姚 斌　劉南波　黃 沙　謝江帆　付小兵

（1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071； 3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心胸外科，廣東 廣州 501515)

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綜述

3D生物打印技術(shù)打印組織和器官的研究進(jìn)展

姚 斌1，2劉南波3黃 沙1謝江帆1付小兵1

（1.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071； 3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心胸外科，廣東 廣州 501515)

3D打印技術(shù)由Charles W. Hull在1986年第1次提出,稱為“立體光固化技術(shù)”，即將紫外光照射后的薄層材料打印形成固體3D結(jié)構(gòu)，這種方法后來(lái)用于將生物材料塑造成具有三維結(jié)構(gòu)的樹脂模型[1]。3D生物打印作為一種組織工程技術(shù)，其發(fā)展需要3D打印技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)的發(fā)展推動(dòng)。無(wú)溶劑系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)促使生物材料可以直接打印形成可用于移植的3D支架[2]。目前，在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，3D生物打印已被用來(lái)制作導(dǎo)管和夾板[3]。

3D生物打印技術(shù)能夠精確控制每一層中生物材料、生化藥劑和活細(xì)胞等功能性成分的定位，一層一層打印形成3D結(jié)構(gòu)。常見的3D生物打印方法有生物模擬、自主的自我組裝和迷你組織模塊的構(gòu)建。目前，研發(fā)新的3D生物打印方法，打印出能夠用于臨床、有生物活性的3D組織結(jié)構(gòu)受到很多研究者關(guān)注，其中一大挑戰(zhàn)是將傳統(tǒng)的打印塑料和金屬的技術(shù)轉(zhuǎn)變成新型的打印敏感、有活性的生物材料的技術(shù)，而最主要的挑戰(zhàn)是極高精度地重現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞的微結(jié)構(gòu)并評(píng)估其生物功能?，F(xiàn)將3D生物打印技術(shù)打印組織結(jié)構(gòu)的主要方法、不同類型的生物打印機(jī)與其對(duì)組織結(jié)構(gòu)打印的影響等3D生物打印技術(shù)在器官組織工程方面的應(yīng)用情況綜述如下。

1　3D生物打印方法

1.1生物模擬3D生物打印技術(shù)方面的問題以生物工程方法來(lái)解決，生物工程方法可用來(lái)精確構(gòu)建組織和器官的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外組分[4]。生物工程手段可再現(xiàn)組織特異的細(xì)胞內(nèi)功能組分，可在結(jié)構(gòu)上模擬血管分支，也可制造類似于機(jī)體相應(yīng)組織生理結(jié)構(gòu)并具有功能的生物材料類型并維持其生理濃度。因此，發(fā)展3D生物打印技術(shù)需要深入了解機(jī)體微環(huán)境，包括功能細(xì)胞和支撐細(xì)胞的分布、可溶和不可溶性因子的濃度、細(xì)胞外基質(zhì)的成分和生物力的本質(zhì)。此外，生物模擬的可行度依賴于工程學(xué)、影像學(xué)、生物材料科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物物理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的發(fā)展和基礎(chǔ)知識(shí)的完善。

1.2自主的自我組裝這種方法是建立在詳盡了解胚胎發(fā)生和組織發(fā)生的發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)上，在生物打印的組織中利用環(huán)境促進(jìn)胚胎發(fā)育。以胚胎器官發(fā)育為參照是組織再生的一種方法。在組織發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)、適宜的細(xì)胞信號(hào)和自主結(jié)構(gòu)，形成最終的微結(jié)構(gòu)并具備相應(yīng)的功能[5]。在這種方法中細(xì)胞是組織形成的驅(qū)動(dòng)者，主導(dǎo)了細(xì)胞組成、定位、功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)[6]。

1.3迷你組織模塊迷你組織模塊的概念與上述兩種3D生物打印方法密切相關(guān)。組織和器官由許多小的功能組成模塊或迷你組織模塊構(gòu)成，它們可以被看作是組織中最小的結(jié)構(gòu)和功能單元（如腎單位），而迷你組織模塊通過(guò)合理的設(shè)計(jì)或者自我組裝可以構(gòu)成完整的組織。這種方法有兩種主要構(gòu)成策略：第一，自我組裝的細(xì)胞球體（類似于迷你組織模塊）通過(guò)生物啟發(fā)設(shè)計(jì)和組成裝配形成完整的組織[7]；第二，高精度的組織單元克隆自我組裝，形成功能性的完整組織，例如血管組成模塊自我組裝成分支血管網(wǎng)絡(luò)[8]。3D生物打印高精度的迷你組織模塊可在微流體網(wǎng)絡(luò)下用于篩選藥物和疫苗，或作為體外疾病模型[9]。

綜合以上3種策略才有可能打印出功能、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與機(jī)體組織器官相符合的3D生物結(jié)構(gòu)。3D生物打印的主要步驟包括成像和模型設(shè)計(jì)，材料和細(xì)胞選擇，組織結(jié)構(gòu)打?。▓D1，見封三）。損傷組織成像可用來(lái)引導(dǎo)生物打印組織的設(shè)計(jì)。生物模擬、組織的自我組裝[10]和迷你組織模塊[11]3種設(shè)計(jì)方法可單獨(dú)或組合應(yīng)用。材料的選擇和細(xì)胞來(lái)源對(duì)于組織構(gòu)建和組織功能具有重要的意義并且具有特異性。普通材料包括合成或天然聚合物、去細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)[12]。細(xì)胞可來(lái)源于自體或異體[13]。這些組分必須與打印系統(tǒng)（如噴墨式打印機(jī)、微擠壓式打印機(jī)或激光輔助打印機(jī)）[14]相結(jié)合。某些組織在移植前可能需要在生物反應(yīng)器中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的成熟化。3D生物打印的結(jié)構(gòu)或者用于移植，或者經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的體外成熟化再移植，或者保存用于體外分析、進(jìn)行體外研究。

2　成像和模型設(shè)計(jì)

全面了解組織器官的結(jié)構(gòu)是克隆異質(zhì)的功能性組織器官的基礎(chǔ)。醫(yī)學(xué)成像技術(shù)是組織工程提供細(xì)胞、組織、器官乃至有機(jī)體的3D結(jié)構(gòu)信息的一項(xiàng)必不可少的工具。這些技術(shù)包括最普通的無(wú)不良反應(yīng)的成像模式——X射線斷層掃描技術(shù) (CT)和磁共振技術(shù)(MRI)。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)輔助制造工具(CAD-CAM)與數(shù)學(xué)模型被用來(lái)進(jìn)行組織的層析成像信息和結(jié)構(gòu)信息的采集和數(shù)字化。

將完整的組織或器官模型與數(shù)字化操控的生物打印系統(tǒng)相結(jié)合，進(jìn)行原型設(shè)計(jì)和實(shí)體打印，這一過(guò)程又叫做3D生物打印。這個(gè)過(guò)程經(jīng)過(guò)了2D到3D重建的轉(zhuǎn)換，如將3D模型分割成很多薄的2D水平切片（具有固定的大小和方向），經(jīng)打印系統(tǒng)輸出完成。2D水平切片包含的解剖學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)的信息指導(dǎo)生物打印裝置一層一層堆積，最終打印成組織。3D生物打印技術(shù)的變化會(huì)影響組織器官設(shè)計(jì)，有的生物打印系統(tǒng)通過(guò)打印連續(xù)的材料微球累積來(lái)組成3D結(jié)構(gòu)。有的打印系統(tǒng)通過(guò)短的不規(guī)則的或明確間斷的材料累積來(lái)組成3D結(jié)構(gòu)。組織器官模型的設(shè)計(jì)必須考慮生物3D打印機(jī)的性質(zhì)和功能。

3　組織打印手段

用于生物材料累積和成型的主要技術(shù)有噴墨式打印[15]、微擠壓式打印[16]和激光輔助打印[17]（圖2）。下面從3D生物打印技術(shù)最重要的因素——界面分辨率、細(xì)胞活性和用于打印的生物材料——論述它們的區(qū)別（表1）。溫控的噴墨式打印機(jī)加熱噴頭可使管口產(chǎn)生脈沖氣壓打出液滴；聲學(xué)打印機(jī)通過(guò)壓電式或者超聲產(chǎn)生脈沖壓；微擠壓式打印機(jī)使用氣動(dòng)或者機(jī)械（活塞或螺旋）驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)擠出連續(xù)的含有材料和細(xì)胞的小球；激光輔助打印機(jī)利用激光聚焦于一種吸收性底物，為生物材料打印提供驅(qū)動(dòng)力[18],吸收性底物通過(guò)吸收激光將材料擠壓出去。

圖2　噴墨式打印機(jī)（A）、微擠壓式打印機(jī)（B）和激光輔助打印機(jī)（C）的組成和結(jié)構(gòu)

表1　不同種類生物打印機(jī)性能的比較

4　材料和支架

3D打印技術(shù)最初用于非生物領(lǐng)域，如金屬沉積、制陶術(shù)、熱塑性塑料聚合物生產(chǎn)等，且涉及到有機(jī)溶劑、高溫和交聯(lián)試劑等與生物材料和活細(xì)胞不兼容的技術(shù)。因此，尋找既能與生物材料兼容又能提供組織支架所需的適宜的機(jī)械特性和功能特性的材料是3D生物打印的一大挑戰(zhàn)。目前使用的幾種3D生物打印機(jī)的性能比較見表1。

5　細(xì)胞來(lái)源

組織器官的細(xì)胞選擇對(duì)3D生物打印產(chǎn)物擁有應(yīng)有的功能至關(guān)重要。組織和器官包括多種具有特異功能和基本功能的細(xì)胞類型，打印的組織必須包含這些細(xì)胞。除了基本的功能細(xì)胞，大多數(shù)組織還包含起支撐作用和結(jié)構(gòu)功能的細(xì)胞，如參與血管化、為干細(xì)胞保持干性和細(xì)胞分化提供微環(huán)境的細(xì)胞。目前細(xì)胞打印包括功能性細(xì)胞打印或者干細(xì)胞打印，并且干細(xì)胞可以增殖分化形成需要的細(xì)胞種類。用于打印的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)該與體內(nèi)生理狀態(tài)的細(xì)胞盡可能相近，且可通過(guò)優(yōu)化打印條件來(lái)維持它們?cè)隗w內(nèi)的功能[25]。

6　展望與挑戰(zhàn)

3D打印組織不僅可用于器官移植，還可用于藥物傳送，化學(xué)試劑、生物學(xué)制劑和毒性物質(zhì)的分析、基礎(chǔ)研究等。3D打印組織技術(shù)非常復(fù)雜，從2D組織如皮膚開始，通過(guò)形成中空的管道（如血管）和中空的非管狀物的器官（如膀胱），最終形成實(shí)體器官如腎，這些是目前的3D技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能做到的。諸多挑戰(zhàn)橫亙?cè)谖覀兠媲?，包括?xì)胞和材料的選擇，組織的成熟化和功能化，適宜的血管化和神經(jīng)化。要實(shí)現(xiàn)3D生物打印應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，還需要匯集多學(xué)科的知識(shí)來(lái)解決這些問題。

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（修改日期：2016-1-31）

DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 018

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2012CB518105）；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金（81121004）

通訊作者：付小兵,研究員，中國(guó)工程院院士（E-mail: fuxiaobing@ vip.sina.com）