陳麗麗++何玲玲++趙雅

摘要：研究了地衣芽孢桿菌W10對煙草的促生作用及對生長相關基因表達的影響，結果表明：W10能明顯增加煙草根長、株高、鮮質(zhì)量；與對照相比，W10處理煙草后茉莉酸信號通路標志基因COI1和調(diào)節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度上調(diào)表達。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；煙草；促生作用；促生機制

中圖分類號：S476.1；S572.04文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0152-03

芽孢桿菌（Bacillus spp.）是植物病害生物防治研究和應用較多的一類生物防治細菌，其生物防治機制主要有營養(yǎng)和空間位點競爭、產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)（如脂肽類抗生素、降解胞壁酶類、細菌素、抗菌蛋白、多肽類化合物等）、溶菌作用、促進植物生長、誘導植物抗病性等方面[1-2]。地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）W10是筆者從根際篩選獲得的1株生物防治細菌，對多種植物病原真菌均有較好的抑制作用，田間防治效果與化學藥劑相當，已明確該菌株的防病機理涉及競爭定殖作用、產(chǎn)生抗菌蛋白和誘導植物產(chǎn)生抗病性[3-9]。但該菌株的促生作用尚不清楚。本研究對地衣芽孢桿菌W10在煙草上的促生作用及分子機制進行了初步研究，旨在為拓寬生物防治細菌地衣芽孢桿菌W10的應用領域奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試煙草和菌株

供試煙草品種三生煙（Nicotiana tabacum L. “Xanthi”）種子由筆者所在實驗室提供；生物防治細菌地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）W10從番茄根際土壤中分離獲得。

1.2培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基NB：5 g聚蛋白胨、3 g牛肉浸膏、1 g酵母膏、10 g蔗糖、1 L水，pH值7.0，用于W10菌株種子活化和搖瓶培養(yǎng)。水瓊脂培養(yǎng)基：15 g瓊脂、1 L水，用于煙草種子培養(yǎng)。1/2 MS培養(yǎng)基：4.42 g MS、30 g蔗糖、2 g植物凝膠、1 L水，pH值5.8，用于煙草培養(yǎng)。

1.3W10菌液制備

將活化的W10接種于150 mL NB中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d得到培養(yǎng)菌液，用平板計數(shù)法測量濃度，調(diào)制成1億 CFU/mL，作為煙草處理菌液。

1.4煙草根長的測量

將三生煙種子在W10菌液中浸泡6 h，然后用15%次氯酸鈉溶液表面消毒10 min，無菌水漂洗3次后，呈直線均勻排列在水瓊脂培養(yǎng)基平板上，豎置于26 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16 h/d光照）。根據(jù)平板擺放位置距離光源遠近，設3個處理，分別為：處理1，距離光源近；處理2，距離光源中等；處理3，距離光源遠。每個處理重復3次（平板），每個平板10粒煙草種子，同時設清水對照（CK）。待處理的煙草種子根長至25 mm左右時，測量各處理根長。

1.5煙草株高和鮮質(zhì)量的測量

將三生煙種子于15%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，用無菌水漂洗3次后，均勻放入1/2MS平板中，并置于26 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照時間16 h/d），出芽后幼苗長至高1～2 cm 時將其輕輕從培養(yǎng)基中連根拔出，用W10菌液處理 6 h，后移入含滅菌營養(yǎng)土的盆缽中，置于溫室培養(yǎng)，設清水對照。距光源遠近設3個處理，每個處理重復3次，每個重復6株煙草。待煙草幼苗三葉一心時測量株高。

上述煙草幼苗長至五葉一心時，用W10菌液澆灌煙草根部，每株10 mL，10 d后測量整株煙草的鮮質(zhì)量。

1.6基因表達分析

1.6.1煙草總RNA提取和檢測W10菌液灌根處理2 d后，取煙草上部嫩葉，采用AxyPrep總RNA提取試劑盒[美國Axygen生物技術（杭州）有限公司]提取煙草葉片總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，分光光度計檢測RNA的純度，質(zhì)量符合要求后計算RNA樣品的濃度（D260 nm×稀釋倍數(shù)×40），RNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2半定量RT-PCR分析取2 μg RNA作為模板，以Oligo（dT）15為引物，用反轉錄酶M-mLV（RNase H—）（Promega公司）合成cDNA。取適量反轉錄產(chǎn)物為模板，進行PCR反應。以在真核生物中高度保守并且組成性表達的EF-1α基因為內(nèi)參。擬PCR擴增的基因有抗病防衛(wèi)反應調(diào)控基因NPR1[10]，茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號通路分子標志基因Thi2.1、COI1，調(diào)節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6[11]。基因名稱、登錄號、上游引物/下游引物、涵蓋長度、PCR反應條件等信息見表1。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

2結果與分析

2.1地衣芽孢桿菌W10對煙草根長的影響

從圖1可見，地衣芽孢桿菌W10對煙草根生長具有明顯的促進作用，其中距離光源近的處理促生作用最明顯，比對照根長增加了105.6%，距離光源較遠的處理也比對照增長36.0%。

2.2地衣芽孢桿菌W10對煙草株高的影響

由圖2可見，經(jīng)地衣芽孢桿菌W10處理后，煙草株高比對照增加了41.2%～76.5%，距離光源越近，煙草株高不斷增加，但促生作用在減少。如近光源處理煙草株高達到了 12 cm，但促生作用只有41.2%；遠光源處理株高雖然只有 10 cm，但促生作用達到了76.5%。

2.3地衣芽孢桿菌W10對煙草鮮質(zhì)量的影響

由圖3可知，地衣芽孢桿菌W10處理后，煙草鮮質(zhì)量明顯增加，比對照增加101.9%～114.6%，且各光源距離處理間差異不明顯，這可能與煙草五葉一心期進行了1次W10菌液灌根有關，W10菌液灌根促進煙草生長，減小了不同光源距離處理間的差異。

2.4煙草中促生相關基因的表達

從圖4可以看出，地衣芽孢桿菌W10菌液處理煙草后，JA信號通路標志基因COI1以及調(diào)節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都能不同程度地被誘導表達，其中COI1、NtEXP2呈組成性本底表達（對照），W10菌液誘導后表達量略有上升。W10菌液處理的煙草中NtEXP6基因表達微弱，但對照檢測不到該基因的表達。多次PCR分析并未發(fā)現(xiàn)抗病防衛(wèi)反應調(diào)控基因NPR1、JA信號通路標志基因Thi2.1的表達。

3結論與討論

目前芽孢桿菌對植物促生作用的報道集中在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[12-15]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[16-18]、蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）[19-20]、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）[21-22]，涉及蔬菜、果樹、小麥、煙草等植物。

而地衣芽孢桿菌的促生作用及機制研究未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌W10對煙草根長、株高、鮮質(zhì)量都有明顯的促生作用，同時也發(fā)現(xiàn)距離光源距離對煙草生長也有一定影響，一般距離光源近的處理生長量較大，這可能是由于近光源位置光照度和溫度都較高，有利于煙草植株的發(fā)育和生長，與光、溫度等環(huán)境因子影響植物內(nèi)源茉莉酸信號的變化[23]有關。本研究中有關根長、株高試驗中，只進行了1次W10菌液處理，誘導強度較小，對煙草的促生作用小，從而導致個別處理和對照間差異不顯著；而鮮質(zhì)量試驗進行了2次誘導處理，誘導強度較大，對煙草的促生作用也大，所有誘導處理和對照間差異均達到顯著水平。因此，地衣芽孢桿菌W10須要多次誘導處理才會具有較好的植物促生作用。

JA和水楊酸（salicylate，SA）信號轉導途徑之間主要模式是拮抗作用，NPR1是SA信號途徑中抗病防衛(wèi)反應的正調(diào)控基因，在許多病原菌防衛(wèi)基因的調(diào)控中起重要作用，它通過SA信號轉導途徑來抑制JA信號轉導，是JA信號途徑的負調(diào)控基因[24]，本研究中W10處理煙草后未能檢測到NPR1基因的表達與此相吻合，說明W10引發(fā)的促生作用涉及JA信號途徑。JA信號通路調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和對脅迫的響應[25]，COI1基因是JA信號途徑中1個關鍵調(diào)控基因，目前為止是所有依賴JA信號響應所必需的[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，COI1經(jīng)W10誘導處理后表達有所增加，說明促生作用與JA信號通路有關。Thi2.1基因常被作為檢測JA信號通路應答的標記基因[27]，但本研究未能檢測到該基因的表達，這可能與該基因的表達水平低以及W10菌液誘導強度不夠有關，也可能是該基因表達與抗性需要病原生物脅迫，還須進一步研究。

調(diào)節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6在枯草芽孢桿菌G1處理煙草1～3 d后能被誘導顯著表達，且NtEXP2基因呈組成性表達[11]，這與本研究結果基本一致，但本研究中這2個基因誘導表達較弱，可能是地衣芽孢桿菌W10誘導處理次數(shù)較少的緣故，或許W10誘導的促生作用還可能由其他生長相關基因控制，這還須進一步研究。JA信號通路標志基因COI1、調(diào)節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度地被地衣芽孢桿菌W10誘導表達，為地衣芽孢桿菌W10的促生作用提供了理論依據(jù)，也拓寬了這類生物防治菌的應用領域。

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