張　昕，涂　波，趙娟娟，聶為民，陳威巍，王福生，張　政

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·論 著·

3型天然淋巴細(xì)胞在HIV-1慢性感染中的免疫特征及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系研究

張昕，涂波，趙娟娟，聶為民，陳威巍，王福生，張政

［摘要］目的 探討HIV-1慢性感染過程中，外周血3型天然淋巴細(xì)胞（group 3 innate lymphoid cells， ILC3s）的頻率變化及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。方法 募集48例HIV-1慢性感染者和17例健康對(duì)照，留取外周血并分離單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)ILC3s頻率，同時(shí)分析ILC3s頻率與患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量的相關(guān)性。結(jié)果 與健康對(duì)照比較，HIV-1感染者外周血總的ILC3s頻率顯著下降（P＜0.001） ；其中尤以NCR-ILC3s下降更為顯著（P＜0.001）。進(jìn)一步分析顯示：HIV-1感染者外周血ILC3s頻率與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱正相關(guān)（r=0.461，P= 0.001），而與血漿病毒載量呈弱負(fù)相關(guān)（r=-0.399， P= 0.005）。結(jié)論 HIV-1慢性感染者外周ILC3s顯著減少，并與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。該研究為闡明HIV-1慢性感染致病機(jī)制提供了新的解釋。

［關(guān)鍵詞］HIV-1；HIV感染；T-淋巴細(xì)胞， 輔助誘導(dǎo)；CD4-陽性T淋巴細(xì)胞

天然淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cells， ILCs）是新近鑒定的一群淋巴細(xì)胞，不表達(dá)T細(xì)胞受體，在天然免疫反應(yīng)和組織修復(fù)重建中具有調(diào)節(jié)功能［1］。根據(jù)特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞因子產(chǎn)生種類，ILCs可以分為3型［2-3］：1型ILCs（ILC1s）定義為CD45+lin-CD127+CD117-細(xì)胞，主要產(chǎn)生IFN γ，依賴于T細(xì)胞表達(dá)T盒發(fā)揮作用［4］；2型ILCs（ILC2s）是CD45+lin-CD127+CRTH2+的細(xì)胞，主要產(chǎn)生IL-5和IL-13等2型細(xì)胞因子，依賴GATA分子合蛋白3發(fā)育［5］；3型ILCs（ILC3s）是CD45+lin-CD127+CD117+細(xì)胞，主要產(chǎn)生IL-17、IL-22，依賴轉(zhuǎn)錄因子RORγt發(fā)育［6］。研究表明，ILCs的變化與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。

ILC3s是人體內(nèi)重要的一類ILCs亞群，在腸道自身免疫性疾病以及感染性疾病的進(jìn)展中均發(fā)揮重要作用。有研究顯示，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus， SIV）急、慢性感染可導(dǎo)致產(chǎn)生IL-17的ILCs細(xì)胞持續(xù)減少，尤其在腸道中更顯著［8-9］，但I(xiàn)LC3s在HIV-1慢性感染中的變化及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚不清楚。本文擬對(duì)HIV-1慢性感染者外周血ILC3s的頻率及其與反映疾病程度指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行研究，并探討ILC3s的變化在HIV-1感染后免疫致病過程中的作用機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 所有HIV-1慢性感染者（HIV感染組）均來自于2013年1月—2014年12月就診于解放軍第三〇二醫(yī)院的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①年齡18～65歲，自愿參加本研究者；②經(jīng)免疫印跡法（Western Blot， WB）確診的HIV-1感染者；③還未開始高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy， HAART）；④無機(jī)會(huì)性感染；⑤無糖尿病、高血壓、心臟病等慢性器質(zhì)性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲或＞65歲者；②已經(jīng)開始HAART治療者；③妊娠婦女或產(chǎn)褥期婦女；④目前存在機(jī)會(huì)性感染者；⑤精神病患者，或其他不能合作或不愿合作者。通過篩選，共納入患者48例，其中，男41例，女7例，平均年齡（34.1±11.6）歲。38例通過性途徑傳播，6例通過血液途徑傳播，4例不明。CD4+T淋巴細(xì)胞均值300（9～986）/μl，血漿HIV載量均值81 600（＜40～731 000）copies/ml。同時(shí)，我們募集了17例年齡、性別相當(dāng)?shù)慕】祩€(gè)體作為健康對(duì)照組，其中，男14例，女3例；平均年齡（31.1±10.8）歲。入組所有病例及對(duì)照均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 本實(shí)驗(yàn)所用的主要熒光抗體如下：小鼠抗人CD45-APC-Cy7（美國 BD Pharmingen公司）、小鼠抗人lineage-FITC（美國 BD公司）、小鼠抗人CD127-PE-Cy7（美國Biolegend公司）、小鼠抗人CD117-BV421（美國Biolegend公司）和小鼠抗人NKp44-APC（美國Biolegend公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離單個(gè)核淋巴細(xì)胞 取新鮮采集的肝素鈉抗凝血，離心去除血漿后，用PBS緩沖液稀釋1倍，加至淋巴細(xì)胞分

離液上層，2500 r/min，離心25 min，取中間白膜層（即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層），PBS緩沖液洗滌2遍，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMCs）。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ILC3s亞群的表達(dá) PBMCs計(jì)數(shù)后懸于含2％胎牛血清的PBS緩沖液中，調(diào)整濃度為2.0×107cells/ml。染色步驟如下：①取2支流式管，分別標(biāo)記檢測(cè)管和對(duì)照管，均加入100 μ l PBMCs懸液。②檢測(cè)管加入抗體組合，相應(yīng)的對(duì)照管加入同型抗體組合，混勻后4 ℃避光孵育30 min。③用2 ml含2％胎牛血清的PBS緩沖液洗滌2次，1200 r/min離心5 min后，棄上清。④兩管均加入1％多聚甲醛固定，2～8 ℃避光存放，等待上機(jī)檢測(cè)。調(diào)整流式細(xì)胞儀（FACS Verse，美國BD公司）參數(shù)設(shè)定后，使用相同電壓和熒光補(bǔ)償檢測(cè)各管樣本。每管樣本至少獲取1×106個(gè)有核細(xì)胞的熒光和散射光信號(hào)，使用Flowjo分析軟件進(jìn)行ILC3s亞群分析。

2　結(jié)　　果

圖1　ILC3s圈門策略Figure 1 Gating strategy for ILC3s

2.1 流式圈門策略 首先，我們?cè)O(shè)定了流式染色方案（圖1）。圈定淋巴細(xì)胞群，選定CD45+白細(xì)胞，而后選定lineage陰性細(xì)胞。根據(jù)CD127和CD117，我們?nèi)Χㄍ庵蹸D127+CD117+的淋巴細(xì)胞為ILC3s，這一細(xì)胞亞群又進(jìn)一步根據(jù)NKp44表達(dá)與否分為NCR+ILC3s（Lin-CD127+CD117+NKp44+）和NCR-ILC3s（Lin-CD127+CD117+NKp44-）亞群。2.2 HIV-1感染 者 外周血ILC3s的頻率變化 所有HIV-1感染者PBMCs均包含Lin-CD127+CD117+ILC3s。與健康人外周血ILC3s頻率［（7.711％±3.728％），以占CD45+Lin-細(xì)胞比例計(jì)算，以下同］比較，HIV-1感染者的外周血ILC3s頻率［2.980％（1.523％，3.848％）］顯著降低（U=93.500，P= 0.000），見圖2A。進(jìn)一步觀察NCR-ILC3s和NCR+ILC3s頻率在HIV-1感染者的變化發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染者NCR-ILC3s的頻率［2.720％（1.410％，3.785％）］顯著低于健康人（7.308％±3.648％）（U=101.500，P=0.000），見圖2B。而NCR+ILC3s的頻率［0.10％（0.00％，0.35％）］同樣低于健康對(duì)照組［0.29％（0.09％，0.67％）］，（U=270.000，P＜0.031），見圖2C。

圖2　HIV感染組與健康組外周血總ILC3s、NCR-ILC3s以及NCR+ILC3s頻率A. 2組間ILC3s頻率差異；B. 2組間NCR-ILC3s頻率差異；C. 2組間NCR+ILC3s頻率差異Figure 2 Frequencies of ILC3s， NCR-ILC3s and NCR+ILC3s in HIV-infected group and healthy control group

2.3 HIV-1感染者外周血ILC3s細(xì)胞與疾病進(jìn)展的關(guān)系 我們進(jìn)一步分析了HIV-1感染者外周血ILC3s頻率與疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志物：外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和血漿HIV-1載量的相關(guān)性。分析表明，HIV-1感染者外周血ILC3s的百分比與其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱正相關(guān)（r=0.461， P=0.001），見圖3；而與血漿中HIV-1病毒載量的常用對(duì)數(shù)（lg）呈弱負(fù)相關(guān)（r=-0.399，P=0.005），見圖4。這些數(shù)據(jù)表明外周ILC3s的減少與HIV-1感染者的疾病發(fā)展相關(guān)。

圖3　HIV-1慢性感染者外周血CD4+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與ILC3s頻率相關(guān)性Figure 3 Association between CD4+T lymphocute counts and the frequency of ILC3s in patients with chronic HIV-1 infection

3　討　　論

ILCs亞群在HIV-1感染中的變化特點(diǎn)及其與疾病進(jìn)展的關(guān)系尚不明確。本研究初步觀察了HIV-1慢性感染者外周血ILC3s的頻率變化，發(fā)現(xiàn)HIV-1慢性感染顯著刪除了機(jī)體ILC3s細(xì)胞，并且這種降低與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。該研究為HIV-1感染的致病機(jī)制提供了新的機(jī)制解釋，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)提供了重要依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，隨著HIV-1感染病情進(jìn)展，ILC3s進(jìn)行性降低，尤其以NCR-ILC3s為主。下降的原因還不清楚，可能與HIV-1誘導(dǎo)的凋亡增加或組織遷移有關(guān)系［8］。將來的研究須要進(jìn)一步明確凋亡相關(guān)的分子，例如Fas/FasL、TRAIL等關(guān)鍵凋亡分子在HIV-1中的表達(dá)；以及患者淋巴組織內(nèi)ILC3s的變化情況。此外，NCR+和NCR-ILC3s的差異刪除的原因也須要進(jìn)一步闡明。

以往研究證實(shí)，ILC3s主要產(chǎn)生IL-17和IL-22，這兩種細(xì)胞因子通過促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞完整性而維持著黏膜免疫屏障功能［10-11］。研究表明，慢性HIV-1/SIV感染中多種產(chǎn)生上述細(xì)胞因子的細(xì)胞，例如Th17細(xì)胞、NKp44+NK22細(xì)胞和CD3-CD8hi亞細(xì)胞群，均顯著下降［7，12］。這些細(xì)胞的減少將破壞腸道黏膜完整性，導(dǎo)致微生物移位，進(jìn)而引起免疫超活化和疾病發(fā)展。將來的研究應(yīng)該闡明HIV-1慢性感染過程中，ILC3s產(chǎn)生IL-17和IL-22等細(xì)胞因子的能力的變化特點(diǎn)及其與腸道免疫屏障功能損傷的關(guān)系。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，HIV感染者ILC3s減少與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈弱正相關(guān)，而與血漿HIV-1載量呈弱負(fù)相關(guān)，提示ILC3s可以充當(dāng)新的免疫標(biāo)志物。將來的大樣本研究隊(duì)列可能會(huì)闡明在HIV-1慢性感染過程中，ILC3s數(shù)量減少作為疾病進(jìn)展預(yù)測(cè)標(biāo)志物的特異性和敏感性。

許多研究已經(jīng)證實(shí)，ILCs亞群具有組織分布的特異性。例如ILC1s，包括自然殺傷細(xì)胞，主要存在于胎兒腸道和肝內(nèi)；ILC2s主要存在于人類外周血、肺部和肝臟；ILC3s主要存在于人類皮膚組織、胸腺、扁桃體、脾臟和腸道內(nèi)［6，13-15］。由于獲得人體組織的方法有限，我們的研究?jī)H限于HIV感染者的外周血ILC3s，因而不能很好地描述人體組織內(nèi)的ILCs亞群免疫學(xué)特點(diǎn)及其在健康狀態(tài)和疾病狀態(tài)下的功能差異。

總之，我們發(fā)現(xiàn)HIV-1慢性感染者外周血ILC3s顯著減少，并與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。該研究從另一個(gè)新的角度闡明了ILC3s在HIV-1慢性感染中的免疫保護(hù)機(jī)制，也為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)提供了重要依據(jù)。

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（2016-01-18 收稿 2016-02-15 修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 盧福昱）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國圖書資料分類號(hào)］ R512.91 A

［文章編號(hào)］1007-8134（2016）03-0144-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.005

*Corresponding author， E-mail： zhangzheng1975@aliyun.com

［基金項(xiàng)目］全軍“十二五”科研重點(diǎn)項(xiàng)目（BWS12J006）

［作者單位］100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（張昕、涂波、聶為民、陳威巍、王福生 ），臨床研究管理中心（趙娟娟、張政）（張昕、涂波為并列第一作者）

［通訊作者］張政，E-mail∶ zhangzheng1975@aliyun.com

Characteristics of group 3 innate lymphoid cells in chronic HIV-1 infection and their associations with disease progression

Zhang Xin， TU Bo， ZHAO Juan-juan， NIE Wei-min， CHEN Wei-wei， WANG Fu-sheng， ZHANG Zheng*
Research Center for Treatment and Diagnosis of Infectious diseases， 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China

［Abstract］Objective To evaluate the changes of the frequency of group 3 innate lymphoid cells （ILC3s） in peripheral blood in patients with chronic HIV-1 infection and its association with disease progression. Methods A total of 48 patients with chronic HIV-1 infection and 17 healthy controls were enrolled in the study. Peripheral blood mononuclear cells were used to detect the frequency of ILC3s. In addition， the associations between the frequency of ILC3s and peripheral blood CD4+T lymphocyte counts and plasma HIV-1 load were further analyzed. Results As compared with healthy controls， the frequency of ILC3s decreased significantly in patients with chronic HIV-1 infection （P＜0.001）， particularly that of ILC3s with natural cytotoxicity receptors negative decreased more significantly. Further analysis indicated that the frequency of ILC3s was weakly positively correlated with peripheral blood CD4+T lymphocyte counts （r=0.461， P=0.001） and weakly negatively correlated with plasma HIV-1 load （r=-0.399， P=0.005）. Conclusions The frequency of peripheral blood ILC3s decreases significantly in patients with chronic HIV-1 infection， and is associated with disease progression. This study highlights a novel mechanism in the immune pathogenesis in chronic HIV-1 infection.

［Key words］HIV-1； HIV infections； T-lymphocytes， helper-inducer； CD4-positive T-lymphocytes