虞小燕++鄧百萬++陳文強(qiáng)

摘要：利用拮抗試驗(yàn)，萌發(fā)試驗(yàn)和ITS序列分析技術(shù)對(duì)秦巴山區(qū)12個(gè)天麻萌發(fā)菌菌株進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明：12個(gè)萌發(fā)菌菌株分為兩大類，其中8103-4、8103-6、8103-7、8103-8這4個(gè)菌株與其他菌株拮抗反應(yīng)明顯，并且ITS序列分析顯示在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系相近；萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南此8個(gè)菌株拮抗反應(yīng)不明顯，ITS序列分析顯示在同一個(gè)分支上，8103-3、萌發(fā)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌種Mycena citrinomarginata親緣關(guān)系相近，萌MD-2、石斛小菇-1、萌-3、萌-7、石斛小菇-2、萌-云南與Mycena purpureofusca親緣關(guān)系相近。

關(guān)鍵詞：天麻萌發(fā)菌；拮抗；rDNA序列；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0245-04

萌發(fā)菌隸屬于擔(dān)子菌綱（Basidiomyeetes）傘菌目（Agarieales）口蘑科（Trieholomataeeae）小菇屬（Myeena）[1]，主要包括紫萁小菇（M . mosmundicola）、石斛小菇（M . mdendrobii）和開唇小菇（M . manoectochila）三大類屬。天麻萌發(fā)菌主要分布于我國陜西、云南、甘肅、河南、河北、湖南、湖北、貴州、新疆、四川、安徽、黑龍江、吉林、廣西、海南、福建、內(nèi)蒙古、西藏及臺(tái)灣等省區(qū)[2]，為天麻（Gastrodia elata）有性繁殖時(shí)的必要共生菌。天麻種子細(xì)小如粉塵，無胚乳及其營(yíng)養(yǎng)貯備，無外源營(yíng)養(yǎng)供給，種子不能發(fā)芽。它的萌發(fā)靠小菇屬（Mycena）一類真菌菌絲侵染種胚提供營(yíng)養(yǎng)，促使其萌發(fā)[3]。隨著天麻藥用需求不斷增加，野生資源日益匱乏，且人工栽培中以無性繁殖來連續(xù)種植，天麻球莖明顯退化，側(cè)芽發(fā)芽率低等原因，經(jīng)過有性繁殖培育0代天麻或1代天麻，再通過無性繁殖擴(kuò)大種植已成為天麻穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的重要途徑[4-5]。目前，國內(nèi)外對(duì)天麻萌發(fā)菌種質(zhì)資源研究報(bào)道較少，且主要集中于地區(qū)優(yōu)良栽培品種的篩選和生物學(xué)特性的研究，如冉孝琴等對(duì)貴州天麻萌發(fā)菌優(yōu)良菌株進(jìn)行了篩選[6]；李方安等對(duì)紫萁小菇生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究[7]。

由于天麻萌發(fā)菌菌株市場(chǎng)上命名混雜，且物種間形態(tài)差異不大，通過形態(tài)鑒定較為困難。目前，秦巴山區(qū)天麻萌發(fā)菌菌種的親緣關(guān)系尚無相關(guān)研究報(bào)道，萌發(fā)菌菌種的種源關(guān)系不明確，缺少適宜地域栽培生長(zhǎng)的天麻萌發(fā)菌菌種，對(duì)于培育出適合秦巴山區(qū)栽培的優(yōu)良高產(chǎn)菌種的難度較大。利用rDNA ITS序列分析技術(shù)[8]，可以直接提取蘊(yùn)含于基因組內(nèi)的遺傳信息，檢測(cè)和比較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)無法區(qū)分的相似菌株種間或種內(nèi)差別，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。筆者選取秦巴山區(qū)8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12個(gè)天麻萌發(fā)菌主要栽培菌株，對(duì)其形態(tài)特征及核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行序列分析，并進(jìn)一步對(duì)ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank同源性檢索比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以期為基于傳統(tǒng)形態(tài)特征對(duì)秦巴山區(qū)天麻萌發(fā)菌菌株之間的親緣關(guān)系提供分子依據(jù)，為天麻萌發(fā)菌建立種質(zhì)資源庫及優(yōu)良菌種的選育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12株萌發(fā)菌菌株：由陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食藥用菌菌種保藏中心提供。

1.1.2改良CPDA培養(yǎng)基包括馬鈴薯200.0 g，玉米粉 50.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，NH4NO3 5.0 g，維生素B1 10 mg，瓊脂 15.0 g，加水至1 000 mL，pH值自然。CPDA液體培養(yǎng)基，根據(jù)上述改良CPDA培養(yǎng)基配制，但不加添瓊脂。

1.2方法

1.2.1拮抗試驗(yàn)制備試管斜面培養(yǎng)基，活化各菌株，每株3管；取試管活化菌株在同一培養(yǎng)皿上對(duì)稱接種2個(gè)菌株，24 ℃ 恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌絲間的拮抗反應(yīng)情況。

1.2.2萌發(fā)試驗(yàn)青岡木樹葉浸泡24 h后，平鋪在培養(yǎng)皿表面，接種各萌發(fā)菌菌株，每株3個(gè)，24 ℃ 恒溫培養(yǎng)7 d，選取未開裂、顏色較深、富有彈性且大小相近的天麻果實(shí)，均勻播撒在培養(yǎng)皿中，24 ℃ 恒溫培養(yǎng)60 d，期間定期定量加水，觀察萌發(fā)情況。

1.2.3液體發(fā)酵制備CPDA液體培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝液量150 mL，于1.034×105 Pa滅菌 30 min，冷卻后將活化的菌株接種至液體搖瓶中，靜置24 h后，24 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 ～12 d。用3層無菌紗布過濾菌絲球，再用無菌水洗滌過濾2～3次，最后用無菌濾紙吸干水分收集菌絲體。4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4DNA的提取及擴(kuò)增采用CTAB法提取供試菌絲體的基因組DNA[10]；PCR擴(kuò)增：ITS引物：ITS 1（5′-3′）TCCGTAGGTGAA-CCTGGG，ITS 4（5′-3′）TCCTCCGCTTATTGA-TATGC。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Green Mix 15 μL，引物ITS 1、ITS 4各2 μL，模板DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行45 min電泳。

1.2.5測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的上述PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將所測(cè)的序列用Clustal-W軟件進(jìn)行對(duì)位排列，然后手工適當(dāng)校正。隨后將調(diào)整后的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行Blast檢索，下載同源性較高的序列。利用Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.112株天麻萌發(fā)菌的拮抗反應(yīng)

12株天麻萌發(fā)菌通過相互之間的兩兩接觸性試驗(yàn)，結(jié)果見圖1、表1，分析得出8103-4、8103-6、8103-7、8203-8之間無拮抗反應(yīng)或反應(yīng)不明顯，與其他菌株之間拮抗反應(yīng)明顯，故此4株菌親緣性相近；萌-3、萌-7、萌發(fā)菌、石斛-1、萌-云南之間無拮抗反應(yīng)或反應(yīng)不明顯，與8103-3，萌MD-2，石斛-2之間拮抗反應(yīng)微弱，故可將此8株菌分成2組來進(jìn)一步研究。

2.212株萌發(fā)菌對(duì)天麻種子萌發(fā)研究

12株天麻萌發(fā)菌與天麻種子伴栽后萌發(fā)情況見圖2、表2。萌-3、萌-7、萌發(fā)菌、石斛-1、萌-云南 5株菌中天麻種子萌發(fā)數(shù)量多，萌發(fā)均勻，天麻生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷；8103-4、8103-6、8103-7、8203-8這4株菌中天麻種子萌發(fā)數(shù)量稀少或沒有，天麻瘦小萎蔫，色澤暗淡；8103-3、萌MD-2、石斛-2中天麻種子萌發(fā)數(shù)量較少，天麻種子萌發(fā)不均勻，天麻生長(zhǎng)良好，色澤鮮艷。

2.3供試菌株ITS-PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果

取5 μL PCR產(chǎn)物，用10 g/L瓊脂糖凝膠（TBE緩沖液）電泳檢測(cè)，于Tanon 3500R凝膠成像系統(tǒng)（中國TANON公司產(chǎn)品）拍照，電泳結(jié)果見圖3。

由圖3可見，12個(gè)天麻萌發(fā)菌菌株的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了單一的條帶，菌種的rDNA ITS區(qū)域的序列片段長(zhǎng)度大小為600 bp。將所獲得的12個(gè)ITS序列提交給NCBI公共數(shù)據(jù)GenBank進(jìn)行比對(duì)，分析得到8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南收錄號(hào)依次為：KT149154、KT149155、KT149156、KT149157、KT149158、KT149159、KT149160、KT149161、KT149162、KT149163、KT149164、KT149165。

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從GenBank上進(jìn)行Blast檢索，下載同源性較高的菌株序列，用Clustal-W軟件對(duì)所有序列進(jìn)行人工校正，再用MEGA 6采用臨近相鄰法聚類，經(jīng)自舉法檢驗(yàn)（1 000次重復(fù)）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

菌株菌絲特征天麻長(zhǎng)勢(shì)特征種子出芽快慢8103-3潔白，致密，絨毛狀分布不均勻，個(gè)體差異大，出現(xiàn)畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢8103-4潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個(gè)體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-6潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個(gè)體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-7潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個(gè)體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-8潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個(gè)體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快萌-3潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快萌-7潔白，稀疏，絨毛狀大小均一，生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快萌MD-2潔白，稀疏，絨毛狀分布不均勻，個(gè)體差異大，出現(xiàn)畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢萌發(fā)菌潔白，稀疏，絨毛狀大小均一，生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快石斛-1潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快石斛-2潔白，稀疏，絨毛狀分布不均勻，個(gè)體差異大，出現(xiàn)畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢萌-云南潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長(zhǎng)健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快8103-4、8103-6、8103-7、8103-8這4個(gè)菌在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系密切，與已知序列相似度為99%，但在進(jìn)化樹上形成了單獨(dú)的分支，這可能是新的分類單元；8103-3、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南這8個(gè)菌在同一個(gè)分支上，其中8103-3、萌發(fā)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌Mycena citrinomarginat親緣關(guān)系比較近，萌MD-2、石斛小菇-1與標(biāo)準(zhǔn)菌種Mycena purpureofusca親緣關(guān)系非常近。

3討論與結(jié)論

真菌的拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和的直接體現(xiàn)。在真菌界，體細(xì)胞不親和現(xiàn)象普遍存在。此方法具有簡(jiǎn)單、快捷、直觀等優(yōu)點(diǎn)。是常用的真菌菌種鑒定方法；ITS rDNA區(qū)進(jìn)化速率較快，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，對(duì)高等植物和大型真菌鑒定有很好的準(zhǔn)確性和靈敏性，適用于不同真菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)合拮抗反應(yīng)和ITS序列分析對(duì)天麻萌發(fā)菌進(jìn)行親緣關(guān)系分析具有極高的準(zhǔn)確性。

本研究應(yīng)用拮抗反應(yīng)和萌發(fā)特性對(duì)萌發(fā)菌菌株進(jìn)行研究，對(duì)其中菌絲粗壯，菌落致密，生長(zhǎng)速度快萌發(fā)效果好的菌種進(jìn)行標(biāo)記篩選，通過對(duì)12株天麻萌發(fā)菌間的拮抗反應(yīng)以及與天麻種子萌發(fā)試驗(yàn)的分析，大致將12株萌發(fā)菌分為3類：萌-3、萌-7、萌發(fā)菌、石斛-1、萌-云南，此5株菌株長(zhǎng)勢(shì)相同，萌發(fā)效果好，株長(zhǎng)勢(shì)相同，與其他菌株拮抗反應(yīng)明顯，萌發(fā)效果不理想；103-3、萌MD-2、石斛-2此3株菌與8103-4、8103-6、8103-7、 8103-8拮抗反應(yīng)明顯與其他菌株拮抗反應(yīng)不明顯，萌發(fā)效果較好。應(yīng)用ITS序列分析技術(shù)，對(duì)秦巴山區(qū)天麻萌發(fā)菌菌種進(jìn)行了測(cè)序分析，將其分為2類，其中8103-4、8103-6、8103-7、 8103-8這4個(gè)菌在同一個(gè)分支上，相似度為100%，親緣關(guān)系相近，但在進(jìn)化樹上形成了單獨(dú)的分支，形成了新的分類單元；萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發(fā)菌、石斛小菇-1、石斛小菇-2、萌-云南8個(gè)菌在同一個(gè)分支上，其中8103-3、萌發(fā)菌與標(biāo)準(zhǔn)菌Mycena citrinomarginata親緣關(guān)系比較近，萌MD-2、石斛-1、萌-3、萌-7、石斛-2、萌-云南與標(biāo)準(zhǔn)菌株Mycena purpureofusca親緣關(guān)系較近。這與拮抗試驗(yàn)及萌發(fā)試驗(yàn)得到的結(jié)論大致相同。由于在實(shí)際生產(chǎn)種存在突變、變異、進(jìn)化的原因，菌株間存在物種多樣性的影響，對(duì)秦巴山區(qū)12個(gè)天麻萌發(fā)菌供試菌株進(jìn)行RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜的分析還有待進(jìn)一步研究。

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