馬欣++霍蓉++喬俊卿

摘要：通過測(cè)定菌絲干質(zhì)量、菌絲生長速率、孢子萌發(fā)率等，研究黃柏的乙醇提取物對(duì)番茄枯萎病菌的室內(nèi)抑菌作用，利用溫室盆栽試驗(yàn)評(píng)估黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的防治效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有顯著抑制作用，且抑制率隨提取物質(zhì)量濃度的增大而升高，質(zhì)量濃度為32 000 mg/L時(shí)對(duì)枯萎病菌菌絲生長的抑制作用達(dá)到80%以上，抑制中濃度（MIC）為7 530 mg/L。質(zhì)量濃度為16 000 mg/L的處理對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)100%。在盆栽試驗(yàn)中，質(zhì)量濃度為16 000 mg/L的處理對(duì)番茄枯萎病的保護(hù)防治效果達(dá)73.53%，顯著高于常規(guī)化學(xué)藥劑。試驗(yàn)表明，黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌具有較好的防治效果。

關(guān)鍵詞：黃柏；乙醇提取物；番茄枯萎??；抑菌作用；防治效果

中圖分類號(hào)： S436.412.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0178-03

番茄枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的番茄生產(chǎn)中一種重要的土傳病害[1]。該病原菌經(jīng)土壤傳染，從根部侵入，傳染性極強(qiáng)[2]，發(fā)病率一般為20%～30%，受害較重的地區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%以上，嚴(yán)重危害番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。目前生產(chǎn)中主要采用多菌靈、咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)藥劑防治番茄枯萎病[4]，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥將導(dǎo)致番茄枯萎病菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)增加、有毒化學(xué)物質(zhì)殘留量增加、生態(tài)環(huán)境污染加重，嚴(yán)重威脅人類健康和生存。人們對(duì)綠色、有機(jī)食品的需求越來越大，開發(fā)低毒、低殘留、無污染、與環(huán)境和諧的新型農(nóng)藥已迫在眉睫[5]。植物中含有多種天然化學(xué)成分，已成為新型生物農(nóng)藥開發(fā)的重要材料資源。筆者曾用近10種中草藥的乙醇提取物對(duì)番茄枯萎病菌進(jìn)行抑菌活性的離體測(cè)定，研究結(jié)果表明，黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌的抑菌活性最高[6]。本研究利用黃柏的乙醇提取物對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用，以及在番茄活體上的保護(hù)和治療作用進(jìn)行測(cè)定，以期為新型植物源殺菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1黃柏供試中藥黃柏（Phellodendron chinense Schneid.）屬蕓香科，購自山西省運(yùn)城市中藥市場(chǎng)，使用枝皮部位。

1.1.2供試菌種和培養(yǎng)基番茄枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）分離自發(fā)病番茄的根部，由馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基于28 ℃下繼代培養(yǎng)，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1黃柏提取液的制備采用超聲波提取法制備黃柏提取液。將陰干的黃柏材料置于45 ℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱中吹干至發(fā)脆，采用植物粉粹機(jī)將材料粉碎，過80目篩后備用。稱取樣品干粉100 g，用70%乙醇按1 g ∶6 mL的料液比浸泡，充分?jǐn)嚢枋谷軇┩耆]中草藥材料，置于避光處靜置24 h；于45 ℃、80 Hz條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，再次采用同樣方法處理殘?jiān)?，重?fù)提取3次，合并3次濾液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃條件下將濾液減壓濃縮至無溶劑蒸出（呈浸膏狀），并用50%乙醇定容至106 mg/L，密封標(biāo)記后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌菌絲生長的抑制作用采用菌絲干質(zhì)量法測(cè)試黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌菌絲生長的抑制作用。用100 mL PD培養(yǎng)液將黃柏提取物分別稀釋至32 000、16 000、8 000 mg/L，在各質(zhì)量濃度培養(yǎng)液中分別加入3片直徑為0.6 cm的番茄枯萎病病原菌菌餅，于 28 ℃ 下振蕩培養(yǎng)10 d。采用經(jīng)充分干燥并稱質(zhì)量的濾紙過濾，于80 ℃下烘干至恒質(zhì)量。以不添加任何藥劑的PD培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，稱量菌絲干質(zhì)量并計(jì)算抑菌率，每個(gè)處理重復(fù)3次[7]。

抑菌率=（對(duì)照菌絲干質(zhì)量-處理菌絲干質(zhì)量）/對(duì)照菌絲干質(zhì)量×100%。

1.2.3黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌菌絲抑制中濃度（MIC）的測(cè)定將1 g/mL的黃柏提取液分別稀釋成質(zhì)量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500 mg/L的帶藥培養(yǎng)基，采用生長速率法進(jìn)行抑菌活性的離體測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次；以混有50%乙醇的PDA培養(yǎng)基、純PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，采用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算不同質(zhì)量濃度黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病菌菌絲生長的抑制率，并計(jì)算抑制率達(dá)到50%時(shí)黃柏提取物的質(zhì)量濃度，即抑制中濃度（MIC）[8]。

菌落直徑=測(cè)量菌落直徑平均值-0.6 cm；

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.4黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用試驗(yàn)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[9]測(cè)定黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用。制備6×106 CFU/mL的番茄枯萎病菌菌懸液，并稀釋至約100 CFU/mL。吸取20 μL菌懸液于含黃柏提取物質(zhì)量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000、500 mg/L的帶藥固體培養(yǎng)基平板中，采用涂菌棒涂布均勻并靜置15 min，將培養(yǎng)皿倒置以防止皿蓋冷凝水下滴，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)完成后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，涂布提取物平板菌落數(shù)記為C，對(duì)照組菌落數(shù)記為C0，計(jì)算抑制率。

萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)=C/C0×100%；

抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率=（C0-C）/C0×100%。

1.2.5黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的保護(hù)和治療效果采用盆栽試驗(yàn)法測(cè)定黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的保護(hù)和治療效果。將番茄種播于滅菌土壤中，當(dāng)番茄苗長出6片真葉時(shí)進(jìn)行移苗。將秧苗移栽至裝有100 g無菌土的盆缽中，每盆1株。

進(jìn)行黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的保護(hù)效果試驗(yàn)。分別取質(zhì)量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000 mg/L的黃柏提取物20 mL，灌根處理番茄苗，24 h后灌根接種20 mL番茄枯萎病菌孢子懸浮液（5×106 CFU/mL）。

進(jìn)行黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的治療效果試驗(yàn)。每株番茄苗灌根接種20 mL番茄枯萎病菌孢子懸浮液（5×106 CFU/mL），24 h后分別取質(zhì)量濃度為16 000、8 000、4 000、2 000、1 000 mg/L的黃柏提取物20 mL，灌根處理番茄苗。以50%多菌靈處理作為化學(xué)藥劑對(duì)照，以清水處理作為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)設(shè)3盆番茄，常規(guī)管理，于30 d后調(diào)查病情，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下。0級(jí)：無癥狀；1級(jí)：1或2片葉子明顯變黃以致脫落；2級(jí)：3或4片真葉變黃，葉片萎蔫下垂；3級(jí)：5或6片真葉變黃，或真葉萎蔫下垂；4級(jí)：全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死[10]。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×代表級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高代表級(jí)值）×100；

防治效果=（1-試驗(yàn)區(qū)病情指數(shù)/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1黃柏提取物對(duì)菌絲生長的抑制作用

在含有不同質(zhì)量濃度黃柏提取物的培養(yǎng)液中生長的番茄枯萎病菌菌絲，其質(zhì)量受到不同程度的抑制。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，經(jīng)黃柏提取物處理的菌絲，其平均干質(zhì)量在0.05水平與對(duì)照存在顯著差異，且黃柏提取物各質(zhì)量濃度處理間也存在顯著差異。其中，質(zhì)量濃度為32 000 mg/L的黃柏提取物處理對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，抑制率高達(dá) 80.42%；質(zhì)量濃度為8 000 mg/L的處理對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制率不到50%。可見，黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌菌絲的抑菌作用與提取物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，抑菌效果隨著質(zhì)量濃度的降低而減弱。

2.2黃柏提取物對(duì)菌絲的抑制中濃度（MIC）

分別以黃柏提取物的質(zhì)量濃度、對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制率為坐標(biāo)軸，得到抑制率變化趨勢(shì)曲線，其相關(guān)擬合方程為y=0.049 3x+0.128 9。根據(jù)此方程計(jì)算抑制率達(dá)到50%時(shí)黃柏提取物的質(zhì)量濃度，即抑制中濃度（MIC）為 7 530 mg/L（圖1）。

2.3黃柏提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病孢子萌發(fā)的抑制作用見表2，不同質(zhì)量濃度的黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病孢子的萌發(fā)均有一定抑制作用。質(zhì)量濃度為16 000 mg/L時(shí)抑制作用最顯著，抑制率達(dá)到100%，完全抑制了番茄枯萎病菌孢子的萌發(fā)；質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí)抑制作用不顯著，抑制率僅為 14.29%，抑制作用隨著質(zhì)量濃度的降低而減弱。

2.4黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病的防效試驗(yàn)

由表3可知，對(duì)照處理中番茄枯萎病的病情指數(shù)為 94.44，表明盆栽試驗(yàn)中對(duì)照處理的發(fā)病程度較嚴(yán)重。在保護(hù)作用的測(cè)定中，不同質(zhì)量濃度黃柏提取物的防治效果存在一定差異。黃柏提取物對(duì)番茄具有一定保護(hù)作用，能夠抑制番茄枯萎病菌的侵染，防治效果隨黃柏提取物質(zhì)量濃度的增大而提高，16 000 mg/L時(shí)防治效果達(dá)73.53%，顯著高于常規(guī)化學(xué)藥劑多菌靈。在治療作用的測(cè)定中，不同質(zhì)量濃度黃柏提取物的防治效果存在一定差異，且防治效果隨質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢(shì)；在相同質(zhì)量濃度處理下，治療防治效果均低于保護(hù)防治效果?？梢?，質(zhì)量濃度為16 000 mg/L的黃柏提取物處理表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)防治效果。

3結(jié)論與討論

生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、不易使害蟲和病菌產(chǎn)生抗藥性、對(duì)環(huán)境友好、對(duì)人畜安全、不殺傷天敵、易分解的優(yōu)點(diǎn)，新型生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)已成為農(nóng)藥發(fā)展的重要方向，具有巨大發(fā)展?jié)摿?。近年來，?duì)番茄枯萎病生物防治的研究主要集中于生防菌，已報(bào)道的有木霉菌、非致病尖孢鐮刀菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等[1，11]，而關(guān)于抑菌植物的應(yīng)用和研究極少。目前已報(bào)道的對(duì)番茄枯萎病具有顯著抑制作用的植物主要有月腺大戟、大蒜。月腺大戟根總黃酮純化物對(duì)番茄枯萎病菌具有顯著抑制作用，且抑制率隨總黃酮濃度的升高而增加[11]。謝成俊研究表明，大蒜素?fù)]發(fā)油2 000倍液對(duì)番茄枯萎病菌的防治效果為99.12%，抑制作用顯著[12]。月腺大戟、大蒜的抑菌穩(wěn)定性及其在番茄生產(chǎn)中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

中國擁有豐富的藥用植物資源，是開發(fā)植物源農(nóng)藥的理想來源[13]。黃柏是蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥樹皮，具有抗菌、抗滴蟲、治療肝炎、抗?jié)?、抗氧化、抗癌等多種藥理活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[14]，然而幾乎沒有關(guān)于抑制植物病原菌的研究。本研究結(jié)果表明，黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用，且抑制率隨提取物質(zhì)量濃度的升高而增加，抑制中濃度（MIC）為7 530 mg/L。質(zhì)量濃度為16 000 mg/L時(shí)的抑制作用最顯著，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到100%；在盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)防治作用，防治效果達(dá)73.53%，顯著高于常規(guī)化學(xué)藥劑。以黃柏為材料開發(fā)防治番茄枯萎病的植物源殺菌劑，具有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。本試驗(yàn)在黃柏提取物對(duì)番茄枯萎病菌的防治作用方面取得了一定進(jìn)展，而黃柏提取物的抑菌有效成分、作用機(jī)制、抑菌穩(wěn)定性等有待進(jìn)一步研究。

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