培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，花粉管生長(zhǎng)出現(xiàn)細(xì)弱、畸形，而且容易斷落。

關(guān)鍵詞：菊花；離體培養(yǎng)；花粉萌發(fā)率；花粉管生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：S682.1+10.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0258-03

菊花（Chrysanthemum morifolium）是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有很高的觀賞價(jià)值。我國(guó)是菊花的起源中心，擁有3 000余個(gè)菊花品種[1]。菊花是異花授粉植物，具有自交不親和特性，花粉生活力是決定雜交結(jié)實(shí)的重要因素之一，因此研究花粉活力對(duì)指導(dǎo)菊花育種具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義[2]。花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[3]要通過(guò)吸漲、停滯、花粉管發(fā)端、花粉管迅速伸長(zhǎng)這4個(gè)階段。研究報(bào)道，許多植物的花粉可以在培養(yǎng)基上萌發(fā)，如杜紀(jì)紅等[3]、杜玉虎等[4]、儲(chǔ)立明等[5]分別對(duì)桃、榆葉梅、絲瓜等花粉進(jìn)行了離體培養(yǎng)研究。

國(guó)慶菊是菊花中的一種栽培類型，不僅具有生長(zhǎng)繁盛、開(kāi)花期長(zhǎng)、分枝性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，而且營(yíng)造景觀效果好、耐鹽堿、成活率高[6]?；ǚ勖劝l(fā)和花粉管生長(zhǎng)是植物受精的一個(gè)重要組成部分，不少研究表明，花粉萌發(fā)時(shí)引發(fā)的群體效應(yīng)可由外源鈣離子來(lái)替代，這種作用對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過(guò)程很重要[7-8]?；ǚ酃苊劝l(fā)和生長(zhǎng)需要硼的作用，花粉管頂端聚集的酯化果膠[9]，是由細(xì)胞壁上聚集了細(xì)胞中多數(shù)的硼，與果膠類物質(zhì)RG-Ⅱ（鼠李半乳糖醛酸-Ⅱ）結(jié)合形成的，這種酸性果膠物質(zhì)有利于頂端的延展，整個(gè)花粉管內(nèi)遍布這種酸性的果膠物質(zhì)，使細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度增大[10]，從而推測(cè)，硼酸可能與RG-Ⅱ結(jié)合形成果膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，硼酸可防止酚類物質(zhì)的積累，促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng)[11]。本研究對(duì)國(guó)慶小菊金陵豐收花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基成分及其濃度和萌發(fā)時(shí)間進(jìn)行研究，以期獲得菊花最適宜的離體培養(yǎng)條件，為花粉萌發(fā)和活力測(cè)定提供高效、簡(jiǎn)便的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為菊花品種金陵豐收，該品種初花期在9月下旬，盛花期在10月中旬，該材料由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花種質(zhì)資源中心提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1花粉采集于晴天中午12：00，采取金陵豐收盛開(kāi)花朵的花粉，裝到離心管中，避光，備用。

1.2.2花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的確定

1.2.2.1培養(yǎng)基成分以 ME3+150 g/L PEG4000）+100 g/L 蔗糖為培養(yǎng)基[1]，培養(yǎng)基中ME3[12]的基本成分包含大量元素：370 mg/L MgSO4·7H2O、950 mg/L KNO3、412.5 mg/L NH4NO3、175 mg/L KCl、85 mg/L KH2PO4；微量元素：0.83 mg/L KI、7.45 mg/L Na2 EDTA、0.25 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025 mg/L CuSO4·5H2O、0.025 mg/L FeSO4·7H2O、0.025 mg/L CoCl2·6H2O；維生素B1、維生素B6各1 mg/L。

1.2.2.2 培養(yǎng)基設(shè)置在ME3+150 g/L PEG4000+100g/L 蔗糖的培養(yǎng)基[1]中加入不同濃度的鈣和硼酸，其中硼酸濃度分別為5、50、100、200 mg/L，鈣濃度分別為0、200、400、800 mg/L，以ME3+150 g/L PEG4000+100 g/L 蔗糖+ 0 mg/L 硼酸的培養(yǎng)基為對(duì)照（CKⅠ），再分別加入上述濃度的硼酸，得出最適的硼酸濃度A；再加入上述濃度的外源鈣，以ME3+150 g/L PEG4000+100 g/L蔗糖+A濃度硼酸的培養(yǎng)基為對(duì)照（CKⅡ），從而得出最適的鈣濃度B。

1.2.3花粉萌發(fā)與花粉管長(zhǎng)度檢測(cè)

1.2.3.1花粉萌發(fā)方法花粉萌發(fā)方法參照趙宏波等的方法[13加以修改，將采集來(lái)的菊花花粉，從離心管里倒出，放于玻璃紙上，然后用毛筆蘸取，輕撒適量的花粉到凹形載玻片的凹槽中，用膠頭滴管吸取培養(yǎng)液2～3滴，滴在盛有花粉的載玻片凹槽中。將培養(yǎng)皿底部墊上1層吸水的濾紙，將載玻片放上，并在兩旁放上吸水的脫脂棉球，用以保濕，蓋上培養(yǎng)皿蓋后放入恒溫箱內(nèi)20 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)取出，在顯微鏡下（10×10）觀察統(tǒng)計(jì)花粉的萌發(fā)率并用顯微測(cè)微尺測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度。

1.2.3.2花粉萌發(fā)率將花粉放于不同濃度培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0.5、1、2 、4 h后從恒溫培養(yǎng)箱里取出凹形載玻片在顯微鏡下觀察。每種試驗(yàn)處理重復(fù)3次，每次重復(fù)隨機(jī)觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野觀察的花粉總數(shù)不少于60粒，以花粉管的長(zhǎng)度大于花粉粒的直徑為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[1]，以花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%為計(jì)算方法，最后將花粉的萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3.3顯微測(cè)微尺的使用顯微測(cè)微尺包括鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺，測(cè)量前，要先進(jìn)行校正，鏡臺(tái)測(cè)微尺的中央有1個(gè)全長(zhǎng)1 mm的刻度標(biāo)尺，等分成100個(gè)小格，每小格的長(zhǎng)度為0.01 mm，可以用它來(lái)矯正目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度。校正后的目鏡測(cè)微尺以每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度作為測(cè)量的尺度。

1.2.3.4花粉管長(zhǎng)度檢測(cè)將花粉放于不同濃度培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0.5、1.0、2.0、4.0 h后從恒溫培養(yǎng)箱里取出凹形載玻片在顯微鏡下觀察。每種試驗(yàn)處理重復(fù)3次，每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)量20個(gè)花粉管的長(zhǎng)度，用顯微鏡的測(cè)微尺測(cè)量花粉管長(zhǎng)度，計(jì)算隨機(jī)測(cè)量的20個(gè)花粉管長(zhǎng)度的平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS v17.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理之間差異顯著水平用單因素鄧肯檢驗(yàn)，P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

金陵豐收花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的升高而增加，與對(duì)照相比，在培養(yǎng)時(shí)間0～1 h內(nèi)，5、50 mg/L處理中的花粉萌發(fā)率增加最顯著。不同硼酸濃度處理的花粉萌發(fā)率差異顯著，其中100 mg/L 2 h時(shí)的花粉萌發(fā)率達(dá)到10.050%，比50、5 mg/L花粉萌發(fā)率分別增加了89%、92%。當(dāng)硼酸濃度升高到200 mg/L時(shí)，每個(gè)時(shí)間段的萌發(fā)率基本相同，而且與 100 mg/L 硼酸濃度相比，花粉萌發(fā)率有所下降（表1）。說(shuō)明硼酸只有在適宜的濃度下，才會(huì)對(duì)花粉萌發(fā)率有一定促進(jìn)作用，高濃度的硼酸對(duì)花粉的萌發(fā)反而有一定的抑制作用。

2.2硼酸對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響

硼酸對(duì)花粉管生長(zhǎng)具有明顯影響（圖1）。在無(wú)硼酸的培養(yǎng)基上，花粉管細(xì)長(zhǎng)且彎曲（圖1-d），加上硼酸之后，花粉管生長(zhǎng)變粗而且直（圖1-h）。不同濃度硼酸對(duì)金陵豐收花粉管生長(zhǎng)的影響達(dá)到顯著水平，在2 h之內(nèi)，增加硼酸濃度金陵豐收花粉管有伸長(zhǎng)的趨勢(shì)，但2 h以后，花粉管的伸長(zhǎng)速度明顯緩慢。硼酸200 mg/L時(shí)的每個(gè)時(shí)間段的平均花粉長(zhǎng)度與100 mg/L的相比無(wú)明顯的變化。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在無(wú)硼酸和有硼酸的條件下都出現(xiàn)了1個(gè)花粉粒長(zhǎng)出2根花粉管的現(xiàn)象（圖1-d，圖1-h，紅色箭頭）。在無(wú)硼條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)花粉管有伸長(zhǎng)趨勢(shì)，但添加硼之后能促進(jìn)金陵豐收花粉管的生長(zhǎng)（表2）。

2.3鈣對(duì)花粉萌發(fā)的影響

鈣顯著提高了金陵豐收花粉萌發(fā)率，隨著鈣濃度的升高花粉萌發(fā)率顯著增加，以鈣濃度為400 mg/L處理中的花粉萌發(fā)率最高，當(dāng)其濃度增加到800 mg/L時(shí)，花粉的萌發(fā)率反而下降（表3）。

2.4鈣對(duì)花粉形態(tài)和花粉管生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基中添加Ca2+對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響不顯著（表4），對(duì)花粉管品質(zhì)的影響較大，外源鈣濃度過(guò)高以及離體培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都不適合金陵豐收花粉管生長(zhǎng)，當(dāng)外源Ca2+達(dá)到400 mg/L時(shí)，在0～1 h期間花粉管生長(zhǎng)正常（圖2-e，圖2-f），2 h后花粉生長(zhǎng)出現(xiàn)異常（圖2-g，圖2-h）；當(dāng)外源Ca2+達(dá)到800 mg/L時(shí)花粉管末端細(xì)弱、畸形（圖2-j至圖2-l）。

3討論

硼在植物體內(nèi)含量低，分布不均勻，以花中含量最高，參與果膠物質(zhì)的合成，有利于花粉管壁的形成，因此有利于花粉管的生長(zhǎng)[14]。迄今有關(guān)硼酸對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的研究報(bào)道較多，均認(rèn)為一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)[15]。趙宏波等研究認(rèn)為菊花花粉在離體培養(yǎng)0.5～2.0內(nèi)，萌發(fā)率呈直線上升趨勢(shì)，2 h之后花粉的萌發(fā)率增加不顯著，外源硼和鈣對(duì)金陵豐收花粉萌發(fā)都是必需的[13]，本研究得出以上相同的結(jié)論。本研究還發(fā)現(xiàn)，一定濃度的鈣能顯著提供花粉萌發(fā)率并使生長(zhǎng)健壯，但濃度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)花粉萌發(fā)率反而受到抑制，2 h后花粉細(xì)弱畸形。不同植物種類的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)所需的最適硼酸濃度不同，杜紀(jì)紅等研究表明，0.1%的硼酸可提高大多數(shù)桃品種花粉萌發(fā)率[3]，本研究發(fā)現(xiàn)100 mg/L）硼酸對(duì)金陵豐收萌發(fā)最有利。

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