孟　敏，王竹林，胡　甘

(西北農(nóng)林科技大學(xué)　農(nóng)學(xué)院，陜西　楊凌　712100)

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同源多倍體誘導(dǎo)與鑒定實(shí)驗(yàn)中的問題探討

孟敏，王竹林，胡甘

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要針對(duì)同源多倍體誘導(dǎo)與細(xì)胞學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)中，存在實(shí)驗(yàn)材料霉?fàn)€，同源多倍體誘導(dǎo)率低，細(xì)胞學(xué)鑒定時(shí)染色體著色淺，制片時(shí)染色體不分散等問題，該文在豌豆實(shí)驗(yàn)中探索出一套染色體誘導(dǎo)、解離、染色、制片等最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的完整組合，能有效提高豌豆同源多倍體實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備與教學(xué)工作效率。

關(guān)鍵詞豌豆；同源多倍體；誘導(dǎo)；秋水仙素；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

隨著對(duì)多倍體生物的深入研究，越來越多的人認(rèn)為，多倍化在生物的演化歷史上扮演了重要的角色[1]。多倍體因其個(gè)體大、適應(yīng)性強(qiáng)的特征[2]，使多倍體動(dòng)植物的深入研究在生物進(jìn)化和遺傳育種方面具有重要意義，多倍體的遺傳研究也因此成為各大農(nóng)林院校的熱門話題[3-5]。

同源多倍體誘導(dǎo)與鑒定實(shí)驗(yàn)通過了解誘導(dǎo)植物同源多倍體遺傳原理，初步了解人工誘導(dǎo)植物同源多倍體的方法及其細(xì)胞學(xué)鑒定技術(shù)。該實(shí)驗(yàn)既是培養(yǎng)學(xué)生科研意識(shí)和能力的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，又是指導(dǎo)學(xué)生學(xué)習(xí)遺傳學(xué)理論和探索實(shí)踐的重要實(shí)驗(yàn)。為了簡化實(shí)驗(yàn)過程，本文選取簡單易得的豌豆作為實(shí)驗(yàn)材料，以秋水仙素作為誘變劑。但是，實(shí)驗(yàn)中往往會(huì)出現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)豌豆發(fā)生霉?fàn)€，豌豆染色體不加倍，因誘導(dǎo)時(shí)間偏長導(dǎo)致染色體倍數(shù)不穩(wěn)定，顯微鏡下看不清染色體數(shù)量等問題。通過多年的實(shí)驗(yàn)探索，我們總結(jié)摸索出一套能有效解決這些問題的實(shí)驗(yàn)方案，該方案操作簡便、高效加倍、鏡檢重復(fù)性好，對(duì)同行有很好的借鑒意義。

1多倍體誘導(dǎo)

1.1選種與清洗

1.2萌芽培養(yǎng)

將清洗干凈、覆蓋好的豌豆種子置于人工氣候箱內(nèi)，將溫度調(diào)控在25 ℃。大約24 h后，待絕大部分豌豆種子萌發(fā)至胚根長出約0.5 cm長時(shí)，連帶白瓷盤一并取出備用。

1.3秋水仙素誘導(dǎo)

圖1　誘導(dǎo)后，根尖膨大。左側(cè)樣品未經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)處理，右側(cè)樣品經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)處理，箭頭示處明顯膨大

2細(xì)胞學(xué)鑒定

我們?cè)谠搶?shí)驗(yàn)中也使用常規(guī)制片，常規(guī)壓片方法操作簡單，無須特殊藥品，是研究和鑒定染色體的首選方法[7]，比較適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

2.1課前解離

每次課前半小時(shí)，將固定好的豌豆根尖取出，置于50 mL的小燒杯中，用清水漂洗干凈表面的乙醇。再用1 mol/L HCl溶液(82.5 mL濃HCl+917.5 mL ddH2O)洗滌一次，倒去HCl溶液，再倒入20 mL 1mol/L HCl，置于60℃水浴鍋中解離8～10 min[8](期間用玻璃棒攪動(dòng)數(shù)次，使燒杯內(nèi)受熱均勻)。待觀察到根尖膨大處呈現(xiàn)乳白色半透明狀時(shí)停止解離，用蒸餾水漂洗干凈，置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)待用。

2.2制片鑒定

制片具體步驟如下：1)仔細(xì)切取乳白色的根尖分生組織，置于潔凈干燥的載玻片上；2)在載玻片上，滴1滴改良苯酚品紅染色液[9]，用醫(yī)用鑷子搗碎組織(但不能搗成殘?jiān)鼱?，除去纖維組織；3)用酒精燈外焰烤片8～10次(每次1～2 s，溫度以不燙手背為宜)，期間若染色液揮發(fā)變干，要及時(shí)滴加；4)蓋上蓋玻片，注意趕出氣泡，吸水紙吸去多余染液后，大拇指垂直輕輕按壓，并用解剖針手柄輕輕敲打壓片；5)再次置于酒精燈外焰烤片5～6次(用微火，避免烤焦)；6)Motic Digital Microsoope DMB SERIES DWB5-223-5型數(shù)碼顯微鏡下鏡檢觀察，視野下尋找分裂中期染色體加倍的細(xì)胞如圖2所示，并照相。

圖2　四倍體豌豆，細(xì)胞分裂中期，染色體加倍，視野下清晰可見28條染色體

3結(jié)束語

豌豆個(gè)體小，體細(xì)胞染色體數(shù)目少(2n=14)[10]，是遺傳學(xué)研究和教學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)材料。秋水仙素作為一種植物多倍體誘導(dǎo)的藥劑，其獨(dú)特的作用原理是阻止細(xì)胞分裂中期紡錘體的形成，致使分裂后期染色體不能移向兩級(jí)，而組成一個(gè)雙倍性的細(xì)胞核，從而使細(xì)胞染色體數(shù)目加倍，成為公認(rèn)的多倍體誘導(dǎo)有效的藥劑。適宜濃度的秋水仙素和誘導(dǎo)時(shí)間，是植物染色體加倍實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。關(guān)于濃度和處理時(shí)間的最適宜組合問題，目前尚有不同看法。有些學(xué)者認(rèn)為低濃度、長時(shí)間的組合較好，還有一些學(xué)者傾向于高濃度、短時(shí)間的組合[11]。我們?cè)趯?duì)比參考眾多學(xué)者的研究基礎(chǔ)上，找到了最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的組合，實(shí)現(xiàn)了豌豆同源多倍體的高效誘導(dǎo)，為實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)材料。在制片環(huán)節(jié)，我們選擇常規(guī)制片法，并注重染色、烤片、壓片等操作細(xì)節(jié)，此法具有簡便、高效、低污染、易學(xué)等優(yōu)點(diǎn)，在同類實(shí)驗(yàn)教學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和參考意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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Discussion on Some Problems of the Experiment on the Induction and Identification of Autopolyploid

MENG Min，WANG Zhulin，HU Gan

(College of Agronomy，Northwest A & F University，Yangling 712100，China)

AbstractIn order to solve the problems of the experiment on induction and identification on autopolyploid，such as material mildew，induced autopolyploid rate low，chromosome staining shallow in cytological identification，production chromosomes not scattered，and so on，we explored a set of best combinatorial methods in pea experiment on chromosomes induction，induced dissociation，dyeing，and production，which can effectively improve the peas autopolyploid experimental preparation and teaching efficiency.

Key wordspea；autopolyploid；induction；colchicine；experiment teaching

收稿日期:2015-06-29；修改日期: 2015-08-29

作者簡介：孟敏(1978-)，女，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事本科遺傳實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研工作。

中圖分類號(hào)

文獻(xiàn)標(biāo)志碼

doi:10.3969/j.issn.1672-4550.2016.02.011