張學(xué)勇簡(jiǎn)瑩娜馬利青

(1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 西寧 810016;2. 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

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三種隱孢子蟲鈣依賴蛋白激酶的生物信息學(xué)分析

張學(xué)勇1，2，簡(jiǎn)瑩娜1，2，馬利青1，2*

(1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 西寧 810016;2. 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

摘要：對(duì)三種隱孢子蟲(C. parvum Iowa II、 C. hominis TU502和C. muris RN66)鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索該蛋白的結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)其功能，為其基因功能的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。通過(guò)隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)收集數(shù)據(jù)，獲得三種隱孢子蟲CDPKs蛋白的序列信息，通過(guò)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)該蛋白的理化性質(zhì)、翻譯后修飾位點(diǎn)、功能域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親/疏水性、抗原表位等。隱孢子蟲CDPKs的蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定，理論分子量從59.76 kDa到76.63 kDa，pI值為5.33～6.09，CDPKs不具有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，不是跨膜分泌性蛋白，都具有蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、N-端糖基化位點(diǎn)、N-端肉豆蔻?；稽c(diǎn)和EF-hand鈣結(jié)合域，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主；CDPKs主要存在蟲體細(xì)胞內(nèi)，均有20多個(gè)潛在的抗原表位。在隱孢子蟲中，CDPKs蛋白不僅可單獨(dú)發(fā)揮作用，而且還能通過(guò)相互結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；同時(shí)，CDPKs有望成為候選疫苗及潛在藥物靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：隱孢子蟲；鈣依賴蛋白激酶；生物信息學(xué)；蛋白結(jié)構(gòu)；功能預(yù)測(cè)

隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)是一種呈世界性分布的人獸共患寄生性原蟲，已成為世界范圍內(nèi)水源性傳播疾病中的重要病原體，它們能感染人、家畜和野生動(dòng)物，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的健康及畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。因?yàn)殡[孢子蟲是機(jī)會(huì)性致病病原體，在免疫功能低下的個(gè)體中常常出現(xiàn)暴發(fā)性或慢性、長(zhǎng)期性感染，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)死亡，且目前尚無(wú)有效的預(yù)防治療方法[2]。隨著三株隱孢子蟲(C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66)全基因組測(cè)序工作的完成[3-4]，這將更有利于對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和功能的研究。

鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，此激酶接收并傳導(dǎo)Ca2+信號(hào)且其活性受Ca2+的調(diào)控而不依賴鈣調(diào)素和磷脂。典型的CDPK分子是由四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的多肽鏈，包括N末端的可變結(jié)構(gòu)域(N-terminal variable domain)、激酶活性結(jié)構(gòu)域(Kinases domain)、連接結(jié)構(gòu)域(Junction domain，JD)和C末端鈣調(diào)素類似結(jié)構(gòu)域(CaM-like domain，CLD)[5]，其參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控。

由于哺乳動(dòng)物中不存在CDPKs的同源蛋白，所以CDPKs是理想的抗隱孢子蟲的候選藥靶。為了更好地分析這類蛋白激酶的功能及對(duì)隱孢子蟲的重要意義，本文對(duì)隱孢子蟲CDPKs蛋白的結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能及其在疫苗和藥靶研究中的應(yīng)用提供線索。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)收集

在隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://cryptodb.org/cryptodb/)中“Gene Text Search”信息欄輸入并搜索CDPK，收集C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66基因組中的CDPKs，獲取各蛋白相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列及蛋白序列。

1.2結(jié)構(gòu)域分析與驗(yàn)證

將搜索獲得的蛋白序列輸入到NCBI結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中進(jìn)行各蛋白的結(jié)構(gòu)域搜索，以進(jìn)一步確定分析CDPKs結(jié)構(gòu)域；而后用在線搜索工具Pfam(http://pfam.xfam.org/)驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果。

1.3蛋白質(zhì)特性預(yù)測(cè)

將各個(gè)蛋白序列輸入到ExPASy(http://www.expasy.org/)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中，進(jìn)行蛋白特性預(yù)測(cè)。采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成等理化性質(zhì)；采用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序分析亞細(xì)胞定位序列等特征序列：分泌信號(hào)肽、質(zhì)體、線粒體和過(guò)氧化物酶體等；采用Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)程序預(yù)測(cè)糖基化、磷酸化、脂?；?、cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)及EF-hand鈣結(jié)合域等修飾位點(diǎn)和模序。

1.4蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位分析

利用DAS-TMfilter server(http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html)、HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/index.php)和TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白的跨膜區(qū)域，應(yīng)用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的親/疏水性。采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用Predicted Antigenic Peptides(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)進(jìn)行抗原表位分析。

1.5序列比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

通過(guò)NCBI提供的BLAST在線搜索服務(wù)軟件獲取頂復(fù)門寄生原蟲弓形蟲(ToxoplasmagondiiME49)、瘧原蟲(Plasmodiumreichenowi)、巴貝斯蟲(Babesiabovis)、球蟲(Eimeriatenella)及隱孢子蟲(C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66)CDPKs的氨基酸序列。使用MEGA5.05軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行分析，選擇鄰近法(Neighbor-Joining method, NJ)構(gòu)建系系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用自展值(Bootstrap)檢驗(yàn)其可靠性，重復(fù)次數(shù)為2 000，分析不同頂復(fù)門寄生原蟲CDPKs基因間的進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果分析

2.1含CDPK結(jié)構(gòu)域蛋白的初篩和確定

在隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的全基因組中搜索獲得15個(gè)含有CDPK的結(jié)構(gòu)域蛋白，根據(jù)注釋描述分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)假設(shè)蛋白(Hypothetical/putative protein)，除去這些假設(shè)蛋白，將剩余的10個(gè)蛋白序列輸入到NCBI結(jié)構(gòu)域網(wǎng)站中搜索CDPK結(jié)構(gòu)域后，只有6個(gè)蛋白是真正的CDPK蛋白，為進(jìn)一步確認(rèn)淘汰的是否是CDPK蛋白，將其輸入到pfam結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果仍不是CDPK蛋白。因此，對(duì)這6個(gè)真正的CDPK蛋白進(jìn)行深入分析。

2.2蛋白基本性質(zhì)分析

經(jīng)過(guò)ExpASy在線系統(tǒng)分析，如表1所示這些蛋白的基本性質(zhì)：其在氨基酸長(zhǎng)度、分子量大小和等電點(diǎn)上差異不大，其氨基酸長(zhǎng)度在523～677 aa，分子量從59.76 kDa到76.63 kDa，pI值從5.33～6.09，呈現(xiàn)著明顯的區(qū)別。帶正(12.35%～14.91%)、負(fù)(14.03%～16.25%)電荷氨基酸殘基數(shù)占氨基酸總數(shù)比例基本一致，且?guī)д姾砂被釟埢葞ж?fù)電荷氨基酸殘基多。假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，CDPKs在280 nm處的摩爾消光系數(shù)：46 215～87 500 L/mol·cm及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值：0.773～1.128；假定所有的二硫鍵打開時(shí)，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)：45 840～86 750 L/mol·cm及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值為：0.767～1.119，可見其吸光性質(zhì)有所差別。CDPKs在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為：37.46～45.06，除Cgd5_820外均高于閾值40，推測(cè)CDPKs為不穩(wěn)定蛋白。CDPKs的脂肪族指數(shù)為：84.38～87.58，親水性平均系數(shù)：-0.397～-0.486，蛋白總體親水性較低。

表1　CDPKs基本性質(zhì)分析

注：A*：假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)值(L/mol·cm)及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值；

B*：假定所有的二硫鍵打開時(shí)，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數(shù)值(L/mol·cm)及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值。

2.3 翻譯后修飾和結(jié)構(gòu)特征性序列分析

模序分析潛在的翻譯后修飾位點(diǎn)顯示(如表2)，CDPKs蛋白含有糖基化位點(diǎn)：1～3個(gè)，糖基化位點(diǎn)保證CDPKs能夠正確折疊且可以傳導(dǎo)信號(hào)。蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)：6～9個(gè)；酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)：11～14個(gè)；酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)：1～2個(gè)；cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)：1～3個(gè)；這可以促進(jìn)其和其他蛋白質(zhì)相互作用而形成多蛋白復(fù)合體，再進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的磷酸化。N端肉豆蔻酰化位點(diǎn)：2～5個(gè)； EF-hand鈣結(jié)合域：7～8個(gè)；EF-hand結(jié)構(gòu)域能與Ca+2離子結(jié)合而改變構(gòu)象，進(jìn)而暴露靶結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。這些結(jié)構(gòu)特征性序列如表2所示，表明CDPKs具有重要的生物學(xué)功能。

2.4蛋白的亞細(xì)胞定位、抗原表位和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

對(duì)CDPKs的信號(hào)肽和信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)的預(yù)測(cè)顯示(如表3), 它們的序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)分值為：0.043～0.280，cutoff預(yù)測(cè)值均為0(< 0. 9) ，表明CDPKs序列無(wú)信號(hào)肽和信號(hào)肽酶剪切位點(diǎn)。CDPKs的亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，CDPKs序列定位于線粒體的部分得分為：0.063～0.274(< 0. 9) ，而定位于其他部分的得分為：0.678～0.954(> 0. 95)，說(shuō)明CDPKs序列沒(méi)有線粒體等定位序列，且該預(yù)測(cè)具有較高可信度。CDPKs的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)α螺旋比例為：34.62%～49.33%，β折疊比例為：7.53%～11.66%，無(wú)規(guī)則卷曲比例為：23.14%～34.17%，延伸鏈比例為：13.86%～21.30%，可見CDPKs的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。對(duì)CDPKs蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位做進(jìn)一步分析, 顯示有20～29個(gè)潛在的抗原表位，且平均抗原傾向性均大于1.000，CDPKs蛋白含有較多的優(yōu)勢(shì)抗原表位結(jié)構(gòu)，可作為一種免疫原性蛋白。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過(guò)MAGE5.05軟件構(gòu)建的NJ 樹如圖1所示，其中用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的3種隱孢子蟲分析序列分為3個(gè)類群，有意思的是它們均與ToxoplasmagondiiME49聚為一支，可見在系統(tǒng)發(fā)育樹上發(fā)現(xiàn)它們之間的進(jìn)化距離最近。并且Chro.20142、cgd2_1300和Chro.70214、cgd7_1840一致性最高，可見C.parvumIowaII和C.hominisTU502的親緣關(guān)系較近。這為后續(xù)從分子遺傳學(xué)角度探索CDPKs的功能及其作為候選藥靶和疫苗提供了新的思路。

表2　翻譯后修飾和結(jié)構(gòu)特征性序列分析

表 3　亞細(xì)胞定位和抗原表位分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

3討論

CDPKs是一類屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在各種植物和原生動(dòng)物中廣泛存在并參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控。如在植物中，CDPKs參與離子泵/離子通道的開合、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)錄和新陳代謝等過(guò)程的調(diào)控[6]。隨著原生生物基因組測(cè)序工作的開展，在弓形蟲、瘧原蟲等頂復(fù)門原蟲中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)CDPKs同源蛋白[5]。在弓形蟲和瘧原蟲研究中發(fā)現(xiàn)，CDPKs參與調(diào)控弓形蟲蟲體入侵細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)、分化和蛋白分泌等生理過(guò)程；瘧原蟲的CDPKs可調(diào)控其入侵按蚊小腸上皮細(xì)胞和在宿主體內(nèi)發(fā)育等過(guò)程。Manja Etzold等實(shí)驗(yàn)研究表明，隱孢子蟲的CDPKs具有階段性表達(dá)特征，CDPKs在隱孢子蟲的生長(zhǎng)發(fā)育以及進(jìn)化過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用[7]。同時(shí)，研究表明在哺乳動(dòng)物中不存在CDPKs，所以CDPKs可以作為有效的疫苗和藥靶研究候選分子[8-9]。

圖1　隱孢子蟲與其他頂復(fù)門寄生原蟲CDPKs的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲的CDPKs是不具備分泌信號(hào)肽的疏水性蛋白，推測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)合成后可以直接發(fā)揮生物學(xué)功能。蛋白的多肽鏈合成后，不具有生物學(xué)活性，翻譯完成后需要經(jīng)過(guò)一系列的加工形成相對(duì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮生物學(xué)功能；通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，CDPKs由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。多項(xiàng)研究表明，蛋白質(zhì)的去磷酸化和磷酸化對(duì)于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)十分重要，可以調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程活動(dòng)[10]；對(duì)隱孢子蟲的CDPKs分析發(fā)現(xiàn)，CDPKs具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，如蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。同時(shí)，N-端糖基化位點(diǎn)與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白定位粘附密切相關(guān)[11]，N-端肉豆蔻?；稽c(diǎn)也參與蛋白的定位過(guò)程[12]；對(duì)隱孢子蟲的CDPKs研究發(fā)現(xiàn)，其具有N-端糖基化位點(diǎn)和N-端肉豆蔻酰化位點(diǎn)。同時(shí)CDPKs均具有EF-hand結(jié)構(gòu)域，其能與Ca2+結(jié)合從而促使CDPKs的構(gòu)象改變，從而發(fā)揮Ca2+依賴蛋白激酶蛋白的各種功能[13]。本研究對(duì)CDPKs的抗原表位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，均具有20多個(gè)，可能成為抗隱孢子蟲感染疫苗的有效成分之一。因此，對(duì)CDPKs的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和分析，在該蛋白功能的進(jìn)一步研究具有重要意義。

4結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了三種隱孢子蟲的CDPKs的基本性質(zhì)，蛋白翻譯后的修飾和結(jié)構(gòu)特征性序列，及其亞細(xì)胞定位、抗原表位和二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征；此外，通過(guò)遺傳關(guān)系比較分析，三種隱孢子蟲的CDPKs均與弓形蟲的聚在一起，可借鑒弓形蟲的相關(guān)成果來(lái)研究隱孢子蟲的CDPKs。研究發(fā)現(xiàn)，在瘧原蟲(Plasmodiumreichenowi)、巴貝斯蟲(Babesiabovis)、球蟲(Eimeriatenella)等頂復(fù)門原蟲中都存在CDPKs蛋白，同時(shí)，該蛋白與蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和入侵及其生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。因此，CDPKs基因有望成為研制隱孢子蟲基因工程疫苗的候選基因以及抗隱孢子蟲的潛在藥物靶點(diǎn)。

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Function analysis of Calcium-dependent protein kinases inCryptosporidiumbased on bioinformatics

ZHANG Xueyong1，2, JIAN Yingna1，2, MA Liqing1，2*

(1.TheAcademyofAnimalandVeterinarySciences,QinghaiUniversity,Xining810016,China;2.QinghaiAcademyofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine,Xining810016,China)

Abstract：The propose of this study is to conduct bioinformatics analysis about the calcium-dependent protein kinases of Cryptosporidium(C.parvum Iowa II,C.hominis TU502 and C.muris RN66),and to explore the structures and predict the functions of the protein family for the studies of genetic function of Cryptosporidium offering theoretical basis. The protein sequences of Cryptosporidium CDPKs were obtained from the Genome Database and then the bioinformatics softwares were used to analyze and predict the physico-chemical properties of the proteins, such as post-translational modification sites, functional domains, subcellular localization, secondary structure, hydrophilicity/hydrophobicity and epitopes.The proteins had unstable physico-chemical characteristics. The theoretical molecular weight of the deduced proteins were from 59.76 to 59.76 kDa, theoretical pI from 5.33 to 6.09,no transmembrane regions and signal peptides, all had N-glycosylation sites, protein kinase C phosphorylation sites, casein kinase II phosphorylation sites, Tyrosine kinase phosphorylation sites,N-myristoylation sites,cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites and EF-hand calcium-binding domains; Secondary structure mainly were alpha helix and random coil;CDPKs mainly exist in body cells,had more than 20 potential antigen epitopes.In Cryptosporidium,CDPKs were able to work alone, but also through mutual supports exert biological effects,meanwhile CDPKs will promise to be vaccine candidates and potential drug targets.

Keywords：Cryptosporidium；Calcium-dependent protein kinases；Bioinformatics；Protein structure；Function prediction

收稿日期：2016-03-06；修回日期：2016-04-15.

基金項(xiàng)目：國(guó)家外專局“外專千人計(jì)劃”專項(xiàng)基金項(xiàng)目(No.WQ20136300172)。

作者簡(jiǎn)介：張學(xué)勇，男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，研究方向：動(dòng)物疫病的診斷和防治；E-mail：zhang_xyong@163.com. *通信作者：馬利青，男，研究員，研究方向：動(dòng)物疫病的診斷和防治；E-mail：maliq67@hotmail.com.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.03

中圖分類號(hào)：Q51

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5565(2016)02-078-06