賀　雄，楊栗坤，曹艷龍，孫雯娜，王心靜，程小星，王仲元

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抗酸桿菌液基薄層涂片方法的臨床應(yīng)用研究

賀雄，楊栗坤，曹艷龍，孫雯娜，王心靜，程小星，王仲元

［摘要］目的 評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌液基薄層涂片法對(duì)不同類型標(biāo)本的染色檢查效能。方法 對(duì)200份住院1周內(nèi)結(jié)核病患者的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行液基薄層方法與直接涂片法鏡檢抗酸桿菌，其中包括148份晨痰標(biāo)本，52份體液標(biāo)本，比較2種方法的陽(yáng)性檢出率。結(jié)果 排除16份重復(fù)標(biāo)本，9份未進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)的標(biāo)本，納入的123份痰標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性率33.33％，直接涂片法陽(yáng)性率24.39％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012）；培養(yǎng)陽(yáng)性病例的痰標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性率58.82％，直接涂片法陽(yáng)性率44.12％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018）。52份體液標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性率13.46％，直接涂片陽(yáng)性率1.96％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）；培養(yǎng)陽(yáng)性病例的16份體液標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性比例為7/16，直接涂片法陽(yáng)性比例為1/16， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040）。結(jié)論 基于液基薄層方法的抗酸桿菌涂片陽(yáng)性率高于直接涂片法，對(duì)于體液標(biāo)本陽(yáng)性率提高顯著，有利于臨床上快速診斷，但對(duì)于痰標(biāo)本的應(yīng)用須綜合考慮檢驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)和檢驗(yàn)費(fèi)用。

［關(guān)鍵詞］分枝桿菌屬；結(jié)核；診斷；臨床實(shí)驗(yàn)室技術(shù)

抗酸桿菌涂片顯微鏡檢查方法是最早的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手段，目前仍然是結(jié)核病檢驗(yàn)方法學(xué)的基礎(chǔ)，具有快速、價(jià)廉的優(yōu)勢(shì)，對(duì)判斷患者的傳染性具有重要意義，因此對(duì)它的研究和改進(jìn)從未停歇過(guò)，目標(biāo)是提高涂片鏡檢的陽(yáng)性率。

基于液基薄層方法的抗酸桿菌涂片方法（抗酸桿菌液基薄層涂片方法）以較早應(yīng)用于脫落細(xì)胞檢查的液基薄層細(xì)胞學(xué)方法為基礎(chǔ)，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行解粘聯(lián)去雜質(zhì)處理后離心制片。我們用臨床上不同部位來(lái)源的標(biāo)本對(duì)此方法和臨床普遍應(yīng)用的直接涂片方法做了對(duì)照研究。

1　材料與方法

1.1 材料 材料系解放軍第三○九醫(yī)院結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室于2015年7月接收的結(jié)核科住院患者入院1周內(nèi)的臨床檢測(cè)標(biāo)本，患者臨床診斷均為“結(jié)核病”。分枝桿菌MGIT 960培養(yǎng)基和 培養(yǎng)分析儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。液基薄層試劑盒和消化液分別由湖南天騎公司和武漢瑞新昌生物公司提供。

1.2 方法 臨床送檢的“涂片找抗酸桿菌”的標(biāo)本進(jìn)行直接涂片后，剩余標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行液基薄層涂片。直接涂片法按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［1］進(jìn)行標(biāo)本涂片、染色、鏡檢和記錄結(jié)果。液基薄層涂片法分別按照湖南天騎和武漢瑞新昌生物公司提供的方法說(shuō)明書進(jìn)行?；具^(guò)程為：在專有標(biāo)本瓶中進(jìn)行標(biāo)本的消化液處理，配套離心機(jī)內(nèi)制備甩片、烘干、染色及鏡檢。分枝桿菌培養(yǎng)按照操作程序指南《BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System》［2］進(jìn)行標(biāo)本的分枝桿菌培養(yǎng)，并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用CHISS 2004軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2種方法相關(guān)性比較用四格表χ2檢驗(yàn)/校正χ2檢驗(yàn)/確切概率檢驗(yàn)，2組率的比較采用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1 標(biāo)本類型及納入數(shù)量 共檢測(cè)200份標(biāo)本，其中包括148份晨痰標(biāo)本，52份體液標(biāo)本。排除16份重復(fù)標(biāo)本和9份未進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)的標(biāo)本，共納入123份痰標(biāo)本和52份體液標(biāo)本。標(biāo)本類型和數(shù)量見(jiàn)表1。

表1　標(biāo)本類型和數(shù)量Table 1 Types and numbers of clinical samples

2.2 痰標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 用2種方法對(duì)123份結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。一致性分析結(jié)果表明2種方法具有相關(guān)性（P＜0.05）， 液基薄層法陽(yáng)性率（33.33％）明顯高于直接涂片法陽(yáng)性率（24.39％）（P＜0.05）。

表2　2種涂片方法檢測(cè)痰標(biāo)本結(jié)果（例）Table 2 Results of detecting sputum samples by two smear methods （cases）

用2種方法對(duì)68份結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。一致性分析結(jié)果表明2種方法具有相關(guān)性（P＜0.05）， 液基薄層法陽(yáng)性率（58.82％）明顯高于直接涂片法陽(yáng)性率（44.12％）。因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽(yáng)性具有確診價(jià)值，所以液基薄層法靈敏度為58.82％，直接涂片法靈敏度為44.12％， 前者明顯高于后者（P＜0.05）。

表3　2種涂片方法檢測(cè)68例痰培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本結(jié)果（例）Table 3 Results of detecting 68 sputum samples with positive culture by two smear methods （cases）

2.3 體液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 用2種方法對(duì)52份結(jié)核患者體液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。一致性分析結(jié)果表明2種方法無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），液基薄層法陽(yáng)性率（13.46％）明顯高于直接涂片法陽(yáng)性率（1.96％）（P＜0.05）。

表4　2種方法檢測(cè)體液標(biāo)本結(jié)果（例）Table 4 Results of detecting body fluid samples by two smear methods （cases）

用2種方法對(duì)16份結(jié)核分枝桿菌體液培養(yǎng)陽(yáng)性體液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5。一致性分析結(jié)果表明2種方法無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）， 液基法薄層陽(yáng)性比例為（7/16）明顯高于直接涂片法陽(yáng)性比例（1/16）（P＜0.05）。

表5　2種涂片方法檢測(cè)16例體液培養(yǎng)陽(yáng)性體液標(biāo)本結(jié)果（例）Table 5 Results of detecting 16 body fluid samples with positive culture by two smear methods （cases）

3　討　　論

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，是結(jié)核病確診、治療方案選擇和療效考核的主要依據(jù)［3］。2015年我國(guó)結(jié)核病的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均占乙類傳染病的第2位，結(jié)核病的控制依舊任重道遠(yuǎn)［4］。目前，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查方法中的分枝桿菌培養(yǎng)仍是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而涂片鏡檢仍是臨床上最常使用的篩查方法。

目前臨床上廣泛使用的涂片鏡檢法是直接涂片法。涂片鏡檢簡(jiǎn)單、快速且成本低，但靈敏性低。為提高此方法的靈敏性，研究者對(duì)它的各個(gè)細(xì)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化［5］?？顾釛U菌液基薄層涂片方法以液基薄層細(xì)胞學(xué)方法為基礎(chǔ)，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行解粘聯(lián)去雜質(zhì)處理后離心制片。目前國(guó)內(nèi)有2種不同的薄層離心制片機(jī)，我們?cè)谡＿M(jìn)行臨床標(biāo)本檢驗(yàn)的同時(shí)，用這2種薄層離心制片機(jī)進(jìn)行了涂片鏡檢。但其中的甩片機(jī)制備的涂片過(guò)?。≧XC-YJ-4880），經(jīng)過(guò)2次檢測(cè)后，因涂片過(guò)薄，部分呈空白片，我們放棄了對(duì)此制片方法的比較研究。另一種（TD-12）薄層離心制片的涂片方法結(jié)果良好，痰標(biāo)本和體液標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性率雖然與以往研究的報(bào)告有差異，但也均顯著高于直接涂片法［6-7］。

為比較液基薄層涂片方法的靈敏性，我們只選取了臨床上明確診斷為結(jié)核病，治療不足1周的患者標(biāo)本，而且這些患者同時(shí)送檢了分枝桿菌培養(yǎng)，以分析比較此方法對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)的敏感度。對(duì)所有的痰標(biāo)本，液基薄層法陽(yáng)性率明顯高于直接涂片法陽(yáng)性率；培養(yǎng)陽(yáng)性病例的痰標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性率也高于直接涂片法陽(yáng)性率，其結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。52份體液標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性率明顯高于直接涂片陽(yáng)性率；培養(yǎng)陽(yáng)性病例的體液標(biāo)本中，液基薄層法陽(yáng)性比例也明顯高于直接涂片法陽(yáng)性比例，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但液基薄層法對(duì)體液的檢測(cè)陽(yáng)性率提高更為顯著。體液標(biāo)本的常規(guī)涂片方法是先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行離心沉淀處理，之后再采集沉淀物直接涂片。常規(guī)處理時(shí)，離心時(shí)間長(zhǎng)，持續(xù)20～30 min。而且沉淀物主要是大量的纖維蛋白或者黏稠的膿液或者細(xì)胞碎片，在體液標(biāo)本含菌量少的情況下，直接鏡檢的陽(yáng)性率非常低。液基薄層法一方面對(duì)標(biāo)本做前處理時(shí)液化了黏稠物質(zhì)，裂解了上皮細(xì)胞，減少了干擾；另一方面液基薄層法的標(biāo)本盒容量相對(duì)大，標(biāo)本直接離心到鏡檢載玻片上，較大程度濃縮了標(biāo)本中的細(xì)菌，所以液基薄層法能夠顯著提高體液標(biāo)本的涂片陽(yáng)性率。

液基薄層法須要進(jìn)行標(biāo)本前處理、離心等步驟，檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，作為結(jié)核病?？茩z驗(yàn)室，痰標(biāo)本檢測(cè)量大，如果處理時(shí)間長(zhǎng)，可能影響技術(shù)人員的閱片效率，而技術(shù)人員的閱片效率是影響涂片陽(yáng)性率的重要因素，液基薄層法的成本支出也高于直接涂片法。但對(duì)于體液標(biāo)本，抗酸桿菌液基薄層涂片方法的陽(yáng)性率提高顯著，有利于臨床上快速診斷。因此，對(duì)于痰標(biāo)本，是否應(yīng)用液基法涂片，須要綜合考慮檢驗(yàn)室標(biāo)本量、人員配給和其他快速檢驗(yàn)項(xiàng)目等因素。目前，結(jié)核分枝桿菌基因芯片技術(shù)及高通量的基因測(cè)序等技術(shù)已逐步在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，為結(jié)核病的診治帶來(lái)重大的發(fā)展和變化［8］。

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（2016-03-16 收稿 2016-05-11 修回）

（責(zé)任編委 曲 芬 本文編輯 盧福昱）

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］［中國(guó)圖書資料分類號(hào)］ R378.91 A

［文章編號(hào)］1007-8134（2016）00-0153-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.007

*Corresponding author， E-mail： xinjing15@163.com

［基金項(xiàng)目 ］國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81071319）；國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2013ZX10003006-003）

［作者單位］100091 北京，解放軍第三○九醫(yī)院結(jié)核病研究所（賀雄、楊栗坤、曹艷龍、孫雯娜、王心靜、程小星、王仲元）

［通訊作者 ］王心靜，E-mail∶ xinjing15@163.com

Clinical application of acid-fast bacilli smear method based on liquid-based cytology

HE Xiong， YANG Li-kun， CAO Yan-long， SUN Wen-na， WANG Xin-jing*， CHENG Xiao-xing， WANG Zhong-yuan
Institute of Tuberculosis， 309 Hospital of PLA， Beijing 100091， China

［Abstract］Objective To evaluate the diagnostic performance of smear method based on liquid-based cytology in detecting acid-fast bacilli in clinical specimens of different types. Methods A total of 200 samples including 148 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid， which were collected from patients within one week since they were hospitalized， were examined for acid-fast bacilli by direct smear method and liquid-based smear method at the same time. The positive rates of the two methods were compared. Results Sixteen repeated samples and 9 samples without being cultured for acid-fast bacilli were excluded， so 123 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid were included. As for 123 sputum samples， the positive rates were 33.33％ for liquid-based smear method and 24.39％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.012）； the positive rates were 58.82％ for liquid-based smear method and 44.12％ for direct smear method in culture-confirmed sputum samples， and the difference was significant （P=0.018）. As for 52 samples of body fluid， the positive rates were 13.46％ for liquid-based smear method and 1.96％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.041）； 7 samples were positive for liquid-based smear method and 1 for direct smear method in culture-confirmed sputum samples （16 samples）， and the difference was significant （P=0.040）. Conclusions The positive rate of detecting acid-fast bacilli by liquid-based smear method is higher than that by direct smear method， especially for body fluid specimens. The liquid-based smear method is useful for clinical rapid diagnosis. However， for the sputum specimens， the examination time and the cost should be considered.

［Key words］Mycobacterium； tuberculosis； diagnosis； clinical laboratory techniques