徐海燕　丁明山　劉 娟　王環(huán)江　任嗣利

1.中國科學院蘭州化學物理研究所固體潤滑國家重點實驗室　2.中國科學院大學

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枯草芽孢桿菌提高原油采收率的物模驅(qū)油實驗①

徐海燕1，2丁明山1，2劉 娟1，2王環(huán)江1，2任嗣利1

1.中國科學院蘭州化學物理研究所固體潤滑國家重點實驗室2.中國科學院大學

摘要針對目前常規(guī)采油開采技術(shù)的限制和原油采收率較低等問題，本研究采用單因素法對一株從油污中分離的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 32811)代謝產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件進行優(yōu)化并進行微生物驅(qū)油實驗。優(yōu)化條件實驗確定了以葡萄糖為唯一碳源，最佳的無機培養(yǎng)基配方(g/L):ρ(C6H12O6)30.0,ρ(NH4NO3)1.0,ρ(KH2PO4) 4.1,ρ(Na2HPO4·12H2O)14.3,ρ(MgSO4)0.096,ρ(CaCl2)0.0008,ρ(FeSO4)0.0011,ρ(C10H16N2Na2O8)0.0015。發(fā)酵液表面張力從65 mN/ m降至25 mN/ m。通過微生物對原油降解的物模驅(qū)油實驗，得出原油出現(xiàn)乳化及原油重質(zhì)組分含量明顯降低的結(jié)果。物模驅(qū)油實驗中分別注入發(fā)酵液及先注入微生物再注入無機培養(yǎng)液能提高原油采收率26.1%和31.4%。說明枯草芽孢桿菌有利于提高剩余油的采收率，具有良好的應用前景。

關(guān)鍵詞枯草芽孢桿菌生物表面活性劑發(fā)酵工藝乳化降解物理模擬

微生物采油技術(shù)( MEOR)[1-2]主要應用微生物細菌在油田中的代謝過程，產(chǎn)生有利于提高采油率的代謝產(chǎn)物或者直接改善原油物化性質(zhì)，從而提高油田三次采油采收率的方法。與其他的三次采油技術(shù)相比，具有成本低、污染小、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，在三次采油中具有廣闊的應用前景[3-4]。應用微生物三次采油一般可增產(chǎn)10%～46%[5]。菌種單一、提高采收率功能強的優(yōu)質(zhì)菌種不多是目前 MEOR存在的主要問題。因此，性能優(yōu)良的采油微生物的篩選及培養(yǎng)基的條件優(yōu)化是決定微生物正常生長繁殖及提高原油采收率的關(guān)鍵因素?？莶菅挎邨U菌是目前驅(qū)油效果較好的一類微生物，其代謝產(chǎn)生脂肽類表面活性劑可顯著降低油水界面張力，還能使烴類物質(zhì)吸附到微生物細胞表面，促進微生物吸收和降解疏水性的有機物；能改變巖石等表面的潤濕性，具有較強的乳化能力，具備在油田應用的前景[6]。本實驗主要對一株枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件進行工藝優(yōu)化，獲得富產(chǎn)生物表面活性物質(zhì)的發(fā)酵液?？疾炜莶菅挎邨U菌對原油的乳化降解性能，并且模擬地層條件進行微生物驅(qū)油試驗，從而準確評估該菌株以外源注入式應用于三次采油的能力。

1實驗部分

1.1實驗原料

枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtili編號32811)由甘肅省微生物保藏中心提供，在4 ℃下冷凍保藏，每3個月接種一次。實驗中適合微生物生長的無機培養(yǎng)基中各種無機組分含量參照文獻[7]，并做微調(diào)，其組成如下(g/L)：ρ(葡萄糖)30.0，ρ(NH4NO3)1.0，ρ(KH2PO4) 4.1，ρ(Na2HPO4·12H2O)14.3，ρ(MgSO4)0.096，ρ(CaCl2)0.000 8，ρ(FeSO4)0.001 1，ρ(C10H16N2Na2O8)0.001 5。

實驗中使用化學試劑包括石油醚(30～60 ℃)，正庚烷，甲苯，甲醇，二氯甲烷等，均為分析純，西隴化工股份有限公司提供。硅膠(0.05～0.075 mm)，青島海浪硅膠干燥劑有限公司提供，中性氧化鋁(0.05～0.075 mm)，國藥集團化學試劑有限公司提供。實驗中所用水為超純水(18.25 mΩ·cm)。原油由長慶油田提供，屬中黏度原油。

1.2菌株培養(yǎng)方法

將保存在斜面上的枯草芽孢桿菌用接種環(huán)以劃線形式植入已經(jīng)過間歇式滅菌處理、其內(nèi)裝有100 mL無機培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30 ℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)。經(jīng)過60 h的培養(yǎng)，獲得新鮮菌液。將5%的新鮮菌液離心去除清液后，用無機培養(yǎng)基洗滌三次，然后轉(zhuǎn)接入已滅菌含有150 mL培養(yǎng)基中，于30 ℃、120 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。

1.3發(fā)酵工藝優(yōu)化分析方法

應用UV-2000紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)定時測定細菌懸浮液在600 nm下的吸光度值[8]，并記錄數(shù)據(jù)，繪制菌株生長曲線。利用懸滴法界面張力儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)有限公司)測試上清液的表面張力。測試中，每個樣品平行測3次，取平均值。實驗前先用純水做校正。

確定最佳培養(yǎng)基配方時，分別改變接種細菌的含量，每隔12 h測量培養(yǎng)液的吸光度、表面張力，從而確定最優(yōu)接種量。

1.4單因素法確定最佳培養(yǎng)基配方

參考文獻[9]分別采用甘油、葡萄糖、菜籽油和檸檬酸三鈉進行碳源種類篩選，確定最優(yōu)碳源及含量。然后在該碳源含量下，采用硝酸銨、尿素和硝酸鈉進行氮源種類篩選，確定最優(yōu)氮源及含量。

1.5原油降解實驗

搖床振蕩培養(yǎng)一定時間后，離心分離獲得上層油相，加入20 mL石油醚，轉(zhuǎn)至分液漏斗萃取，振蕩1 min，靜置，待分層后分離，收集上層液，用石油醚洗滌2～3次，合并油相并用無水硫酸鈉脫水，自然干燥至恒量，稱量[10]。原油降解率W的計算如式(1)：

(1)

式中：m1為對照組的殘油質(zhì)量，g；m2為處理后樣品的殘油質(zhì)量，g。

將降解前后的原油進行GC-MS分析，分析降解前后原油組分的變化。

1.6微生物處理前后原油四組分分析

瀝青組成非常復雜，根據(jù)其組成極性和相對分子質(zhì)量依次增大而分為飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)4種組分[11]。根據(jù)瀝青質(zhì)不溶于正庚烷而其他3種組分溶于正庚烷的原理，用正庚烷沉淀法分離瀝青質(zhì)[12]。分離出瀝青質(zhì)后，將剩余3種組分( maltenes)收集、減壓蒸餾、干燥。采用柱色譜法分離，得到的組分用減壓蒸餾去除溶劑，干燥后稱量并計算各組分含量[13-15]。實驗重復3次，取平均值。

1.7物模驅(qū)油實驗

篩選砂粒粒徑參照文獻[16]，小于106 μm(占2.6%),106～250 μm(占48.1%),250～450 μm(占34.7%),450～900 μm(占9.2%),大于900 μm(占5.4%)，清洗沙子除去泥土及相關(guān)雜質(zhì)，在500 ℃的條件下灼燒3～4 h，將不同粒度的沙子混合均勻，放入填砂模型中。

模擬地層水組成參照文獻[17],如表1所示：

表1 模擬地層水組成mg·L-1Table1 Compositionofsimulationformationwater組成ρ(NaCl)ρ(KCl)ρ(CaCl2)ρ(MgCl2·6H2O)ρ(Na2SO4)ρ(NaHCO3)總礦化度數(shù)值229413421727518604456

參照文獻[18]進行驅(qū)油實驗，驅(qū)油步驟如下：

(1) 柱塞計量泵以3 mL/min向填砂模型中注入地層水，直至注入水與流出水體積相同為止。

(2) 以2 mL/min注入原油，計算巖心的原始含油飽和度[17]。

(3) 以3 mL/min注入地層水，計算一次水驅(qū)采收率。

(4) 以2 mL/min注入微生物菌液。恒溫放置3～5天。

(5) 以3 mL/min注入地層水，計算原油采出率?；?qū)⒎蛛x出的微生物注入填砂模型中，再注入無機培養(yǎng)液進行驅(qū)油實驗，比較微生物注入前后的地層水驅(qū)油效果。

2結(jié)果與討論

2.1優(yōu)化培養(yǎng)基

2.1.1篩選碳源

圖1為不同碳源對微生物生長曲線和發(fā)酵液表面張力的影響。由圖1(a)可知，枯草芽孢桿菌可以利用葡萄糖、甘油等碳源進行生長繁殖。以葡萄糖、菜籽油為碳源時，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的生物量明顯優(yōu)于甘油和檸檬酸三鈉。說明枯草芽孢桿菌利用葡萄糖和菜籽油的能力優(yōu)于甘油和檸檬酸三鈉。從圖1(b)可以看出，葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)液表面張力降低最大，表面張力最低可達到25 mN/m左右。因此，本實驗選擇葡萄糖作為碳源。

圖2為葡萄糖濃度對微生物生長曲線和發(fā)酵液表面張力的影響。從圖2(a)可知，隨著碳源質(zhì)量分數(shù)的增加，微生物產(chǎn)生的生物量增加，吸光度值增加，其中3%(w，下同)的葡萄糖培養(yǎng)液中產(chǎn)生的生物量最多。隨著葡萄糖濃度繼續(xù)增大，培養(yǎng)液的滲透壓增大[22]，對細菌的生長產(chǎn)生抑制作用，導致細菌生物量降低。從圖2(b)可以看出，當葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為1%、3%和5%時，培養(yǎng)液的表面張力相差不大，均為約25 mN/m。結(jié)合圖2(a)，選擇3%的葡萄糖作為碳源進行實驗。

2.1.2篩選氮源

圖3為不同氮源對微生物生長曲線和發(fā)酵液表面張力的影響。從圖3(a)可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，微生物代謝產(chǎn)生生物量增加，硝酸銨和硝酸鈉在60 h吸光度值最大，說明此時產(chǎn)生的生物量最多。尿素作為氮源的培養(yǎng)基在84 h吸光度值最大，約為3.5左右，說明枯草芽孢桿菌均能在上述3種物質(zhì)為氮源的培養(yǎng)基中正常生長。從圖3(b)可知，硝酸銨作為氮源比硝酸鈉和尿素作為氮源時的表面張力都低。綜合考慮，選擇硝酸銨作為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖4為氮源濃度對微生物生長曲線和發(fā)酵液表面張力的影響。由圖4(a)可知，培養(yǎng)基的吸光度隨培養(yǎng)時間的延長而增加，0.1%(w，下同)硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中吸光度值最大。從圖4(b)知，不同硝酸銨濃度下的表面張力相差不大，主要是從吸光度來確定硝酸銨的濃度。細菌在高濃度的氮源培養(yǎng)基中生長速度快，可能造成碳源和氧氣等物質(zhì)缺乏，細菌生長速度降低，進而會逐漸衰亡[19]。因此，選擇0.1%硝酸銨為氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.1.3優(yōu)化細菌接種量

圖5為接種量對細菌生長的影響。由圖5可知，不同接種量的培養(yǎng)基的吸光度值隨著培養(yǎng)時間的延長均增大，產(chǎn)生的生物量增多。但相同時間內(nèi)不同含量的細菌對生長量的影響很小，原因是與培養(yǎng)液體積相比，菌齡及細菌本身的生物活性是影響細菌正常生長繁殖的主要因素。因此，細菌最優(yōu)接種量為2%(φ，下同)。

圖6為原油乳化情況。從圖6可以看出，細菌培養(yǎng)前，原油浮于培養(yǎng)基表面，呈片狀，有明顯分層現(xiàn)象。培養(yǎng)7天后，與空白對照相比，枯草芽孢桿菌進行生長繁殖，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，并且將原油乳化分散，油液形成細小的油珠，產(chǎn)生部分油水混相。培養(yǎng)60天后，原油基本上被完全乳化。說明枯草芽孢桿菌能在原油作為碳源的培養(yǎng)基中生長，并能乳化降解原油。

根據(jù)式(1)計算出培養(yǎng)7天后原油降解率為21.8%。培養(yǎng)60天后原油降解率為83.6%。進一步說明了枯草芽孢桿菌能降解原油。

將經(jīng)枯草芽孢桿菌處理前后的原油成分GC- MS譜圖對比分析(見圖7)，結(jié)合積分計算峰面積，得出原油在微生物處理后重質(zhì)組分減少，長鏈烴類減少。說明枯草芽孢桿菌有降解原油的能力。這與微生物驅(qū)油過程中細菌及代謝產(chǎn)物具有降解原油組分等相關(guān)機理相符。因此，該細菌滿足微生物驅(qū)油菌種所需的條件，對其在微生物驅(qū)油中的應用將做進一步研究。

2.2微生物處理前后原油4組分分析

用正庚烷沉淀法確定該原油中瀝青質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)為4.56%。微生物作用后，原油瀝青質(zhì)組分明顯減少，約為0.5%。從表2可知,微生物處理后，飽和烴、芳香烴含量降低，膠質(zhì)含量增加。瀝青質(zhì)組分減少是因為微生物能將重質(zhì)組分降解。飽和烴、芳香烴含量降低是因為低相對分子質(zhì)量的正構(gòu)烷烴能夠優(yōu)先被微生物利用。膠質(zhì)含量增加可能是因為微生物將瀝青質(zhì)降解為小分子的膠質(zhì)。因為膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，而膠質(zhì)的相對分子質(zhì)量較小[14]。

表2 微生物處理前后軟瀝青中3組分含量Table2 Threecomponentsfractionsofmalteneincrudeoilbeforeandaftertreatedbymicrobes軟瀝青處理前處理后w(飽和烴)/%48.4±2.342.6±2.8w(芳香烴)/%15.2±0.611.8±0.5w(膠質(zhì))/%25.5±0.830.0±1.5總回收率/%89.1±0.584.4±0.8 注:在層析柱分離軟瀝青過程中,部分組分吸附在填料中未被洗出[12]。

2.3物模驅(qū)油實驗

枯草芽孢桿菌物模驅(qū)油實驗結(jié)果如表3所示。

從表3得出，在其他相同條件下, 注入發(fā)酵84 h的微生物菌液和直接注入微生物再注入等量無機培養(yǎng)液后，其采收率有明顯的提高,原油采收率分別提高26.1%和31.4%。注入微生物發(fā)酵液主要利用代謝產(chǎn)生的表面活性劑進行驅(qū)油。直接注入微生物再注入無機培養(yǎng)液，使微生物在地層中生長繁殖，微生物自身及其代謝產(chǎn)物都有利于提高原油采收率。因此，后者注入方式更有利于提高原油采收率。

表3 物理模擬微生物提高采收率實驗參數(shù)Table3 MEORparametersofphysicalsimulationexperiment微生物驅(qū)方式θ/%V1/mLV2/mLOOIP/%R1/%R2/%R/%發(fā)酵液驅(qū)36.729724883.552.726.178.8微生物+無機培養(yǎng)液驅(qū)37.727823584.553.431.484.8 注:θ為孔隙度;V1為注入原油量;V2為油驅(qū)出水量;OO-IP為原油飽和度;R1為一次原油采收率;R2為微生物提高采收率;R為總采收率。

3結(jié) 論

(1) 本實驗通過單因素分析方法，確定了枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基配方(g/L):ρ(C6H12O6)30.0,ρ(NH4NO3)1.0,ρ(KH2PO4) 4.1,ρ(Na2HPO4·12H2O)14.3,ρ(MgSO4)0.096,ρ(CaCl2)0.0008,ρ(FeSO4)0.0011,ρ(C10H16N2Na2O8)0.0015。在此條件下，發(fā)酵液表面張力可降至25 mN/ m。

(2) 枯草芽孢桿菌能利用原油進行代謝生長，并對原油有一定的乳化降解作用，能顯著降低重質(zhì)組分含量，對輕質(zhì)組分也有一定的降解作用。

(3) 枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中細胞本身及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有降低表面張力，降解原油重質(zhì)組分等性能，注入發(fā)酵液和微生物后原油采收率分別提高26.1%和31.4%。說明枯草芽孢桿菌符合微生物驅(qū)油中采油微生物的要求，具有提高油藏剩余油采收率的潛力。

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Physical simulation experiment of oil displacement by bacillus subtilis for enhanced oil recovery

Xu Haiyan1，2, Ding Mingshan1，2, Liu Juan1，2, Wang Huanjiang1，2, Ren Sili1

(1.StateKeyLaboratoryofSolidLubrication，LanzhouInstituteofChemicalPhysics，ChineseAcademyofSciences，Lanzhou730000，China; 2.UniversityofChineseAcademyofScience,Beijing100049,China)

Abstract:Based on the limitation of conventional oil mining technology and the low oil recovery, in this study, with the method of single factor, the fermentation conditions of a strain of bacillus subtilis isolated from contamination soil was optimized, and microbial enhanced oil recovery experiment was carried on. Glucose was determined as the sole carbon source by optimized condition experiment, and the optimum medium formula was (g/L): C6H12O6，30.0; NH4NO3，1.0; KH2PO4，4.1; Na2HPO4·12H2O，14.3; MgSO4，0.096; CaCl2，0.000 8; FeSO4，0.001 1; C10H16N2Na2O8，0.0015. It was found that the surface tension of culture medium decreased from 65 mN/m to 25 mN/m. The physical simulation of oil displacement with microbial degradation indicated that the emulsification appeared during the treatment and biodegradation of crude oil resulted in decrease of heavy component in crude oil. In the oil displacement experiments, separately injected fermented liquid and injected microbes first then injected inorganic medium, the oil recovery enhanced of 26.1% and 31.4% respectively. Bacillus subtilis has good prospect in promoting the displacement of residual oil in reservoir.

Key words:bacillus subtilis, biosurfactants, fermentation process, emulsification biodegradation, physical simulation

基金項目：國家自然科學基金面上項目“含有共軛體系的炭基納米材料用于原油乳狀液破乳實驗與分子動力學模擬研究”(51574217)；國家自然科學基金面上項目“油砂水基提取過程中的表面與界面行為研究”(51374195)。

作者簡介:徐海燕(1990-),女，在讀碩士，主要從事微生物采油方向的研究工作。E-mail:xuhy@licp.cas.cn

中圖分類號：TE357

文獻標志碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-3426.2016.03.013

收稿日期：2015-09-28；編輯：馮學軍