劉健++張德詠++張松柏

摘要：辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV），目前在我國(guó)僅有在海南黃燈籠辣椒上嚴(yán)重危害的報(bào)道。利用湖南省和福建省采集的辣椒樣本，檢測(cè)辣椒ChiVMV的檢出率，并克隆ChiVMV的CP基因序列，用鄰近法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化情況。結(jié)果表明，辣椒的ChiVMV省檢出率湖南省為25%，福建省為20%；克隆了湖南省和福建省ChiVMV CP基因各1個(gè)，系統(tǒng)發(fā)育表明，湖南省和福建的ChiVMV株系與源于韓國(guó)ChiVMV株系聚在一個(gè)亞簇，而與我國(guó)其他地區(qū)ChiVMV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明侵染辣椒的ChiVMV在我國(guó)進(jìn)一步擴(kuò)展，且存在遺傳分化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：辣椒脈斑駁病毒；檢測(cè)；CP基因；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)： S436.418.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0184-02

辣椒，一種茄科辣椒屬植物，原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū)，在全世界都有廣泛栽培，是世界上消費(fèi)量最大的蔬菜之一。我國(guó)辣椒種植面積高達(dá)140萬hm2以上，占據(jù)我國(guó)所有蔬菜作物種植面積的10%[1]。辣椒病毒病是威脅辣椒安全生產(chǎn)的重要病害，目前能夠侵染辣椒的病毒有40多種[2-3]，其中辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是危害辣椒作物的最主要病毒之一；該病毒于1979年首次在馬來半島的辣椒作物上被發(fā)現(xiàn)[4]，隨后在世界上許多國(guó)家的辣椒作物上陸續(xù)被報(bào)道[5-7]。ChiVMV主要依靠蚜蟲進(jìn)行非持久性傳播[4]，還能通過病株汁液和機(jī)械接觸等方式傳播，不能通過種子傳播，因此，其傳播擴(kuò)散速度非常快。

在我國(guó)，ChiVMV首先在海南省被報(bào)道，嚴(yán)重危害海南的黃燈籠椒[8]，隨后在陜西、云南等地區(qū)相繼發(fā)生[8-10]。然而，到目前為止，尚未見ChiVMV在湖南以及福建等地區(qū)的報(bào)道。鑒于ChiVMV對(duì)辣椒生產(chǎn)的威脅，本研究檢測(cè)了湖南和福建等地辣椒上ChiVMV的發(fā)生情況，克隆了湖南和福建等地ChiVMV株系的CP基因，并分析了其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為明確我國(guó)ChiVMV的分布及遺傳進(jìn)化提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

辣椒樣品：2013年8月，在湖南省和福建省進(jìn)行辣椒病毒病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分地塊辣椒病毒病的發(fā)病癥狀與ChiVMV類似，表現(xiàn)為植株矮小，葉片畸形（包括葉片黃化、葉卷曲、葉面枯斑、葉沿皺縮等）。采集湖南省辣椒樣本16個(gè)、福建省辣椒樣本8個(gè)。

ChiVMV ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)RB公司；cDNA試劑盒、DNTP、氨芐青霉素、EASY Taq DNA聚合酶和DNA回收試劑盒均購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒購自Ambion公司，Elisa試劑盒購自RP公司；供試引物由華大基因公司合成，DNA測(cè)序測(cè)定由生物工程（上海）有限公司完成。

1.2ELISA檢測(cè)

ELISA檢測(cè)具體操作步驟按說明書進(jìn)行。陽性對(duì)照為試劑盒自帶ChiVMV病毒初提純物；陰性對(duì)照為溫室內(nèi)健康辣椒苗的研磨液。

1.3RT-PCR

Trizol法抽提辣椒葉片總RNA，取500 ng總RNA，采用 All-in-one First-Strand cDNA合成試劑盒合成cDNA。以合成 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增引物ChiVMV CP特異性引物，CPF（5′-GCGGGAGAGAGTGTTGATGCTG-3′），CPR（5′-TCGCCACTATTGAACAGCTTAAC-3′）；1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，回收符合預(yù)期大小的條帶，送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.4序列進(jìn)化分析

從Genbank數(shù)據(jù)庫中下載了9個(gè)ChiVMV典型分離物的CP基因序列。利用CLUSTAL W對(duì)所有CP序列進(jìn)行多序列聯(lián)配，利用Mega 5.0采用鄰接法，構(gòu)建ChiVMV CP 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2結(jié)果與分析

2.1ChiVMV ELISA檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，從湖南采集的16個(gè)辣椒樣本中，共有4個(gè)樣本呈現(xiàn)陽性；而從福建采集的8個(gè)樣本中，檢測(cè)出2個(gè)陽性樣本。

2.2ChiVMV CP基因克隆與序列分析

RT-PCR結(jié)果表明，擴(kuò)增得到大小為1 100 bp的條帶（含ChiVMV CP全基因序列以及部分上游基因序列），與預(yù)期大小一致。將RT-PCR擴(kuò)增得到的條帶進(jìn)行序列測(cè)定，截取ChiVMV CP基因序列，輸入NCBI進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，福建和湖南等地的ChiVMV株系CP基因與來源于韓國(guó)辣椒的ChiVMV序列同源性最高（>97%）。

2.3序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

從ChiVMV-hn和ChiVMV-fj的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可以看出，發(fā)育樹共分成3個(gè)分支，分別為韓國(guó)株系分支、印度株系分支和中國(guó)株系分支，具有很強(qiáng)的地域性；而ChiVMV-hn和ChiVMV-fj與韓國(guó)的2個(gè)分離物（AJ972878.1和AM909717.1）構(gòu)成1個(gè)分支，表明湖南和福建等地的ChiVMV株系與韓國(guó)ChiVMV的親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)發(fā)育分析還表明，我國(guó)辣椒上的ChiVMV具有遺傳分化的趨勢(shì)。

3結(jié)論

ChiVMV是一種（+）ssRNA病毒，是Potyvirus Y病毒屬的確定種，該病毒的存在嚴(yán)重制約著韓國(guó)、印度、泰國(guó)等國(guó)和我國(guó)臺(tái)灣等地的辣椒生產(chǎn)，是造成這些地方辣椒減產(chǎn)的最主要原因之一[4，12]。本研究采用ELISA以及RT-PCR方法在湖南省和福建省等地的辣椒病樣檢測(cè)到ChiVMV，表明ChiVMV在我國(guó)的侵染范圍正逐步擴(kuò)展，對(duì)我國(guó)辣椒的生產(chǎn)具有潛在的威脅。

ChiVMV湖南和福建等地的CP基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，我國(guó)的ChiVMV存在遺傳分化的趨勢(shì)；由于ChiVMV不同株系對(duì)辣椒的致病性存在差異，因此，我國(guó)ChiVMV的株系分化情況，急需開展進(jìn)一步的研究，為分析ChiVMV對(duì)辣椒的危害提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為該病毒的科學(xué)防控提供科學(xué)參考。

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