黃艷青，劉港彪，王 利*

(1. 農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所)，上海 200090；2. 國家民委-教育部重點實驗室(西南民族大學生命科學與技術學院)，成都 610041)

?

鮰愛德華菌外膜蛋白OmpLC基因的生物信息學分析

黃艷青1，劉港彪2，王 利2*

(1. 農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所)，上海 200090；2. 國家民委-教育部重點實驗室(西南民族大學生命科學與技術學院)，成都 610041)

摘要：采用PCR方法從鮰愛德華菌基因組中擴增出外膜蛋白OmpLC基因，利用生物信息學相關軟件和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，預測該基因編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)、親疏水性、信號肽、跨膜性、二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域及基序、以及三級結(jié)構(gòu)，同時構(gòu)建OmpLC同源基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果表明：該蛋白由360個氨基酸組成，分子量為39.407 kD，理論等電點為4.98，不穩(wěn)定系數(shù)為18.26，是一種穩(wěn)定的強親水性蛋白，有信號肽，成熟蛋白無跨膜螺區(qū)。其二級結(jié)構(gòu)中α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲分別占6.67%、45.28%和48.06%，其空間結(jié)構(gòu)為β桶狀，屬于OM_channels superfamily的gram_neg_porins成員。蛋白質(zhì)多重序列比對和聚類分析顯示，該蛋白序列與OmpLC 蛋白(AEQ59632、AEQ59639)具有高度同源性，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上與二者聚為一簇。鮰愛德華菌OmpLC的生物信息學分析不僅為進一步探索該蛋白的功能提供參考資料，也為研究鮰愛德華菌的感染和致病機理，研制相關疫苗提供理論依據(jù)。

關鍵詞：鮰愛德華菌；外膜蛋白；結(jié)構(gòu)預測；生物信息學

鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)愛德華菌屬(Edwardsiella)的一種革蘭氏陰性短桿菌，該菌主要感染鯰形目魚類[1]。已有報道該菌曾引發(fā)黃顙魚的紅頭病、斑點叉尾鮰腸型敗血癥(Enteric septicemia of catfish，ESC)[2-3]，在其它非鯰形目魚類也可以被感染，如在虹鱒魚、鱉也見報道[4-5]。鮰愛德華氏菌病具有發(fā)病急、發(fā)病率和死亡率高的特點，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的加大，該菌對淡水魚類的養(yǎng)殖危害日益嚴重，但目前控制該菌引起的相關疾病主要以抗生素為主，存在細菌耐藥性增強、水體藥物污染、引發(fā)食品安全等問題。因此，研發(fā)相關中草藥制劑和高效疫苗越發(fā)重要。

外膜蛋白(Outer membrane proteins, OMPs)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，是外膜A蛋白、微孔蛋白、脂蛋白和微量蛋白等蛋白的總稱[6]，OMPs除作為細菌的結(jié)構(gòu)組成之外，對細胞物質(zhì)的運輸和有關物質(zhì)的合成和致病力也有重要作用。研究表明外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可誘導體內(nèi)產(chǎn)生較強的細胞和體液免疫，而且不同血清型分離菌株具有交叉保護作用，因而成為疫苗研發(fā)的熱點。隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學、生物信息學等相關學科的發(fā)展，越來越多病原菌的外膜蛋白的基因序列得以測出，這為從病原菌中擴增目標基因，進行重組表達，快速篩選疫苗抗原提供了可能。目前，已有學者對OmpK、 OmpU、OmpS2、OmpW、OmpC等外膜蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫原性進行了研究[7-11]。但是OmpLC( Outer membrane porin protein LC)作為一種特定外膜蛋白，在國內(nèi)外鮮見報道，其主要特性和功能尚不是很清楚。本文以鮰愛德華菌OmpLC基因序列為基礎，對該蛋白進行一系列生物信息學分析，以期為今后進一步研究該蛋白的功能及鮰愛德華菌相關發(fā)病機制以及疫苗的研制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種

鮰愛德華菌，由西南民族大學生命科學與技術學院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室從患病黃顙魚腸道采樣，經(jīng)回感實驗確認為此次黃顙魚患病的主要病原菌。鮰愛德華菌經(jīng)分子鑒定后，保存-20℃冰箱中備用。

1.1.2主要試劑和儀器

營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar；北京奧博星生物技術有限責任公司)。TaqMix、DNA Marker DL2000購自TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.。Yeast Extract(OXOID) 、 Tryptone (OXOID)，PCR儀(Eppendorf Germany)，電泳儀(BIORAD)凝膠成像系統(tǒng)(BioRAD Laboratories Segrate Italy)，超低溫冰箱，離心機(Eppendorf)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100)，恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學儀器科技有限公司)。高壓滅菌鍋(SANYO Electric CO.,LTD Japan)。

1.2 OmpLC基因序列擴增

參考GENBANK已有的OmpLC基因CDS序列，利用軟件Primer Premier 5設計上游引物(ompLCF): 5'CCCGATGGAATCAAAT3' 、下游引物(ompLCR): 5'CCTGCCTG ATCGG A TA 3'，委托上海生工生物工程有限公司合成。以反復低溫和煮沸法粗提細菌總DNA模板。

以提取的鮰愛德華菌總DNA為模板，用引物OmpLCR、OmpLCF，對OmpLC基因進行PCR擴增。PCR反應體系：上下游引物各1 μL(引物濃度均為10 μmol/L)，DNA模板3 μL，ddH2O 20 μL，Mix 25 μL，總體系為50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃、30 s，51.5 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個循環(huán)； 72 ℃延伸4 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品膠回收后送交上海上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 OmpLC基因生物信息學分析

1.3.1核酸序列分析

測序完成后獲得上下序列，利用DNAstar軟件包的SeqMan程序進行序列拼接，并根據(jù)測序峰圖進行調(diào)整。獲得完整序列后利用NCBI網(wǎng)站提供的Blastn和Blastx程序進行序列比對，查找相似序列，初步確定其功能。用BioEdit軟件對基因序列進行ORF查找，確定CDS區(qū)，并將CDS區(qū)翻譯成氨基酸序列。用CodonW1.4對編碼區(qū)進行密碼子偏好性分析。最后將該序列提交至GenBank。

1.3.2蛋白質(zhì)序列分析

用ProtParam分析蛋白的一級結(jié)構(gòu)和及其理化參數(shù)(分子量、等電點、吸光系數(shù)等)；用ProtScal和DNAstar 軟件包Protean程序預測其親疏水性；用TMHMM Server 2.0進行跨膜區(qū)分析；用SignalP 4.0 Server軟件進行信號肽預測；用PredictProtein預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；用InterProScan、MotifScan、CDD預測其結(jié)構(gòu)功能域。用Phyre2進行三級結(jié)構(gòu)預測；用DNAstar 軟件包中的Megalign進行分子進化分析。所用網(wǎng)絡服務資源見表1。

表1　生物信息學分析在線網(wǎng)絡資源

2實驗結(jié)果

2.1OmpLC基因序列分析

2.1.1OmpLC基因 CDS 區(qū)分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果見圖1。經(jīng)測序分析OmpLC基因序列片段大小為1 133 bp，序列提交至GenBank，收錄入號為JX064520。鮰愛德華菌(Edwardsiellaictaluri)OmpLC基因的cDNA從32 到1 111全長1 080 bp，編碼360個氨基酸。

2.1.2OmpLC基因密碼子偏好性分析

不同物種不同基因?qū)τ诿艽a子的使用具有明顯的偏好性，密碼子使用的偏性與基因的時空表達、表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及功能有密切關系。對鮰愛德華菌OmpLC基因進行偏好性分析表明：編碼Phe的密碼子UUC、編碼Leu的密碼子CUG、編碼Ile的密碼子AUC等20種密碼子為該基因的偏好性密碼子(見圖2)。

圖1　OmpLC PCR擴增結(jié)果

圖2　密碼子偏好性分析

2.2OmpLC編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)分析

2.2.1OmpLC編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)包括其相對分子量、氨基酸組成、等電點等。用ProtParam tool軟件預測鮰愛德華菌OmpLC蛋白的理化性質(zhì)。OmpLC蛋白分子量為 中不含Cys，Gly、Ala、Asn的含量較多，分別為11.67%、10.83%和8.89%。相對含量較少的氨基酸為His(0.28%)(結(jié)果見表2)。推測OmpLC蛋白分子量為39.407 kDa，理論等電點PI為4.98，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為41，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為34，不穩(wěn)定系數(shù)為18.26。根據(jù)不穩(wěn)定參數(shù)的數(shù)值低于40才是穩(wěn)定的蛋白[12]，鮰愛德華菌OmpLC蛋白是一種穩(wěn)定性蛋白，軟件預測該蛋白在體外環(huán)境下的半衰期為30 h。

表2　氨基酸基本組成

2.2.2OmpLC編碼產(chǎn)物的疏水性分析

運用Protean程序Kyte-Doolittle算法對OmpLC編碼產(chǎn)物進行親水性/疏水性預測疏水性圖譜：正值越大說明越疏水，負值越大說明越親水；親水性圖譜反之。由親疏水性圖譜可知在前3-22氨基酸殘基區(qū)域有較強的疏水性，參考ProtScal的分析結(jié)果，對于疏水性第10位的Val具有最大值為3.000，第51位的Asp具有最小值為-2.867，平均疏水性值為-0.449，整個蛋白表現(xiàn)為親水性，由此預測該蛋白是一種親水性蛋白(見圖3)。

圖3　OmpLC編碼產(chǎn)物親疏水性圖譜

2.2.3編碼產(chǎn)物的跨膜區(qū)分析

TMHMM，是一種基于隱馬爾可夫模型的跨膜螺旋預測算法。利用TMHMM server 2.0在線軟件對OmpLC編碼產(chǎn)物的跨膜區(qū)域分析(見圖4)，結(jié)果顯示， 1-6區(qū)域位于膜內(nèi)， 7-26區(qū)域預存在一個跨膜螺旋，27-360區(qū)域則位于膜外，N端在細胞膜內(nèi)預測的概率為0.83。這與上述疏水性分析相吻合。

圖4　OmpLC編碼產(chǎn)物跨膜區(qū)預測*

2.2.4OmpLC編碼產(chǎn)物信號肽預測

信號肽是分泌蛋白質(zhì)前體N端15-30個氨基酸組成的多肽，引導新生蛋白的定位。本文采用的SignalP4.0是個強大的信號肽及其剪切位點檢測工具，該算法基于神經(jīng)網(wǎng)絡算法，利用已知信號序列的革蘭氏陰性原核生物、革蘭氏陽性原核生物及真核生物的序列作為訓練集，對分泌型蛋白的信號肽進行預測，并且給出C、S、Y-score計算結(jié)果[13]。其中C值是信號肽酶切位點分值，S值是信號肽分值，Y值是由C值和S值綜合得出的剪切位點分值，用于更精確的確定信號肽酶切位點[12]。一個典型的信號肽，其S值在剪切位點之前高在剪切位點之后變低，Y值和C值在剪切位點達到最大值并趨近于1。本實驗預測結(jié)果(見圖5)表明：C值和Y值在第23位分別獲得最大值0.884、0.898，S值在第3位最大為0.949，1-22位平均S值為0.923，D值是S-mean和Y-max的平均值，為0.910，從而可以判斷OmpLC編碼產(chǎn)物存在信號肽，剪切位點位于22～23。

圖5　OmpLC編碼產(chǎn)物信號肽預測*

2.3OmpLC編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)預測

PredictProtein是歐洲分子生物學實驗室提供的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)預測服務，其分析方法包括：用PROFsec分析序列的二級結(jié)構(gòu)，用PROFacc分析殘基溶劑可及性，PHDhtm分析潛在的跨膜拓撲結(jié)構(gòu)，通過PROSITE搜索模體，借助ProDom預測功能結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)該編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)中螺旋占6.67%，折疊占45.28%，無規(guī)則卷曲占48.06%，其預測圖如圖6所示，可以看出，該產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)主要由折疊和環(huán)構(gòu)成。

圖6　OmpLC編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)預測*

2.4OmpLC編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)域和功能位點預測

InterPro數(shù)據(jù)庫由EBI開發(fā)，整合蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點等資源。整合UniProt、PROSITE、Pfam等12個成員數(shù)據(jù)庫，檢索結(jié)果準確。用CDD、InterProScan、MotifScan對OmpLC的編碼產(chǎn)物的基序及結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果均指向cl01155(OM_channels superfamily)的成員gram_neg_porins[cd00342](見圖7a，7b)。OmpLC編碼蛋白由360個氨基酸組成，其中28-360個氨基酸殘基為保守結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域由多個基序(53-64、96-106、153-164、233-245、312-348等)組成(見圖7c)，其中最典型的模體是第312-348位的表達式為 [LIVMFY].{2}G.{2}Y.F.K.{2}[SN] [STAV][LIVMFYW]V，目標蛋白的模體為VDLGAT YYFNKNMSTY V，該家族蛋白在主要存在于細菌中，在病毒和和真核生物偶有出現(xiàn)(見圖7d)。

(a)通過CDD預測的保守結(jié)構(gòu)域

(b)通過InterProScan預測的保守結(jié)構(gòu)域

(c)通過InterProScan預測的保守基序特征

(d)革蘭氏陰性型Porin家族在各種生物中的分布情況

2.5OmpLC編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)分析

CPHmodels是采用同源建模來預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的一個網(wǎng)絡服務器，同時也采用了以預測距離為基礎的竄線(threading)算法。同源建模是在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索目標蛋白的同源蛋白，然后將目標蛋白和同源蛋白進行對比，根據(jù)模板結(jié)構(gòu)建模，并進一步優(yōu)化模型作為預測的結(jié)果[14]。對于遠源同源蛋白，結(jié)構(gòu)雖然有一定的相似性，但其一致性小于30%，此時很難確定序列和結(jié)構(gòu)之間的關系，此時選擇線串法進行蛋白結(jié)構(gòu)預測效果較好。該算法是將待測序列“穿”入已知蛋白的基本骨架內(nèi)，通過計算各種折疊的概率，來預測蛋白的核心結(jié)構(gòu)。Phyre是一種基于profile-profile比對和線串法，對預測蛋白和模板進行1D-3D的序列譜的比對預測。因此本文采用這兩種方法進行預測，CPHmodels結(jié)果顯示與1osm_A的相似性達64.5 %，其3D結(jié)構(gòu)圖如圖8a所示。Phye2結(jié)果顯示，同源蛋白為d1osma，該蛋白屬于porins超家族。目標蛋白中有335個氨基酸殘基(93%)以100%置信率參與建模(見圖8b)。將二者所得建模參數(shù)文件導入Swiss-Pdb V iewer 3.7，將其結(jié)構(gòu)進行疊加比對(見圖8c)，分析結(jié)構(gòu)類似性，并利用Ramachandran參數(shù)進行檢驗。結(jié)果如圖7所示。黃色區(qū)域是理想的Φ角和Ψ角分布區(qū)域，而藍色區(qū)域為不合理區(qū)域。從圖8d中可以看出，模擬得到的OmpLC蛋白的殘基的二面角絕大部分在合理區(qū)域內(nèi)，表明該預測結(jié)構(gòu)與自然結(jié)構(gòu)趨勢相同，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。

圖8　兩種建模方法所得3D圖及和重疊比較分析圖*

2.6OmpLC編碼蛋白分子進化分析

本文選用Blast p程序，利用特異性位點迭代比對算法(Position-Specific Iterated BLAST，PSI-Blast)，搜索非冗余數(shù)據(jù)庫(GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF)，進行同源蛋白搜索。遺傳距離分析結(jié)果顯示，目標蛋白序列MYOMP(已用下劃線標記)與OmpLC蛋白序列AEQ59632、和AEQ59639序列相似性分別達到100%和99.7%(見圖9a)，且從系統(tǒng)進化樹上可以看出MYOMP和二者聚為一類(見圖9b)，因此可以判斷目標蛋白為OmpLC。12個序列可以明顯分為三類，首字母為m的序列1941972、378986906、EHJ79723.1屬于類麥芽孔道蛋白類(Maltoporin-like)，首字母為l/L的序列331641081、AAB40783.1和1FEP為配體門控通道蛋白類(ligand_gated_channel)，其它的則屬于革蘭氏陰性孔道蛋白(gram_neg_porins)。該目標蛋白為革蘭氏陰性孔道蛋白。

圖9　OmpLC蛋白序列系統(tǒng)進化分析

3討論

生物信息學是一門建立在生物科學、數(shù)學、計算機科學基礎之上的交叉科學。隨著生物技術的快速發(fā)和多個物種的基因組計劃的相繼完成，生物信息學在基因的功能發(fā)現(xiàn)、疾病基因診斷、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測、分子藥物設計等方面發(fā)揮著重要作用。目前有很多生物信息學分析軟件和數(shù)據(jù)庫可以從網(wǎng)上免費下載，有些機構(gòu)還有專門的在線服務系統(tǒng)。生物信息學借助這些廣泛的信息資源及計算機輔助軟件，能夠?qū)怂?、蛋白質(zhì)等序列進行快速、高效、全面的分析，可以節(jié)約實驗成本、縮短研究周期、避免試驗的盲目性。OmpLC基因能夠編碼一種特定的外膜孔蛋白，有研究表明OmpLC能夠作為噬菌體ΦeiAU和ΦeiDWF的吸附受體[15]，而關于其它相關功能尚還未見報道，因此選取鮰愛德華氏菌OmpLC作為目標蛋白，利用生物信息學方法分析其結(jié)構(gòu)和功能。

鮰愛德華氏菌OmpLC蛋白富含Gly和Ala，且成熟蛋白N端的第一個氨基酸是Ala，它和Gly都屬于穩(wěn)定型殘基，且不穩(wěn)定系數(shù)為18.26(<40)，為一種穩(wěn)定蛋白?？缒^(qū)分析結(jié)果說明在第7-26個氨基酸殘基區(qū)域存在一個跨膜螺旋，這和二級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果較一致，但因為其1-22區(qū)域為信號肽區(qū)域，因此成熟蛋白中應該無明顯跨膜螺旋。此結(jié)果與朱珊麗等[16]研究的主要外膜蛋白(MOMP)結(jié)構(gòu)有所不同。這可能和外膜蛋白種類及不同菌株的特異性有關。二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)表明該蛋白主要由16個β-折疊和一些無規(guī)則卷曲組成，三維結(jié)構(gòu)呈桶狀。通過同源建模和線串法兩種建模方法，得到結(jié)果較一致且理論可靠的OmpLC蛋白模型。該模型同已報道ompC、ompF的結(jié)構(gòu)相似[11,17-18]。有研究表明，ompC和ompF基因的存在對于細菌的抗酸性和相關抗生素的擴散具有重要作用[17-18]，而鮰愛德華氏菌OmpLC和ompC及ompF具有相似的結(jié)構(gòu)，但其是否也具有相應的功能尚不清楚，且OmpLC和ompC及ompF之間的進化關系如何亦有待于進一步研究。

革蘭氏陰性孔蛋白在細菌生命過程中主要具有分子篩特性，對親水性復合物進行過濾[19]。某些選擇性孔蛋白(Porins)還具有溶質(zhì)結(jié)合位點，允許特定的溶質(zhì)跨膜。作為外膜蛋白的重要組成成分，孔蛋白(Porins)還可以作為噬菌體和細菌素的受體[20]。鮰愛德華菌OmpLC蛋白的結(jié)構(gòu)域和同源性分析結(jié)果顯示：鮰愛德華菌OmpLC蛋白屬于外膜蛋白通道超家族(OM_channels superfamily)的革蘭氏陰性孔蛋白(gram_neg_porins)成員，因此，鮰愛德華菌OmpLC蛋白未來可作為噬菌體ΦeiAU和ΦeiDWF的吸附受體，而OmpLC基因的表達水平高低也可成為噬菌體感染敏感性重要分子因素[20]。

由于細菌外膜蛋白(OMPs)的種類多樣及其在生物體中位置的特異性，其純化較為困難，因而限制了對其結(jié)構(gòu)和功能的研究。本文對鮰愛德華氏菌的外膜蛋白——OmpLC蛋白的序列進行一系列生物信息學分析，為進一步研究鮰愛德華氏菌致病的相關發(fā)病機制、鮰愛德華氏菌OmpLC蛋白的功能、表達載體的構(gòu)建、分子進化、分子定向改造、免疫原性研究和疫苗研發(fā)奠定了基礎。

參考文獻

[1]BRENNER D J, KRIEG N R, STALEY J T. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. London:Springer, 2005.

[2]YE S G, LI H, QIAO G, et al. First case ofEdwardsiellaictaluriinfection in China farmed yellow catfishPelteobagrusfulvidraco[J]. Aquaculture, 2009, 292 (1-2): 6-10.

[3]梁萬文，陳明，余曉麗，等. 斑點叉尾鮰腸敗血癥病原菌的分離與鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2007, 20(5): 1124-1129.

LIANG Wanfang, CHEN Ming, YU Xiaoli, et al. Isolation and identification of causative pathogen for enteric septicemia of catfish (ESC)[J]. South West China Journal of Agricultural Sciences, 2007, 20(5): 1124-1129.

[4]KESKIN O, SECER S, IZGü R M, et al.Edwardsiellaictaluriinfection in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)[J]. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 2004, 28(4): 649-653.

[5]肖克宇，江為民，舒新華，等. 愛德華氏菌變異株C9605及對鱉的致病性研究[J]. 微生物學通報，1998，25(5):262-265.

XIAO Keyu, JIANG Weimin, SHU Xinhua, et al.Studies onEdwardsiellaictalurivatiation strain( C9605) and its pathogenicity to soft-shelled turtles[J]. Microbiology China, 1998，25(5): 262-265.

[6]熊靜，關瑞章，郭松林，等. 魚類病原菌外膜蛋白及其免疫原性研究進展[J].水生生物學報, 2011,35(1): 163-169.

XIONG Jing,GUAN Ruizhang,GUO Songlin,et al.A Review on the immunogenicity of fish pathogenic bacterial outer membrane proteins[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011,35(1):163-169.

[7]LI Ningqiu, BAI Junjie, WU Shuqin, et al. An outer membrane protein,OmpK, is an effective vaccine candidate forVibrioharveyiin Orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides)[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 25(6): 829-833.

[8]黃輝，毛芝娟，陳吉剛. 哈維氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表達與免疫原性研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2010, 29(3): 346-350.

HUANG Hui, MAO Zhijuan, CHEN Jigang.Cloning,expression and imImunogenicity analysis of OmpU ofVibrioharveyiZJ 2008[J].Joumal of Huazhong Agricultural University, 2010, 29(3): 346-350.

[9]張亞寧，李曉，耿曉娜，等. 遲緩愛德華菌HB01外膜蛋白OmpS2基因的克隆表達及其免疫原性研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2011, 27(10): 1075-1082.

ZHANG Yaning, LI Xiao, GENG Xiaona, et al. Cloning and expression of a outer membrance protein gene (OmpS2) ofEdwardsiellatardaHB01 and its immunogenicity [J]. China Journal of Cell Molecular Immunology, 2011, 27(10): 1075-1082.

[10]劉明智，葉星，田園園，等. 嗜水氣單胞菌外膜蛋白W基因的表達及其免疫原性分析[J]. 微生物學通報，2011, 38(3): 437-445.

LIU Mingzhi, YE Xing, TIAN Yuanyuan, et al. Expression and immunogenicity analysis of the outer membrane protein W gene ofAeromonashydrophila[J]. Microbiology China, 2011, 38(3): 437-445.

[11]LOU H B, CHEN M, BLACK S S, et al. Altered antibiotic transport in OmpC mutants isolated from a series of clinical strains of multi-drug resistantE.coli[J]. PLoS One, 2011, 6(10): 1-15.

[12]熊偉，楊勇琴，張海洋，等. 人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1 (hMTERF 1)蛋白的生物信息學分析[J]. 生物信息學，2015, 13(1): 23-30.

XIONG Wei, YANG Yongqin, ZHANG Haiyang, et al. Bioinformatic analysis of human mitochondrial transcription termination factor 1 (hMTERF 1) [J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2015, 13(1): 23-30.

[13]PETERSEN T N, BRUNAK S, VON H G, et al. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods, 2011, 8(10): 785-786.

[14]NIELSEN M, LUNDEGAARD C, LUND O, et al.CPHmodels-3.0-Remote homology modeling using structure-guided sequence profiles[J]. Nucleic Acids Research, 2010, 38(20103811): 576-581.

[15]HOSSAIN M J, RAHMAN KH S, TERHUNE J S, et al. An outer membrane porin protein modulates phage susceptibility inEdwardsiellaictaluri[J].Microbiology, 2012, 158(2): 474-487.

[16]朱珊麗，尤孫武，婁崇潔，等. 沙眼衣原體主要外膜蛋白生物信息學分析[J]. 溫州醫(yī)學院學報, 2009, 39(1): 5-7.

ZHU Shanli, YOU Sunwu, LOU Chongjun, et al. Bioinformatics analysis of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis serovar E[J].Journal of Wenzhou Medical College, 2009, 39(1): 5-7.

[17]KUMAR A, HAJJAR E, RUGGERONE P,et al.Structural and dynamical properties of the porins OmpF and OmpC: insights from molecular simulations[J].Journal of Physics: Condensed Matter, 2010, 22(45): 454125.

[18]BEKHIT A, FUKAMACHI T,SAITO H,et al.The role of OmpC and OmpF in acidic resistance inEscherichiacoli[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2011, 34(3):330-334.

[19]BENZ R, BAUER K.Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-negative bacteria.Review on bacterial porins[J].European Journal of Biochemistry, 1988, 176 (1): 1-19.

[20]JAPAL B K,WALIANAL P J.Biophysics of the structure and function of porins[J].Quarterly Reviews of Biophysics,1990,23(4):367-403.

Bioinformatics analysis of theEdwardsiellaictaluriOmpLCgene

HUANG Yanqing1, LIU Gangbiao2, WANG li2*

(1.KeyLaboratoryofEastChinaSeaandOceanicFisheryResourcesExploitation,MinistryofAgriculture(EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences),Shanghai200090,China;2.KeyLaboratoryofAnimalGeneticsandBreedingofStateEthnicAffairsCommission&MinistryofEducation

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities),Chengdu610041,China)

Abstract：The purpose of this study is to predict and analyze the structure and function of out membrane protein LC(OmpLC) of Edwardsiella ictaluri. The OmpLC gene was amplified by PCR method. The characteristics of physico-chemical parameters,hydropathy profile,signal peptide,transmembrane helices, secondary structure and tertiary structure were analyzed by bioinformatics softwares and web servers. The results showed that OmpLC protein of Edwardsiella ictaluri composed of 360 amino acids, the calculated molecular mass was 39.407 kD and the theoretical isoelectricpoint was 4.98, and the instability index was 18.26. OmpLC protein had signal peptide and strong hydrophilicity but without transmembrane helices in mature protein. In the second structure α-helix , β-sheet and random coil made up 6.67%, 45.28%, 48.06%, respectively. The three-dimensional structure was β-barrel, its main domain was classified to gram_neg_porins which belong to OM_channels superfamily. The multiple alignment and clustering analysis showed that OmpLC protein of Edwardsiella ictaluri has high similarity to other OmpLC proteins (AEQ59632,AEQ59639).The properties of OmpLC obtained by bioinformatic analysis can provide reference for the prodiction of novel functional domain and the research on related pathogenesis and new vaccines.

Keywords：Edwardsiella ictaluri; OmpLC; Structure prediction; Bioinformatics

收稿日期：2016-03-23;修回日期：2016-05-02.

基金項目：國家自然基金面上項目(No.31172421)；四川省科技支撐項目(No.2016NZ0044);西南民族大學研究生學位點建設項目(No.2016XWD-SO71007)。

作者簡介：黃艷青，女，博士，研究方向：水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學及分子生物學； E-mail: hyqrich@163.com. *通信作者：王利，女，副教授，碩士生導師，研究方向：水產(chǎn)動物疾病學；E-mail: wangli@swun.cn.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.01

中圖分類號：S968.25

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)02-061-10