朱曉宇，劉洪翠，俞航萍，郭勝亞，勞喬聰，李春?jiǎn)?/p>

(杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051)

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神香蘇合丸防治心血管疾病的實(shí)驗(yàn)研究

朱曉宇，劉洪翠，俞航萍，郭勝亞，勞喬聰，李春?jiǎn)?/p>

(杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051)

摘要:利用斑馬魚心血管疾病模型研究神香蘇合丸的藥效。用維拉帕米誘導(dǎo)心衰模型評(píng)價(jià)對(duì)心衰心臟功能的改善，用氯化鈷誘導(dǎo)缺氧模型評(píng)價(jià)對(duì)缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力影響，酶標(biāo)法評(píng)價(jià)清除自由基(ROS)效果，用花生四烯酸誘導(dǎo)血栓模型評(píng)價(jià)預(yù)防血栓效果。結(jié)果顯示： 濃度為5、16.7 μg/mL和50 μg/mL的神香蘇合丸對(duì)心衰心臟擴(kuò)大改善率分別為66%、92%和75%，靜脈瘀血改善率45%、49%和13%，心輸出量增加率為55%、59%和51%，血流速度增加率為62%、55%和47%；濃度為15、50 μg/mL和150 μg/mL的神香蘇合丸提高缺氧耐受力分別為15%、28%和46%；濃度為2.67、8 μg/mL和26.7 μg/mL的神香蘇合丸對(duì)ROS清除率分別為78 %、107 %和118 %；濃度為50 μg/mL時(shí)預(yù)防血栓效率為49%。神香蘇合丸對(duì)心臟功能、缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力有改善作用，有抗氧化能力，能預(yù)防血栓形成。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；神香蘇合丸；心臟功能；缺氧；自由基；血栓

0引言

隨著人類生活環(huán)境和膳食習(xí)慣的變化，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年增高[1]。藥物篩選是開發(fā)藥物過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?duì)評(píng)價(jià)與篩選藥物至關(guān)重要。體外模型具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，但其篩選結(jié)果與動(dòng)物及人體的可比性較差。以斑馬魚(Danio rerio)為模型建立的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)彌補(bǔ)了這一不足[2]。

斑馬魚為脊椎動(dòng)物，其心血管系統(tǒng)在分子信號(hào)通路上與人和哺乳動(dòng)物的同源性達(dá)到85%以上，近年來斑馬魚廣泛地被用于心血管疾病研究領(lǐng)域，如心力衰竭、血栓、心律失常、心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化等[3-4]。斑馬魚作為模式動(dòng)物具有很多優(yōu)勢(shì)：胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低，已成功應(yīng)用于藥物藥效學(xué)、毒理學(xué)及藥物代謝等方面的研究[5-10]。神香蘇合丸(Shenxiang Suhe Pill, SSP)由安息香、蘇合香、冰片等味中藥組成。本文應(yīng)用斑馬魚模型，評(píng)價(jià)了神香蘇合丸對(duì)心衰心臟功能改善、缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力改善、清除自由基和預(yù)防血栓效果。

1實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物是野生型AB品系斑馬魚，胚胎的繁殖方式是自然成對(duì)交配。在受精后6 h(hours post fertilization，6 hpf)和24 hpf 移除已死亡胚胎，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選實(shí)驗(yàn)用胚胎[2, 11]。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質(zhì)：pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)；電導(dǎo)率為480～510 μS/cm。因?yàn)榕咛タ蓮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9天內(nèi)(9 dpf)不需要喂食[2, 11]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)為：SYXK(浙)2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

神香蘇合丸(批號(hào)1402202，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供)。CM(LOT1524917，Life Technologies公司)；GSH(批號(hào)45463，阿拉丁)；維拉帕米(批號(hào)E1216038，阿拉丁)；地高辛(批號(hào)D102298，阿拉丁)；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)67-68-5，Sigma)；阿司匹林(批號(hào)059K0199，阿拉丁)；鄰聯(lián)茴香胺(批號(hào)MKBG4648V，Sigma)；花生四烯酸(批號(hào)F1418031，阿拉丁)；MESAB(批號(hào)20110216，Sigma)；甲基纖維素(批號(hào)20110521，Sigma)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

解剖顯微鏡(SMZ645，Nikon，Japan)；6孔板(Nest Biotech，Shanghai，China)；96孔板(Nest Biotech，Shanghai，China)；行為分析儀(V3，Viewpoint Life Sciences，F(xiàn)rance)；多功能酶標(biāo)儀(Mithras LB940，Berthold Technologies)；心跳血流分析系統(tǒng)(Zebralab3.3(PB2084C)，Viewpoint Life Sciences，F(xiàn)rance)；精密電子天平(CP214，奧豪斯)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1心衰心臟功能的改善作用評(píng)價(jià)

挑取150尾發(fā)育正常的4 dpf野生型AB品系斑馬魚幼魚，用200 μM維拉帕米處理4 h建立斑馬魚心衰模型；造模后分別用濃度為5、16.7 μg/mL和50 μg/mL的神香蘇合丸處理3 h；每個(gè)濃度均處理30尾斑馬魚。同時(shí)設(shè)置模型組和空白組，陽性對(duì)照組給予0.1 μg/mL地高辛。藥物處理結(jié)束后，每組隨機(jī)取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下檢測(cè)斑馬魚心輸出量(O)和血流速度(V)；然后用0.16 mg/mL MESAB進(jìn)行麻醉，在顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算心臟擴(kuò)大面積(A)和靜脈淤血面積(B)，定量評(píng)價(jià)神香蘇合丸對(duì)心衰心臟功能的改善作用。計(jì)算公式如下：

a)對(duì)心衰引起的心包水腫的治療作用：

心臟擴(kuò)大改善率(%)

b)對(duì)心衰引起的靜脈瘀血的改善：

靜脈瘀血改善率(%)

c)對(duì)心輸出量的影響：

心輸出量增加率(%)

d)對(duì)血流速度的影響：

血流速度增加率(%)

1.2.2 缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力的影響評(píng)價(jià)

挑取150尾發(fā)育正常的受精后5 d(5 dpf)野生型AB品系斑馬魚幼魚，用濃度為15、50 μg/mL和150 μg/mL的神香蘇合丸預(yù)處理2 h后，加入氯化鈷造成缺氧模型，每個(gè)濃度處理30尾斑馬魚。同時(shí)設(shè)置模型組和空白組，神香蘇合丸和氯化鈷共同處理24 h后，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于行為分析儀中，檢測(cè)斑馬魚在缺氧條件1 h內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離(D)，計(jì)算缺氧耐受力改善率，定量評(píng)價(jià)神香蘇合丸對(duì)斑馬魚的抗缺氧能力。計(jì)算公式如下：

缺氧耐受力改善率(%)

1.2.3清除自由基(ROS)效果評(píng)價(jià)

挑取70尾發(fā)育正常的受精后4 d(4 dpf)野生型AB品系斑馬魚幼魚，用ROS特異性熒光檢測(cè)試劑處理20 h，建立斑馬魚檢測(cè)自由基(ROS)模型；用濃度為8、26.7 μg/mL和80 μg/mL的神香蘇合丸處理模型組斑馬魚20 h；每個(gè)濃度均處理10 尾斑馬魚。同時(shí)設(shè)置模型組，陽性對(duì)照組給予100 μM谷胱甘肽。藥物處理結(jié)束后，每組隨機(jī)取8尾斑馬魚置于96 孔酶標(biāo)板，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行熒光(F)定量分析，化合物對(duì)ROS影響的藥效學(xué)計(jì)算公式如下：

ROS清除率(%)

1.2.4預(yù)防血栓效果評(píng)價(jià)

挑取150尾發(fā)育正常的受精后3 d(3 dpf)黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚幼魚，用濃度為5、16.7 μg/mL和50 μg/mL的神香蘇合丸預(yù)先處理3 h；然后用80 μM花生四烯酸處理1.5 h建立斑馬魚血栓模型；每個(gè)濃度均處理30尾斑馬魚。同時(shí)設(shè)置模型組和空白組，陽性對(duì)照組給予22.5 μg/mL阿司匹林。藥物處理結(jié)束后，用鄰聯(lián)茴香胺染色液染色，每組隨機(jī)挑選10尾斑馬魚在顯微鏡下觀察、拍照；計(jì)算心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度(S)，定量評(píng)價(jià)神香蘇合丸對(duì)血栓的預(yù)防作用。計(jì)算公式如下：

預(yù)防血栓藥效(%)

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1心衰心臟功能的改善作用

維拉帕米誘導(dǎo)的心衰模型組斑馬魚表現(xiàn)出心臟擴(kuò)大、靜脈淤血、心輸出量減少和血流速度減少。0.1 μg/mL地高辛治療后，斑馬魚心臟擴(kuò)大和靜脈淤血明顯改善，心輸出量和血流速度明顯增加，其心臟擴(kuò)大改善率為70%，靜脈瘀血改善率為38%，心輸出量增加率為34%，血流速度增加率為37%，各組與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P< 0.05，P<0.01，P< 0.001)。濃度為5、16.7 μg/mL和50 μg/mL神香蘇合丸治療后，斑馬魚心臟擴(kuò)大和靜脈淤血明顯改善，心輸出量和血流速度明顯增加，其心臟擴(kuò)大改善率分別為66%、92%和75%，靜脈瘀血改善率分別為45%、49%和13%，心輸出量增加率分別為55%、59%和51%，血流速度增加率分別為62%、55%和47%；與模型組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均顯著(P< 0.05,P< 0.01，P< 0.001)(表1，圖1)，說明神香蘇合丸對(duì)心衰具有很好的心臟功能改善作用。

表1　神香蘇合丸對(duì)心衰心臟功能的改善作用± s)

注：與模型組相比，*表示P< 0.05,**表示P< 0.01，***表示P< 0.001。

圖1　神香蘇合丸心衰心臟功能改善表型圖

圖1中黑色虛線區(qū)域?yàn)樾呐K面積，白色虛線區(qū)域?yàn)殪o脈淤血面積。模型組斑馬魚與空白組比較，心臟明顯擴(kuò)大且靜脈淤血嚴(yán)重；0.1 μg/mL地高辛組斑馬魚心臟擴(kuò)大和靜脈淤血明顯改善；濃度為5、16.7 μg/mL和50 μg/mL神香蘇合丸處理后，斑馬魚心臟擴(kuò)大和靜脈淤血明顯改善。

2.2評(píng)價(jià)對(duì)缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力的影響

氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧模型組斑馬魚運(yùn)動(dòng)距離為(4056±203)mm，與空白對(duì)照組(9540±215)mm比較，P< 0.001。濃度為15、50 μg/mL和150 μg/mL 的神香蘇合丸顯著增加斑馬魚運(yùn)動(dòng)距離，缺氧耐受力改善率分別為15%、28%和46%，各組與模

型對(duì)照組比較，P< 0.05 &P< 0.001(表2)，說明神香蘇合丸具有很好的改善缺氧運(yùn)動(dòng)耐受力的作用。

表2　神香蘇合丸對(duì)缺氧耐受力的改善作用

注：與模型組相比，*表示P< 0.05 ，***表示P< 0.001。

2.3評(píng)價(jià)清除自由基(ROS)效果

100 μM谷胱甘肽ROS清除率為99%，與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)；神香蘇合丸在濃度為2.67、8 μg/mL和26.7 μg/mL時(shí)，ROS清除率分別為78 %、107 %和118 %，與空白組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)(表3)，說明神香蘇合丸的抗氧化能力很強(qiáng)，不但可以清除斑馬魚體內(nèi)的ROS，還能降低ROS染料在空氣中的氧化，故其ROS清除率大于100%。

表3　神香蘇合丸清除ROS效果

注：與空白組相比，**表示P< 0.01。

2.4評(píng)價(jià)預(yù)防血栓效果

阿司匹林預(yù)防血栓效率為64%(P< 0.001)；神香蘇合丸在濃度5 μg/mL和16.7 μg/mL時(shí)，預(yù)防血栓效率為-3%和7%，與模型組相比，P≥ 0.05；濃度為50 μg/mL時(shí)，預(yù)防血栓效率為49%，與模型組相比，P< 0.001(表4)，說明神香蘇合丸具有很好的血栓預(yù)防效果。

表4　神香蘇合丸預(yù)防血栓效果

注：與模型組相比，***表示P< 0.001。

3討論

冠心病主要病因?yàn)樾募∪毖?、缺氧，自由基生成、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損，嚴(yán)重者可引發(fā)心衰[12]。神香蘇合丸是杭州胡慶余堂制藥廠研制而成的，由11種常用中藥組成，如蘇合香、安息香、麝香、冰片等[13]，在治療冠心病及老年性冠心病無癥狀心肌缺血等追蹤觀察中取得良好臨床療效[14]。陳鐸葆等[13]評(píng)價(jià)了神香蘇合丸對(duì)大鼠心肌缺血的硬性，結(jié)果表明神香蘇合丸能明顯緩解實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血，并有效減少心律失常的發(fā)生，且對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響較小。胡永獅等[15]觀察研究了神香蘇合丸對(duì)狗急性心肌梗塞的影響，結(jié)果顯示神香蘇合丸可顯著降低狗急性心肌梗塞及其誘導(dǎo)心電圖ST-T的抬高程度，并縮小心肌梗塞范圍。

斑馬魚在靶點(diǎn)鑒別、疾病模型及毒性評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛[16-17]。本實(shí)驗(yàn)首先利用斑馬魚心衰模型評(píng)價(jià)神香蘇合丸的心臟功能改善作用，結(jié)果證實(shí)，神香蘇合丸對(duì)心臟功能具有顯著的改善作用，不僅能夠明顯改善心臟擴(kuò)大和靜脈瘀血，而且可顯著增加心輸出量和血流速度，耐缺氧實(shí)驗(yàn)也顯示神香蘇合丸能顯著改善斑馬魚在缺氧條件下的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，說明神香蘇合丸對(duì)缺氧也具有改善功能。這些結(jié)果與哺乳動(dòng)物研究非常吻合。

斑馬魚血小板與人類血小板在生理功能方面具有相似性[18-22]。神香蘇合丸中安息香、麝香、冰片均具有開竅通絡(luò)、活血散瘀作用，本研究實(shí)驗(yàn)也證實(shí)神香蘇合丸能預(yù)防血栓的形成。自由基是生物體內(nèi)影響信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，與許多衰老相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展預(yù)防和治療相關(guān)，如心血管疾病、老年癡呆、腫瘤、糖尿病等[23]。ROS存在于斑馬魚體內(nèi)，是斑馬魚體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，能被特異性熒光檢測(cè)試劑檢測(cè)出來，所以斑馬魚能被用作ROS檢測(cè)的模型動(dòng)物[24]。本研究結(jié)果顯示，神香蘇合丸清除ROS效果顯著，具有很好的抗氧化能力。

模式動(dòng)物斑馬魚與人類基因高度相似，且具有活體、高通量的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于中藥及其復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究、藥物代謝、藥效成分快速發(fā)現(xiàn)及毒性安全性評(píng)價(jià)等方面[25-27]，在中藥新藥研究領(lǐng)域具有較廣的應(yīng)用前景。斑馬魚模型將憑借自身優(yōu)勢(shì)對(duì)新藥藥物發(fā)現(xiàn)和早期篩選模型是一個(gè)有力的補(bǔ)充。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Experimental Study on Therapeutic Effects of Shenxiang Suhe Pill on Cardiovascular Diseases

ZHUXiaoyu,LIUHongcui,YUHangping,GUOShengya,LAOQiaocong,LIChunqi

(Hangzhou Hunter Biotechnology Co., Ltd., Hangzhou 310051, China)

Abstract：In this study, we have assessed therapeutic effects of Shenxiang Suhe pill on cardiovascular diseases by zebrafish cardiovascular disease model. Verapamill-induced heart failure model was applied to evaluate the improvement of the function of heart with hear failure. Cobalt chloride induced hypoxia model was used to evaluate the influence on tolerance of anaerobic exercise. Enzyme linked immunosorbent assay was used to assess the effect on free radical scavenging (ROS). Arachidonic acid induced thrombosis model was applied to evaluate thrombosis prevention effect. The results show that the improvement rates of Shenxiang Suhe pill with the concentration of 5, 16.7 and 50 μg/mL on the heart with heart failure are 66%, 92% and 75%, respectively; the improvement rates of venous congestion are 45%, 49% and 13%, respectively; the increasing rates of cardiac output are 55%, 59% and 51%, respectively; and the increasing rates of blood flow velocity are 62%, 55% and 47%, respectively. The improvement rates of Zebrafish; Shenxiang Suhe pill with the concentration of 15, 50 and 150 μg/mL on hypoxia tolerance are 15%, 28% and 46%, respectively. ROS clearance percentages of Zebrafish; Shenxiang Suhe pill with the concentration of 2.67, 8 and 26.7 μg/mL are 78 %, 107 % and 118 %, respectively. When the concentration is 50 μg/mL, thrombosis prevention efficiency is 40%. Shenxiang Suhe pill has improvement function on heart function and hypoxia tolerance, owns oxidation resistance ability and can prevent thrombosis.

Key words：Zebrafish; Shenxiang Suhe pill; heart function; hypoxia; ROS; thrombosis

DOI:10.3969/j.issn.1673-3851.2016.07.026

收稿日期：2015-09-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家火炬計(jì)劃項(xiàng)目(gjxm69)

作者簡(jiǎn)介：朱曉宇(1985-)，女，山東菏澤人，碩士，主要從事藥理毒理學(xué)方面的研究。 通信作者： 李春?jiǎn)?，E-mail: jackli@ zhunter.com

中圖分類號(hào)：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673- 3851 (2016) 04- 0630- 06 引用頁碼： 070703