姜　瑛, 吳　越, 徐　莉, 胡　鋒, 李輝信,*

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京　210095 2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州　450002 3 山東省土壤肥料總站，濟(jì)南　250100

?

悉生培養(yǎng)微縮體系食細(xì)菌線蟲提高土壤激素含量的機(jī)制

姜瑛1,2, 吳越1,3, 徐莉1, 胡鋒1, 李輝信1,*

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095 2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，鄭州450002 3 山東省土壤肥料總站，濟(jì)南250100

摘要:研究土壤食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌的相互作用及其生態(tài)功能是土壤生態(tài)學(xué)的核心內(nèi)容之一。食細(xì)菌線蟲取食細(xì)菌可以促進(jìn)土壤中氮素的礦化，提高氮素養(yǎng)分的供給，改善土壤的營養(yǎng)條件，從而促進(jìn)植物的生長發(fā)育。土壤食細(xì)菌線蟲促進(jìn)植物根系生長的“養(yǎng)分作用機(jī)制”已得到確認(rèn)，而“激素作用機(jī)制”還存在爭議。從供試土壤中篩選獲得一株高效產(chǎn)IAA細(xì)菌和兩種不同cp值的食細(xì)菌線蟲，通過設(shè)置簡化的悉生培養(yǎng)系統(tǒng)，對這兩種土著食細(xì)菌線蟲與土著產(chǎn)IAA細(xì)菌之間的相互作用，及其對土壤中IAA含量變化的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：兩種食細(xì)菌線蟲的取食均能促進(jìn)細(xì)菌數(shù)量和活性的增強(qiáng)，食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌相互作用也能顯著增加土壤中IAA的含量；這些促進(jìn)作用受到接種食細(xì)菌線蟲的種類以及培養(yǎng)時間的影響：在培養(yǎng)第10天和第20天時，接種cp值為1的中桿屬食細(xì)菌線蟲顯著增加了產(chǎn)IAA細(xì)菌的數(shù)量；在培養(yǎng)第10天和第30天時，相比較接種cp值為2的頭葉屬食細(xì)菌線蟲，接種中桿屬食細(xì)菌線蟲顯著提高了土壤中IAA的含量。

關(guān)鍵詞：食細(xì)菌線蟲；產(chǎn)激素菌；悉生培養(yǎng)；相互作用；IAA(吲哚乙酸)

The possible mechanisms underlying improvement of soil auxin content by

土壤食細(xì)菌線蟲與土壤微生物之間存在密切的相互關(guān)系，土壤食細(xì)菌線蟲除了自身的代謝活動作用外(如形成pH較高的微域環(huán)境、分泌排泄有機(jī)物)，還可通過取食土壤細(xì)菌，影響微生物的數(shù)量、活性和周轉(zhuǎn)從而參與土壤的生態(tài)過程[1- 8]。研究土壤食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌的相互作用及其生態(tài)功能是土壤生態(tài)學(xué)的核心研究內(nèi)容之一，研究結(jié)果有助于揭示土壤生態(tài)過程及機(jī)理，豐富生態(tài)學(xué)理論。而在土壤中，食細(xì)菌線蟲取食植物促生菌也一定會對其數(shù)量以及活性等造成一定的影響。

悉生培養(yǎng)(gnotobitic microcosm culture)是指將供試土壤在密閉的培養(yǎng)系統(tǒng)中滅菌，然后在嚴(yán)格控制的無菌培養(yǎng)條件下引入供試目標(biāo)土壤線蟲和純培養(yǎng)的微生物進(jìn)行培養(yǎng)[9]。悉生培養(yǎng)系統(tǒng)可以將復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)簡化，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物和環(huán)境的可控性，是研究土壤生物之間相互作用的有力工具。自從Aderson以及Coleman等人率先利用該系統(tǒng)研究食細(xì)菌線蟲與微生物的相互作用，以及對土壤生態(tài)系統(tǒng)能量傳遞和養(yǎng)分動態(tài)的影響以來[10- 11]，該領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[9, 12- 15]，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室也在悉生培養(yǎng)系統(tǒng)中對食細(xì)菌線蟲與微生物之間的相互作用進(jìn)行了大量的研究[16- 18]。

前期研究通過悉生以及原位富化等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)食細(xì)菌線蟲的取食改變了番茄、小麥以及水稻根際微生物群落結(jié)構(gòu)的同時，使得土壤中生長素(Indole acetic acid, IAA)含量顯著增加[19- 22]，因此,食細(xì)菌線蟲有可能是通過刺激土壤中一些植物促生菌分泌大量的激素以及類激素物質(zhì)從而提高土壤中生長素IAA的含量[4]。但是目前還沒有直接的證據(jù)表明土著食細(xì)菌線蟲對土著產(chǎn)IAA細(xì)菌的促進(jìn)作用。

依據(jù)線蟲在生活史策略連續(xù)譜(r-對策到K-對策)中的位置，可將其劃分為5個不同的cp(colonizer-persister)類群[23]。其中cp值越低，線蟲產(chǎn)卵量越多，世代時間越短，因此不同cp值線蟲在生態(tài)系統(tǒng)中的作用存在差異。本文就采用簡單較易控制條件的悉生培養(yǎng)系統(tǒng)，對比研究兩種不同cp值(cp1和cp2)的土著食細(xì)菌線蟲與土著產(chǎn)IAA細(xì)菌的相互作用，為進(jìn)一步明確土壤食細(xì)菌線蟲取食細(xì)菌所產(chǎn)生的激素效應(yīng)提供切實(shí)可靠的依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1供試土壤

采自江蘇省南京市雨花臺區(qū)板橋鎮(zhèn)長江南岸沖積地的灰潮土，美國制土壤質(zhì)地分類為砂質(zhì)壤土。采集表層0—20cm的土樣，采回新鮮土樣之后，剔除土壤中肉眼可見的根茬等殘?bào)w和蚯蚓等大中型土壤動物以及小石塊等，風(fēng)干并且過2mm篩，備用。土壤的基本性狀如表1所示。

表1　供試土壤基本性質(zhì)

1.1.2供試線蟲

兩種土著優(yōu)勢食細(xì)菌線蟲：頭葉屬(Cephalobussp.)(cp2)，中桿屬(Mesorhabditissp.)(cp1)，均篩自供試土壤，保存在22℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.3供試菌株

兩種土著細(xì)菌：產(chǎn)IAA細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(GenBank accession number JX424611)和對照不產(chǎn)IAA的細(xì)菌貪噬菌Variovoraxsp. (GenBank accession number JX424612)，均篩自供試土壤，保存在4℃冰箱中。

1.1.4培養(yǎng)基

線蟲培養(yǎng)基(Nematode growth media，NGM)：2.5 g 蛋白胨，3g NaCl和17g 瓊脂溶于1L蒸餾水中，高壓滅菌，加入已通過無菌濾膜的 1mL 1mol/L CaCl2，1mL 1mol/L MgSO4，1mL 5mg/mL 膽固醇和25mL 1mol/L KHPO4。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH 7.0—7.2，121℃滅菌20min。

1.2細(xì)菌與線蟲的預(yù)培養(yǎng)1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)

將冰箱中預(yù)先準(zhǔn)備好的解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(B) 和貪噬菌Variovoraxsp. (V) 的菌懸液接種到NGM液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)2d，5000 r/min離心5 min，收集離心管底部菌體，用無菌水反復(fù)洗滌離心3次后重新懸浮于無菌水中，制成約107cfu/mL的菌懸液，待用。

1.2.2線蟲的富化培養(yǎng)

采用單種培養(yǎng)法，將兩種供試線蟲頭葉屬Cephalobussp. (C)或中桿屬M(fèi)esorhabditissp. (M)分別接種到長有單一解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(B) 或者貪噬菌Variovoraxsp. (V)的NGM固體培養(yǎng)基上，采用處理中的組合一一對應(yīng)，于22℃富化培養(yǎng)。當(dāng)線蟲培養(yǎng)至達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需的數(shù)量時采用淺盤法[24]分離，分離得到的線蟲放置于滅菌的離心管中，離心去上清液，用無菌水重復(fù)清洗5—6次，待用。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1處理設(shè)置

本試驗(yàn)采用悉生培養(yǎng)法，為了盡可能少地破壞土壤的理化性質(zhì)，采用60Co-γ射線滅菌(25kGy)(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院輻照中心進(jìn)行滅菌)。

本試驗(yàn)共設(shè)置7個處理，每個處理設(shè)置3次重復(fù)：

1)滅菌土 (CK);2)滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(B);3)滅菌土+B+頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp. (BC);4)滅菌土+B+中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp. (BM);5)滅菌土+對照菌貪噬菌Variovoraxsp. (V);6)滅菌土+V+頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp. (VC);7)滅菌土+V+中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp. (VM)。

1.3.2試驗(yàn)步驟

將裝有80g無菌供試土壤的100mL小燒杯按處理接種細(xì)菌，接種量為106cfu/g干土，于28℃預(yù)培養(yǎng)2d后再按處理分別均勻接入對應(yīng)的兩種食細(xì)菌線蟲懸液，使每克干土中接入的線蟲數(shù)達(dá)到大約30條，然后補(bǔ)充土壤含水量到田間持水量的60%，即實(shí)際含水量為24.8%左右，此含水量條件使得食細(xì)菌線蟲對細(xì)菌的促進(jìn)作用達(dá)到最強(qiáng)。用無菌封口膜封住小燒杯口，22℃下恒溫培養(yǎng)，分別于接種食細(xì)菌線蟲后的第10、20、30天破壞性采樣，采樣時每個處理取3個重復(fù)測定相應(yīng)指標(biāo)。

1.4測定指標(biāo)與方法

1.4.1土壤含水量

烘干稱重法，在105℃條件下烘干8h。差值法計(jì)算含水量。

1.4.2線蟲分離與計(jì)數(shù)

采用淺盤法對線蟲進(jìn)行分離，稱取10g土樣，加入淺盤中，在室溫下分離48h之后，用兩個500目的網(wǎng)篩收集線蟲懸液到劃有網(wǎng)格的小皿中，在體視顯微鏡下對線蟲進(jìn)行記數(shù)。

1.4.3土壤中細(xì)菌數(shù)量的計(jì)數(shù)

采用稀釋涂布平板法用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌并計(jì)數(shù)。

準(zhǔn)確稱取待測土樣5.00g，放入裝有45mL 無菌水并放有小玻璃珠的150mL 三角瓶中，置搖床上振蕩30min，使微生物細(xì)胞分散，靜置20—30s，即成10-1稀釋液；連續(xù)稀釋，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀釋菌液。選擇10-5、10-6、10-7這3個稀釋梯度待涂布。采用涂布平板法，先將LB固體培養(yǎng)基高溫滅菌，取出稍涼后倒入滅菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1 mL 含菌土壤稀釋液對號接種在相應(yīng)稀釋梯度編號的平板上(每個編號設(shè)3個重復(fù))，再用無菌的涂布器將菌液在平板上涂抹均勻，將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，之后將平板倒轉(zhuǎn)，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。

1.4.4土壤基礎(chǔ)呼吸

準(zhǔn)確稱取待測土樣15.00g，放入250mL玻璃瓶中，塞緊橡膠塞防止漏氣，密閉培養(yǎng)6h后用注射器采集氣體樣品，用氣相色譜儀7890A GC system (Agilent Technologies，USA)中的FID檢測器來測定二氧化碳的釋放通量。工作條件：柱溫為60℃，檢測器溫度為300℃，H2流量為40mL/min，空氣流量為300mL/min，F(xiàn)ID檢測器的載氣為N2(2mL/min)，色譜柱為APPQ-6FT填充柱。計(jì)算公式如下：

式中，F(xiàn)為氣體排放通量(μg CO2-C 24 h-1g-1干土)，V為玻璃瓶體積(L)，M為氣體的摩爾質(zhì)量(g/mol)，m為土壤質(zhì)量(g)，P為大氣壓力，通常視為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(×101.325kPa)，R為普適氣體常數(shù)(0.08206L×101.325kPa mol-1K-1)，T為玻璃瓶內(nèi)的平均氣溫(℃)，ΔC/Δt為氣體的排放速率(μL L-1h-1)。

1.4.5土壤激素測定

稱取土壤樣品10 g到100 mL離心管，加入80%丙酮水溶液50 mL，在冰浴條件下超聲提取30min，4000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，減壓濃縮(40℃)，將丙酮蒸發(fā)完全(即沒有冷凝液下滴)，用0.1mol/L鹽酸調(diào)pH值為2.8—3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，減壓濃縮(40℃)蒸干，用5 mL 色譜純甲醇溶解后，過0.45μm有機(jī)相濾膜，濾液保存在棕色小瓶中，用高效液相色譜(HPLC)測定。

色譜條件為流動相甲醇∶水∶醋酸=50∶45∶5；檢測波長254 nm；流速0.7 mL/min；進(jìn)樣量20μL；色譜柱C18(uBondapak，10u，300×3.9mm)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，用 Duncan法分析不同處理間的平均值差異(P< 0.05)，用三因素方差(Three-Way ANOVA)分析在整個培養(yǎng)時間(Time)(10、20、30d)內(nèi)兩種接種細(xì)菌(Bacteria)(產(chǎn)IAA細(xì)菌和對照菌)以及兩種食細(xì)菌線蟲(Nematode)對細(xì)菌數(shù)量和活性(處理B、BC、BM、V、VC、VM)以及土壤IAA含量(處理CK、B、BC、BM、V、VC、VM)的影響；作圖采用OriginPro 8.0 作圖軟件。

2結(jié)果與分析

2.1土壤中食細(xì)菌線蟲數(shù)量的變化特征

由表2可知，在所有添加食細(xì)菌線蟲的處理中，食細(xì)菌線蟲都能夠得到很好的生存和繁殖，線蟲數(shù)量先升高，到第20天的時候達(dá)到最大值，為初始線蟲的2.17—3.12倍，到第30天時線蟲數(shù)量有所降低，但依然能達(dá)到初始線蟲的1.61—1.89倍。添加產(chǎn)激素菌Bacillusamyloliquefaciens和中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp.的處理(BM)線蟲數(shù)在培養(yǎng)時期內(nèi)均高于添加產(chǎn)激素菌Bacillusamyloliquefaciens和頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp.的處理(BC)，但是差異均沒有達(dá)到顯著。而在培養(yǎng)第10天和第20天的時候添加對照菌Variovoraxsp.和頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp.的處理(VC)線蟲數(shù)量顯著高于添加對照菌Variovoraxsp.和中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp.的處理(VM)。顯然，在BM和VC的處理中，線蟲存活較好，這可能與食細(xì)菌線蟲的取食偏好有關(guān)。

表2土壤中食細(xì)菌線蟲數(shù)量的動態(tài)變化

Table 2Dynamic of bacterial-feeding nematodes in soil Values are the mean number of nematodes ± standard deviation (SD) (n=3)

處理Treatments線蟲數(shù)量(條/g干土)Thenumberofnematodes10d20d30dBC41.75±7.57b72.71±12.77b48.44±4.26aBM48.09±12.35b83.76±5.19ab51.99±6.84aVC67.76±11.25a99.51±7.22a56.70±10.84aVM41.16±3.86b64.98±13.89b50.83±5.12a

同一列內(nèi)字母不同表示有顯著性差異(P< 0.05);BC：滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens+頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp.;BM：滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens+中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp.;VC：滅菌土+對照菌貪噬菌Variovoraxsp.+頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobussp.;VM：滅菌土+對照菌貪噬菌Variovoraxsp.+中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditissp.

2.2食細(xì)菌線蟲對產(chǎn)IAA細(xì)菌數(shù)量和活性的影響

方差分析結(jié)果表明：接種不同種的細(xì)菌(Bacteria)對細(xì)菌數(shù)量和活性并沒有顯著的影響，而接種不同種的線蟲(Nematode)和培養(yǎng)時間(Time)均顯著地(P< 0.05)影響了細(xì)菌的數(shù)量和活性，但是它們?nèi)咧g并不存在顯著的交互作用(表3)。

接種不同種的食細(xì)菌線蟲對產(chǎn)IAA細(xì)菌以及對照菌數(shù)量和活性的影響如圖1、圖2所示。在整個培養(yǎng)期內(nèi)，所有處理的細(xì)菌數(shù)量(圖1)和活性(圖2)均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，土壤中接種兩種食細(xì)菌線蟲的處理(BC，BM，VC，VM)的細(xì)菌數(shù)量和活性均高于單獨(dú)接種產(chǎn)IAA細(xì)菌(B)和對照不產(chǎn)IAA菌(V)的處理。不同食細(xì)菌線蟲和細(xì)菌在不同培養(yǎng)期對細(xì)菌數(shù)量和活性的影響之間存在差異，由圖1可知，在第10天和第20天，BM處理的細(xì)菌數(shù)量均顯著高于單接產(chǎn)IAA菌的B處理，BC處理雖然也高于B處理，但并不顯著。而第10天和第30天，VC處理的細(xì)菌數(shù)量均顯著高于單接對照菌的V處理，VM處理雖然也高于V處理，但是也沒有達(dá)到顯著水平；由圖2可知，雖然接種食細(xì)菌線蟲均提高了兩種細(xì)菌的活性，但是在3次采樣以及相對應(yīng)的處理之間并沒有達(dá)到顯著水平，只有在第10天的時候，VC處理的細(xì)菌活性最高，顯著高于單獨(dú)接種產(chǎn)IAA菌的處理B。

表3在整個培養(yǎng)期(10， 20， 30d)內(nèi)，接種細(xì)菌和線蟲對土壤IAA含量，細(xì)菌數(shù)量及基礎(chǔ)呼吸的方差分析(Three-Way A NOVA)

Table 3F-values and error mean squares from three-way ANOVA on the effects of bacteria (with or without inoculatedBacillusamyloliquefaciensorVariovoraxsp.) and nematodes (with or without added bacterial-feeding nematodesCephalobussp. orMesorhabditissp.) on soil IAA content, soil bacteria number (BN) and basal respiration (BR) during the incubation time (day 10, 20 and 30 after seedling establishment)

變異來源SourceofvariationdfFIAA含量IAAcontentdfF細(xì)菌數(shù)量BNBacterianumber基礎(chǔ)呼吸BRBasalrespiration細(xì)菌Bacteria(B)22381.97*10.24NS1.71NS線蟲Nematode(N)217.84*212.60*3.89*培養(yǎng)時間Time(T)2104.79*232.64*5.01*B×N220.07*23.21NS0.31NSB×T455.19*20.29NS0.09NSN×T40.66NS40.75NS0.23NSB×N×T41.30NS40.32NS0.10NS誤差均方Errormeansquares420.00362.764.75

*顯著性差異檢驗(yàn)Test significant at the 5% level (P< 0.05)； NS: 無顯著性差異檢驗(yàn)

圖1　食細(xì)菌線蟲對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響　Fig.1　Effects of bacteria-feeding nematodes on the number of bacteria during the incubation time. Error bars represent standard deviation. For each incubation time, significant differences (P< 0.05, n=3) are indicated by different letters.B:滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens；BC：滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens +頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobus sp.;BM：滅菌土+產(chǎn)IAA菌解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens +中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditis sp.;V: 滅菌土+對照菌貪噬菌Variovorax sp.;VC：滅菌土+對照菌貪噬菌Variovorax sp.+頭葉屬食細(xì)菌線蟲Cephalobus sp.;VM：滅菌土+對照菌貪噬菌Variovorax sp.+中桿屬食細(xì)菌線蟲Mesorhabditis sp.；CFU (colony-forming units)

2.3食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌相互作用對土壤中IAA含量的影響

方差分析結(jié)果表明：接種兩種不同的細(xì)菌(Bacteria)、兩種不同的食細(xì)菌線蟲(Nematode)以及整個培養(yǎng)時間(Time)均顯著影響了土壤中IAA的含量，同時，細(xì)菌和食細(xì)菌線蟲二者之間的交互、細(xì)菌和培養(yǎng)時間二者之間的交互顯著影響土壤中IAA的含量(表3)。

接種不同種的食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌和對照菌相互作用對土壤中IAA含量的影響如圖3所示，滅菌土本身(CK)的IAA含量并不高，且在整個培養(yǎng)過程中變化不大，并且在接種不產(chǎn)IAA的對照菌的處理中，不管是否接種食細(xì)菌線蟲，對土壤中IAA的含量均沒有顯著的影響。對比對照處理以及接種對照菌的各個處理，接種產(chǎn)IAA細(xì)菌的處理不管是否接種食細(xì)菌線蟲，均顯著增加了土壤中的IAA含量。相對于單獨(dú)接種產(chǎn)IAA細(xì)菌的處理B來說，接種兩種食細(xì)菌線蟲均提高了土壤中IAA的含量，而兩種不同的食細(xì)菌線蟲對產(chǎn)IAA細(xì)菌產(chǎn)IAA量的影響也有差異，在第10天時，與B處理相比，BM處理顯著提高了IAA的含量，BC處理雖然也提高了IAA含量，但是差異并沒有達(dá)到顯著；到第20天時，BM和BC處理的IAA含量均顯著高于B處理的，但是BM和BC處理之間的差異并不顯著；到第30天時，BM和BC處理的IAA含量均顯著高于B處理的同時，BM處理的土壤IAA含量也要顯著高于BC處理。

圖2　食細(xì)菌線蟲對土壤呼吸的影響　Fig.2　Effect of bacteria-feeding nematodes on soil respiration during the incubation time. Error bars represent standard deviation (For each incubation time, significant differences (P<0.05, n=3) are indicated by different letters)

圖3　食細(xì)菌線蟲對土壤IAA含量的影響　Fig.3　Effects of bacterial-feeding nematodes on soil IAA content during the incubation time. Error bars represent standard deviation. For each incubation time, significant differences (P<0.05, n=3) are indicated by different lettersIAA：吲哚乙酸 indole acetic acid

3討論

本文通過悉生培養(yǎng)系統(tǒng)，探討了兩種不同cp值的食細(xì)菌線蟲對產(chǎn)IAA細(xì)菌的數(shù)量、活性、分泌IAA的能力等的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，接種食細(xì)菌線蟲的所有處理之間的線蟲數(shù)雖然存在差異，但是它們在整個培養(yǎng)時期內(nèi)的線蟲數(shù)均高于初始接種的30條/g干土的數(shù)量，而所有處理在整個培養(yǎng)期內(nèi)，不管有沒有接種食細(xì)菌線蟲，細(xì)菌的數(shù)量均高于初始接種的106CFU/g干土，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所用的供試材料均是篩自供試土壤，土著的細(xì)菌和線蟲都很適應(yīng)原土中的環(huán)境，在原土中都具有良好的生存和定殖能力，并且篩選的產(chǎn)IAA細(xì)菌和對照不產(chǎn)IAA的細(xì)菌都可以被這兩種食細(xì)菌線蟲取食并且影響到線蟲的繁殖。而在BM和VC處理中的食細(xì)菌線蟲數(shù)量要多于其他處理，這可能與食細(xì)菌線蟲的取食偏好性有關(guān)[7, 25]，Djigal等[26]也通過悉生培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種不同的細(xì)菌對食細(xì)菌線蟲Zeldiapunctata繁殖能力的影響不同，這與本實(shí)驗(yàn)得到了相同的結(jié)果，肖海峰在對模式線蟲Caenorhabditiselegans研究后提出，線蟲的繁殖率與其取食的偏好性是相關(guān)的[27]。

食細(xì)菌線蟲的取食活動對細(xì)菌的數(shù)量和活性都會造成一定的影響，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種兩種不同的食細(xì)菌線蟲均可以增加細(xì)菌的數(shù)量，然而，有研究表明，線蟲的過度取食也會造成細(xì)菌數(shù)量的減少，而線蟲的過度取食會掩蓋其對細(xì)菌數(shù)量的促進(jìn)作用[9, 28- 29]，食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌的數(shù)量之間存在著一種動態(tài)平衡的關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌的數(shù)量也隨著培養(yǎng)時間的延長存在著明顯的上下波動的趨勢。

相對于細(xì)菌數(shù)量來說，細(xì)菌活性的測定更能反映食細(xì)菌線蟲的取食對細(xì)菌的真實(shí)影響[30]，并且在大量的研究中，線蟲對細(xì)菌活性(及CO2的釋放強(qiáng)度)的影響相比細(xì)菌數(shù)量更加具備一致的明顯的趨勢。在研究食細(xì)菌線蟲對細(xì)菌活性的影響時，我們不得不考慮的問題是，食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌一樣也有呼吸，那么這個呼吸的量是否會影響我們對結(jié)果的分析呢？研究發(fā)現(xiàn)，食細(xì)菌線蟲的生物量較少，通常還要少于原生動物，因此其對土壤呼吸的貢獻(xiàn)率通常只有1%甚至更少[31]。在本實(shí)驗(yàn)中，接種食細(xì)菌線蟲提高了細(xì)菌的活性，這與以往大量的研究結(jié)果是一致的[32- 35]。食細(xì)菌線蟲對細(xì)菌數(shù)量和活性的促進(jìn)作用可能是因?yàn)橐韵聨讉€方面：線蟲的取食過程分泌出了可供細(xì)菌利用的養(yǎng)分，線蟲攝食的細(xì)菌在線蟲的腸道中獲得了某些營養(yǎng)物質(zhì)，被排出后反而加快了生長，并且線蟲能將細(xì)菌的數(shù)量控制在相對較低但是已經(jīng)足夠的水平，減少了基質(zhì)的限制作用，使得細(xì)菌能夠保持在對數(shù)生長期的高活性水平，同時線蟲也具有較強(qiáng)的移動能力，可以將細(xì)菌傳播到細(xì)菌本身很難迅速到達(dá)的營養(yǎng)物質(zhì)豐富的地方[36- 38]。同時發(fā)現(xiàn)，接種不同生活史策略(cp值)的食細(xì)菌線蟲對不同種細(xì)菌的數(shù)量和活性的影響不同，這與Djigal 2004年的研究結(jié)果是一致的[26]，他的研究表明相比較A.nanus和C.pseudoparvus.這兩種線蟲，Z.punctata對微生物的數(shù)量及活性的影響均較弱。研究發(fā)現(xiàn)，線蟲對細(xì)菌的影響會因線蟲的種類、代謝速率和繁殖速率的不同而不同[3, 23, 39- 40]，不同生活史策略的線蟲對細(xì)菌生長也有不同的影響[41]。同時，食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌之間的相互作用也隨著細(xì)菌種類的不同而不同[29, 34, 42- 44]。

而食細(xì)菌線蟲在促進(jìn)了細(xì)菌的增殖以及活性的過程中，也影響到了細(xì)菌代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量，在本實(shí)驗(yàn)中，接種食細(xì)菌線蟲增加了產(chǎn)IAA細(xì)菌的數(shù)量，促進(jìn)了產(chǎn)IAA細(xì)菌的活性，同時我們發(fā)現(xiàn)，土壤中的IAA含量也得到了顯著的增加，目前還沒有報(bào)道稱食細(xì)菌線蟲本身能夠分泌生長素IAA，而通過研究發(fā)現(xiàn)接種對照不產(chǎn)IAA菌和食細(xì)菌線蟲相互作用對土壤中的IAA含量沒有任何影響，更加肯定了食細(xì)菌線蟲本身是不能夠分泌IAA的，因此土壤中IAA含量的增加是由于土壤中產(chǎn)IAA細(xì)菌數(shù)量和活性增強(qiáng)的結(jié)果。有報(bào)道稱，食細(xì)菌線蟲比細(xì)菌的移動能力更強(qiáng)，這種移動能力可以促進(jìn)植物促生菌在根際的定殖，而食細(xì)菌線蟲的取食促進(jìn)了植物促生菌的增殖和活性，并在這個過程中刺激了細(xì)菌代謝物的增多，比如一些有利于根系生長的激素類物質(zhì)[45- 46]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，接種食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌相互作用顯著增加了土壤中IAA的含量，并且不同種食細(xì)菌線蟲對IAA含量影響的驗(yàn)證結(jié)果也均達(dá)到了顯著水平。由此，可以得出，土壤食細(xì)菌線蟲是通過提高土壤中產(chǎn)IAA細(xì)菌的數(shù)量和活性，刺激其產(chǎn)生更多代謝產(chǎn)物，從而提高土壤中激素含量的。

4小結(jié)

食細(xì)菌線蟲的繁殖能力因其取食細(xì)菌種類的不同而不同，cp1的中桿屬食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌的組合更能促進(jìn)線蟲數(shù)量的增殖；兩種食細(xì)菌線蟲的取食均能促進(jìn)細(xì)菌數(shù)量和活性的增強(qiáng)，食細(xì)菌線蟲與產(chǎn)IAA細(xì)菌相互作用也均能顯著增加土壤中IAA的含量，對照菌處理則對IAA含量沒有影響。這些促進(jìn)作用也都隨著接種細(xì)菌和食細(xì)菌線蟲種類以及培養(yǎng)時間的變化而變化，接種cp1的中桿屬食細(xì)菌線蟲比cp2的頭葉屬食細(xì)菌線蟲更能有效地促進(jìn)產(chǎn)IAA細(xì)菌的數(shù)量、活性從而提高土壤中IAA的含量，這可能與中桿屬食細(xì)菌線蟲cp值低，產(chǎn)卵量多，周轉(zhuǎn)速率更快，同時也與食細(xì)菌線蟲的取食偏好性有關(guān)。

參考文獻(xiàn)(References):

[1]Bouwman L A, Bloem J, van den Boogert P H J F, Bremer F, Hoenderboom G H J, de Ruiter P C. Short-term and long-term effects of bacterivorous nematodes and nematophagous fungi on carbon and nitrogen mineralization in microcosms. Biology and Fertility of Soils, 1994, 17(4): 249- 256.

[2]Alphei J, Bonkowski M, Scheu S. Protozoa, Nematoda and Lumbricidae in the rhizosphere ofHordelymuseuropeaus(Poaceae): faunal interactions, response of microorganisms and effects on plant growth. Oecologia, 1996, 106(1): 111- 126.

[3]Ferris H, Venette R C, Van Der Meulen H R, Lau S S. Nitrogen mineralization by bacterial-feeding nematodes: verification and measurement. Plant and Soil, 1998, 203(2): 159- 171.

[4]Bonkowski M, Cheng W X, Griffiths B S, Alphei J, Scheu S. Microbial-faunal interactions in the rhizosphere and effects on plant growth1. European Journal of Soil Biology, 2000, 36(3/4): 135- 147.

[5]Chen J, Ferris H. Growth and nitrogen mineralization of selected fungi and fungal-feeding nematodes on sand amended with organic matter. Plant and Soil, 2000, 218(1/2): 91- 101.

[6]Savin M C, G?rres J H, Neher D A, Amador J A. Uncoupling of carbon and nitrogen mineralization: role of microbivorous nematodes. Soil Biology and Biochemistry, 2001, 33(11): 1463- 1472.

[7]Salinas K A, Edenborn S L, Sexstone A J, Kotcon J B. Bacterial preferences of the bacterivorous soil nematodeCephalobusbrevicauda(Cephalobidae): Effect of bacterial type and size. Pedobiologia, 2007, 51(1): 55- 64.

[8]Dos Santos G A P, Derycke S, Fonsêca-Genevois V G, Coelho L C B B, Correia M T S, Moens T. Differential effects of food availability on population growth and fitness of three species of estuarine, bacterial-feeding nematodes. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 355(1): 27- 40.

[9]Ingham R E, Trofymow J A, Ingham E R, Coleman D C. Interactions of bacteria, fungi, and their nematode grazers: effects on nutrient cycling and plant growth. Ecological Monographs, 1985, 55(1): 119- 140.

[10]Anderson R V, Elliott E T, McClellan J F, Coleman D C, Cole C V, Hunt H W. Trophic interactions in soils as they affect energy and nutrient dynamics. III. Biotic interactions of bacteria, amoebae, and nematodes. Microbial Ecology, 1977, 4(4): 361- 371.

[11]Coleman D C, Cole C V, Hunt H W, Klein D A. Trophic interactions in soils as they affect energy and nutrient dynamics. I. Introduction. Microbial Ecology, 1977, 4(4): 345- 349.

[12]Abrams B I, Mitchell M J. Role of nematode- bacterial interactions in heterotrophic systems with emphasis on sewage sludge decomposition. Oikos, 1980, 35(3): 404- 410.

[13]Anderson R V, Coleman D C, Cole C V, Elliott E T. Effect of the nematodesAcrobeloidessp. andMesodiplogasterlheritierion substrate utilization and nitrogen and phosphorous mineralization in soil. Ecology, 1981, 62(3): 549- 555.

[14]Anderson R V, Coleman D C, Cole C V, Elliott E T, McClellan J F. The use of soil microcosms in evaluating bacteriophagic nematode responses to other organisms and effects on nutrient cycling. International Journal of Environmental Studies, 1979, 13(2): 175- 182.

[15]Sundin P, Valeur A, Olsson S, Odham G. Interactions between bacteria-feeding nematodes and bacteria in the rape rhizosphere: effects on root exudation and distribution of bacteria. FEMS Microbiology Ecology, 1990, 6(1): 13- 22.

[16]毛小芳, 胡鋒, 陳小云, 李輝信. 不同土壤水分條件下華美新小桿線蟲對枯草芽孢桿菌數(shù)量、活性及土壤氮素礦化的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 18(2): 405- 410.

[17]陳小云, 胡鋒, 李輝信, 毛小芳. 不同悉生培養(yǎng)條件下食細(xì)菌線蟲對細(xì)菌種群的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 14(9): 1585- 1587.

[18]毛小芳, 李輝信, 龍梅, 胡鋒. 不同食細(xì)菌線蟲取食密度下線蟲對細(xì)菌數(shù)量、活性及土壤氮素礦化的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 16(6): 1112- 1116.

[19]Cheng Y H, Jiang Y, Griffiths B S, Li D M, Hu F, Li H X. Stimulatory effects of bacterial-feeding nematodes on plant growth vary with nematode species. Nematology, 2011, 13(3): 369- 372.

[20]Mao X F, Hu F, Griffiths B, Chen X Y, Liu M Q, Li H X. Do bacterial-feeding nematodes stimulate root proliferation through hormonal effects?. Soil Biology and Biochemistry, 2007, 39(7): 1816- 1819.

[21]Mao X F, Hu F, Griffiths B, Li H X. Bacterial-feeding nematodes enhance root growth of tomato seedlings. Soil Biology and Biochemistry, 2006, 38(7): 1615- 1622.

[22]Jiang Y, Wu Y, Xu W S, Cheng Y H, Chen J D, Xu L, Hu F, Li H X. IAA-producing bacteria and bacterial-feeding nematodes promoteArabidopsisthalianaroot growth in natural soil. European Journal of Soil Biology, 2012, 52: 20- 26.

[23]Bongers T. The maturity index: an ecological measure of environmental disturbance based on nematode species composition. Oecologia, 1990, 83(1): 14- 19.

[24]Goodfriend W L, Olsen M W, Frye R J. Soil microfloral and microfaunal response to Salicornia bigelovii planting density and soil residue amendment. Plant and Soil, 2000, 223(1/2): 23- 32.

[25]Newsham K K, Rolf J, Pearce D A, Strachan R J. Differing preferences of Antarctic soil nematodes for microbial prey. European Journal of Soil Biology, 2004, 40(1): 1- 8.

[26]Djigal D, Sy M, Brauman A, Diop T A, Mountport D, Chotte J L, Villenave C. Interactions betweenZeldiapunctata(Cephalobidae) and bacteria in the presence or absence of maize plants. Plant and Soil, 2004, 262(1/2): 33- 44.

[27]肖海峰, 焦加國, 胡鋒, 李輝信. 食細(xì)菌線蟲Caenorhabditiselegans的取食偏好性. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(24): 7101- 7105.

[28]Griffiths B S, Ritz K, Wheatley R E. Nematodes as indicators of enhanced microbiological activity in a Scottish organic farming system. Soil Use and Management, 1994, 10(1): 20- 24.

[29]Venette R C, Ferris H. Influence of bacterial type and density on population growth of bacterial-feeding nematodes. Soil Biology and Biochemistry, 1998, 30(7): 949- 960.

[30]Djigal D, Brauman A, Diop T A, Chotte J L, Villenave C. Influence of bacterial-feeding nematodes (Cephalobidae) on soil microbial communities during maize growth. Soil Biology and Biochemistry, 2004, 36(2): 323- 331.

[31]Sohlenius B. Abundance, biomass and contribution to energy flow by soil nematodes in terrestrial ecosystems. Oikos, 1980, 34(2): 186- 194.

[32]Coleman D C, Reid C P P, Cole C V. Biological strategies of nutrient cycling in soil systems. Advances in Ecological Research, 1983, 13: 1- 55.

[33]Woods L E, Cole C V, Elliott E T, Anderson R V, Coleman D C. Nitrogen transformations in soil as affected by bacterial-microfaunal interactions. Soil Biology and Biochemistry, 1982, 14(2): 93- 98.

[34]Fu S L, Ferris H, Brown D, Plant R. Does the positive feedback effect of nematodes on the biomass and activity of their bacteria prey vary with nematode species and population size?. Soil Biology and Biochemistry, 2005, 37(11): 1979- 1987.

[35]Mikola J, Set?l? H. Productivity and trophic-level biomasses in a microbial-based soil food web. Oikos, 1998, 82(1): 158- 168.

[36]胡鋒, 李輝信, 謝漣琪, 吳珊眉. 土壤食細(xì)菌線蟲與細(xì)菌的相互作用及其對 N, P 礦化—生物固定的影響及機(jī)理. 生態(tài)學(xué)報(bào), 1999, 19(6): 914- 920.

[37]Griffiths B S, Bardgett R D. Interactions between microbe- feeding invertebrates and soil microorganisms// van Elsas J D, Trevors J T, Wellington E M H, eds. Modern Soil Microbiology. New York: CRC Press, 1997: 165- 182.

[38]Mamilov A S, Byzov B A, Zvyagintsev D G, Dilly O M. Predation on fungal and bacterial biomass in a soddy-podzolic soil amended with starch, wheat straw and alfalfa meal. Applied Soil Ecology, 2001, 16(2): 131- 139.

[39]Ferris H, Venette R C, Lau S S. Population energetics of bacterial-feeding nematodes: carbon and nitrogen budgets. Soil Biology and Biochemistry, 1997, 29(8): 1183- 1194.

[40]Blanc C, Sy M, Djigal D, Brauman A, Normand P, Villenave C. Nutrition on bacteria by bacterial-feeding nematodes and consequences on the structure of soil bacterial community. European Journal of Soil Biology, 2006, 42(S1): S70- S78.

[41]Mikola J, Set?l? H. Relating species diversity to ecosystem functioning: mechanistic backgrounds and experimental approach with a decomposer food web. Oikos, 1998, 83(1): 180- 194.

[42]Ferris H, Venette R C, Scow K M. Soil management to enhance bacterivore and fungivore nematode populations and their nitrogen mineralisation function. Applied Soil Ecology, 2004, 25(1): 19- 35.

[43]Marschner P, Yang C H, Lieberei R, Crowley D E. Soil and plant specific effects on bacterial community composition in the rhizosphere. Soil Biology & Biochemistry, 2001, 33(11): 1437- 1445.

[44]Grewal P S. Influence of bacteria and temperature on the reproduction of caenorhabditis elegans (Nematoda: Rhabditidae) infesting mushrooms (Agaricus Bispor Us). Nematologica, 1991, 37(1/4): 72- 82.

[45]Knox O G G, Killham K, Artz R R E, Mullins C, Wilson M. Effect of nematodes on rhizosphere colonization by seed-applied bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(8): 4666.

[46]Knox O G G, Killham K, Mullins C E, Wilson M J. Nematode-enhanced microbial colonization of the wheat rhizosphere. FEMS Microbiology Letters, 2003, 225(2): 227- 233.

bacterial-feeding nematodes in a gnotobiotic microcosm experiment

JIANG Ying1,2, WU Yue1,3, XU Li1, HU Feng1, LI Huixin1,*

1SoilEcologyLab,CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China2CollegeofResourcesandEnvironment,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China3SoilandFertilizerStationofShandongProvince,Jinan250100,China

Abstract：In recent years, the interactions between bacterial-feeding nematodes and bacteria and their ecological functions in terrestrial ecosystems have been recognized to play a crucial role in soil ecology. Many studies have found that bacterial-feeding nematodes increased soil mineralization and improved the supply of inorganic nitrogen, subsequentlystimulating plant growth. The nutrient effect of the soil bacterial-feeding nematodes on root development has been investigated in a microcosm, while the auxin effect remains controversal. An indole acetic acid (IAA)-producing bacteria and two species of bacterial-feeding nematodes were isolated, screened and identified from our experimental soil. Then, a study on the effect of the interaction between aboriginal bacterial-feeding nematodes and IAA-producing bacteria on soil IAA content was implemented in a gnotobiotic microcosm experiment. In the gnotobiotic microcosm experiment, two species of aboriginal nematodes (Cephalobus sp. and Mesorhabditis sp.) grazing on bacteria stimulated both the bacterial growth and activity and increased the mineral nitrogen. The interactions between IAA-producing bacteria and bacterial-feeding nematodes significantly increased soil IAA content. This increase was influenced by bacterial-feeding nematode species and incubation time. Mesorhabditis sp. (cp 1) significantly stimulated the growth of the IAA-producing bacteria at day 10 and day 20. However, compared with Cephalobus sp. (cp 2), Mesorhabditis sp. more significantly increased soil IAA content at day 10 and day 30.

Key Words:bacterial-feeding nematodes; IAA-producing bacteria; gnotobiotic microcosm experiment; interaction; IAA(indole acetic acid)

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970537, 41401274)

收稿日期:2014- 11- 10; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015- 07- 29

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: huixinli@njau.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201411102223

姜瑛, 吳越, 徐莉, 胡鋒, 李輝信.悉生培養(yǎng)微縮體系食細(xì)菌線蟲提高土壤激素含量的機(jī)制.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(9):2528- 2536.

Jiang Y, Wu Y, Xu L, Hu F, Li H X.The possible mechanisms underlying improvement of soil auxin content by bacterial-feeding nematodes in a gnotobiotic microcosm experiment.Acta Ecologica Sinica,2016,36(9):2528- 2536.