程　慶,　　李紫蘭,　　肖玲瓏,　　李春霖,楊慧婷，　　彭飛鳳，　　王岐本

(湘南學(xué)院 1.南嶺藥用資源研究所;　2.臨床學(xué)院,湖南 郴州　423000)

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湖南汝城縣熱水溫泉產(chǎn)酶菌的篩選

程慶1,李紫蘭2,肖玲瓏2,李春霖2,楊慧婷2，彭飛鳳2，王岐本1

(湘南學(xué)院 1.南嶺藥用資源研究所;2.臨床學(xué)院,湖南 郴州423000)

摘要：通過對湖南汝城縣熱水溫泉產(chǎn)酶菌株的分離篩選，利用尿素酶試驗和蛋白酶篩選培養(yǎng)基，堿性磷酸酶、氧化酶和過氧化氫酶檢測方法對此前已鑒定的13株菌株進行產(chǎn)酶篩選，結(jié)果顯示其中10株菌過氧化氫酶試驗呈陽性、1株菌尿素酶試驗呈陽性、9株菌氧化酶試驗呈陽性、3株菌過氧化氫酶試驗呈陽性和8株菌蛋白酶試驗呈陽性.為嗜熱微生物源工業(yè)酶研發(fā)提供基礎(chǔ)，也可表明所篩選出的菌株在工業(yè)酶的領(lǐng)域具有廣闊的前景.

關(guān)鍵詞：溫泉；產(chǎn)酶；嗜熱微生物

嗜熱微生物，通常是指在高溫環(huán)境中生長的微生物，其最適生長溫度在45℃或以上[1]，早在1969年Brock就于美國黃石國家公園的溫泉中分離純化得到水生棲熱菌(Thermusaquaticus)，并測出其最適生長溫度高達70℃[2].而嗜熱酶則是由嗜熱微生物所產(chǎn)生的一種具有酶活性的化合物，因其是由嗜熱菌產(chǎn)生，故其具有一定的熱穩(wěn)定性，所以它在眾多產(chǎn)業(yè)均有應(yīng)用.如在某些蛋白酶在洗滌、皮革、醫(yī)藥、食品、飼料、化工和廢處理上都有極強大工業(yè)應(yīng)用潛力[3]；過氧化氫酶近年來也廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷以及紡織、造紙等工業(yè)領(lǐng)域[4]，而堿性磷酸酶則被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)臨床檢驗、食品檢驗、化妝品制造、環(huán)境毒物檢測及有機磷農(nóng)藥降解中[5]等.

郴州是華南地熱資源最豐富的地區(qū)之一，所屬的南嶺山地是我國重要生物區(qū)系的分界線.郴州汝城溫泉是我國南方水溫最高，流量最大，水質(zhì)最好，熱田面積最寬的天然溫泉.因此，本次研究在前期湖南汝城熱水溫泉微生物資源多樣性的研究基礎(chǔ)上[6]，從湖南汝城的溫泉水樣品中分離純化嗜熱微生物，在16S rDNA基因測序的13株菌株基礎(chǔ)上，對產(chǎn)蛋白酶、尿素酶、堿性磷酸酶、氧化酶、過氧化氫酶菌株的篩選進行了初步研究，為嗜熱微生物源工業(yè)酶的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù).

1材料與方法

1.1樣品采集

實驗樣品采自湖南省汝城縣熱水鎮(zhèn)，北緯25°31′47.29″，東經(jīng)113°54′48.19″.A：68 ℃，藻類，B：94 ℃，泥水混合物，C：86 ℃，泥水混合物，D：90 ℃，泥水混合物.

1.2菌種來源

本次研究所用的菌種為利用DSM88培養(yǎng)基于60 ℃恒溫培養(yǎng)，分離純化所得到的菌株R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14[6].

1.3主要儀器和試劑

立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；上皿電子天平(上海精科天平)；超凈工作臺(濟南潔康空氣凈化設(shè)備廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子萬用爐(浙江省上虞市道墟寶民儀器設(shè)備廠)；eppendorf移液槍(德國).酪蛋白(AR)，葡萄糖(AR)，酵母膏(AR)，K2HPO4·3H2O(AR)，MgSO4·7H2O(AR)，Vogel’s微量元素液(AR)，二甲基對苯二胺(AR)，對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)(AR)，0.2M Tris-HCl(AR)，蛋白胨(AR)，NaCl(AR)，酚紅(AR)，KH2PO4(AR)，瓊脂(AR).

1.4培養(yǎng)基

1.4.1DSM88培養(yǎng)基

配制100×10 ml/L，(NH4)2SO4(1.3 g/L)、KH2PO4(0.28 g/L)、CaCl2·2H2O(0.07 g/L)、MgSO4·7H2O(0.25 g/L)、FeCl3·6H2O(20 mg/L)，(1 000×)稀有元素(1 ml/L)，MnSO4·H2O(2.2 mg/L)、Na2B4O7·10H2O(4.5 mg/L)、ZnSO4·7H2O(0.5 mg/L)，1 000×1 000倍(1 ml/L),CuSO4(0.016 mg/L)、NaMoO4·2H2O(0.025 mg/L)、CoCl2·6H2O(0.046 mg/L)，Yeast extract(1.0 g/L)、Tryptone(1.0 g/L).調(diào)PH值至7.6(1 mol/LNaOH，4.0 g溶于100 ml蒸餾水內(nèi)；1 mol/LHCl，3.65 g溶于100 ml蒸餾水內(nèi))滅菌，121 ℃ 20 min，25 g瓊脂.

1.4.2尿素酶試驗培養(yǎng)基

蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，NaCl 5 g，酚紅0.012 g，KH2PO42 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL.

1.4.3蛋白酶篩選培養(yǎng)基

酪蛋白40 g，葡萄糖40 g，酵母膏4.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Vogel’s微量元素也0.1 ml，加蒸餾水至1 000 ml，最后調(diào)節(jié)PH至7.6.

1.5方法

1.5.1菌株的活化

將此前已保好種的菌種接種于DSM88培養(yǎng)基，置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行復(fù)壯，直至出現(xiàn)單個菌落.

1.5.2堿性磷酸酶試驗

將菌置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，把浸有底物溶液的濾紙片貼在菌落上，再重新放入培養(yǎng)箱，3 min后取出觀察，若濾紙片變黃，則說明該株菌落堿性磷酸酶試驗呈陽性.底物溶液2.0 mg/mL對硝基苯磷酸二鈉(PNPP)溶于pH=8.9的0.2 M Tris-HCl緩沖液.

1.5.3氧化酶試驗

在潔凈玻片上滴二甲基對苯二胺的1%溶液，用接種環(huán)挑取已活化的菌苔，若在10 s內(nèi)涂抹的菌苔呈紅色則試驗為陽性.

1.5.4過氧化氫酶試驗

用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上挑取菌落，置于潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫溶液2 mL，觀察結(jié)果，于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性.

1.5.5蛋白酶篩選試驗[7]

在種子培養(yǎng)基中加入1.2%的明膠.用穿刺法將試驗菌接種在培養(yǎng)基中，60 ℃中培養(yǎng)4 d.將試管從培養(yǎng)箱中取出,置于4 ℃冰箱中.

1.5.6尿素酶試驗

挑取18～24 h待試菌培養(yǎng)物涂布并穿刺接種于DSM88固體斜面培養(yǎng)基，不要到達底部，留底部作變色對照.培養(yǎng)2，4和24 h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4 d，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性.

2結(jié)果

2.1菌株形態(tài)及革蘭染色觀察

根據(jù)BaSO快速革蘭氏染色說明書(制片、初染、媒染、脫色、復(fù)染、鏡檢)對分離培養(yǎng)出3 d的菌革蘭氏染色.結(jié)果顯示5株菌革蘭染色呈陽性，除R1為短桿狀和R3為球狀之外，其余均為長桿狀，如表1和圖1.

表1　13株菌株的菌落形態(tài)及革蘭染色

圖1　幾種菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

2.213株菌產(chǎn)酶試驗結(jié)果

產(chǎn)酶試驗結(jié)果顯示10株菌過氧化氫酶實驗呈陽性，1株菌尿素酶試驗呈陽性,9株菌氧化酶試驗呈陽性，3株菌過氧化氫酶試驗呈陽性，8株菌蛋白酶試驗呈陽性(表2).

表2　13株菌產(chǎn)酶試驗結(jié)果

3討論

嗜熱酶具有化學(xué)催化劑無法比擬的優(yōu)點，尤其是在高溫條件下能保持極好的穩(wěn)定性，克服了常溫酶在應(yīng)用過程中出現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定現(xiàn)象[8].且因其在高溫條件下特殊的耐受及催化功能，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面有著廣闊的應(yīng)用前景.因此，它可極大地促進嗜熱微生物源工業(yè)的發(fā)展以及各類生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

本次研究主要針對蛋白酶、尿素酶、堿性磷酸酶、氧化酶、過氧化氫酶這5種酶進行了檢測.經(jīng)試驗，R5、R6和R7堿性磷酸酶試驗均為陽性,且前期鑒定該三種菌種均屬于亞棲熱菌屬(Meiothermus)，龔寧萍[7]對云南棲熱菌產(chǎn)耐熱性磷酸酶及菌種鑒定的研究中已經(jīng)篩選出31株堿性磷酸酶陽性菌，且這31株菌均屬于棲熱菌屬，而2002年Mr Chen[9]從臺灣分離得到臺灣亞棲熱菌新種(Me.taiwanensis),可見亞棲熱菌屬也分布郴州地區(qū)；R3、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12蛋白酶試驗為陽性,任佩[10]等從章魚腸道內(nèi)分離出6種產(chǎn)蛋白酶菌株,其最適生長溫度為55-60 ℃，這是多種蛋白酶共同作用的所產(chǎn)生的結(jié)果,而本研究所產(chǎn)生的蛋白酶則是在60 ℃條件下產(chǎn)生,極有可能為這8株菌株在最適溫度時所產(chǎn)生的某一種或多種蛋白酶,由于不同種屬的細菌所產(chǎn)蛋白酶種類和其最適溫度都不同,故在60 ℃時可能還有一部分蛋白酶并未表現(xiàn)出其最大的活性,因此這8株菌株還有產(chǎn)其他多種蛋白酶的潛在可能性，為湖南汝城地區(qū)的嗜熱蛋白酶的進一步研究奠定了一定的基礎(chǔ).

R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R12和R13氧化酶試驗為陽性,目前氧化酶在酶應(yīng)用技術(shù)方面是一種重要的酶,如葡萄糖氧化酶,它可制成試劑盒用于實驗室葡萄糖的定量測定[11]，還可以用于防止食品褐變等方面,在食品快速檢測及生物傳感器上也有廣泛應(yīng)用[12].由于國內(nèi)葡萄糖氧化酶的研究水平還不高,故本研究可極大的豐富氧化酶的開發(fā)和利用資源；R1、R2、R5、R6、R7、R9、R10、R11、R12和R13過氧化氫酶試驗陽性,其余為陰性,即在本實驗中4種亞棲熱菌R2、R5、R6和R7屬能產(chǎn)過氧化氫酶,在目前產(chǎn)過氧化氫酶菌株的大量研究中,有關(guān)亞棲熱菌屬產(chǎn)過氧化氫酶的研究尚少,表明這兩種菌株的成功分離提供了新的過氧化氫微生物資源,利于該地區(qū)過氧化氫酶資源的開發(fā)和利用;R8尿素酶為陽性,結(jié)果表明在試驗的13株菌株里面只有土芽孢桿菌屬的R8可產(chǎn)尿素酶,此前,邱波[13]等人對7株副溶血性弧菌在不同溫度的條件下進行了尿素酶反應(yīng)檢測比較,結(jié)果顯示不同溫度和不同方法檢測的結(jié)果存在一定的差別,陽性菌株的血清型和型別構(gòu)成存在差別,在本研究中,R8能產(chǎn)尿素酶,說明其血清型和型別構(gòu)成也和其他同屬陰性菌株存在一定的差別,為后續(xù)的土芽孢桿菌屬細菌的進一步研究提供了一個基礎(chǔ).

本研究所進行的過氧化氫酶、尿素酶、氧化酶、堿性磷酸酶和蛋白酶試驗在工業(yè)酶的領(lǐng)域具有廣闊的前景.在本研究的基礎(chǔ)上，能進一步深入多糖與酶的研究，并測定堿性磷酸酶和蛋白酶的溫度及PH生長曲線，為其在工業(yè)生產(chǎn)方面發(fā)揮更大的作用奠定了基礎(chǔ).

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Screening Rucheng County,Hunan Hot Spring Enzyme Producing Bacteria

CHENG Qing1,LI Zi-lan2,XIAO Ling-long2,LI Chun-lin2

YANG Hui-ting2,PENG Fei-feng2,WANG Qi-ben2

(1.SouthRidgeDrugResourcesResearchOffice；2.ClinicalMedicineSchool,XiangnanUniversity,Chenzhou,Hunan423000)

Abstract：By separating and selecting the Hunan Rucheng County hot spring enzyme producing strains.Previously identified 13 strains were enzyme screened by using urease test and protease screening medium,alkaline phosphatase,oxidase and catalase detection method.The result showed among 13 isolates strains there were 10 strains was positive in catalase test,1 strain was positive in urease test,9 strains was positive in oxidase test,3 strains was positive in catalase test and 8 strains was positive in protein enzyme test.These results providing the basis for research the thermophilic microbial source industrial enzyme,It may also indicating that selected strains have broading prospects in the field of industrial enzyme.

Key words：hot spring；producing enzyme；thermophilic microorganism

收稿日期：2016-04-12

基金項目:湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃(湘教通[2015]269號);國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510545004);湖南省教育廳重點科研項目(12A127);中南林業(yè)科技大學(xué)對口支援湘南學(xué)院項目(2012XN03).

作者簡介：程慶，1983年生，女，湖南湘陰人，碩士研究生，研究方向：微生物；

*通訊作者:王岐本，1967年生，男，湖南邵陽人，教授，研究方向：微生物.

中圖分類號：Q93

文獻標識碼：A

文章編號：1671-9743(2016)05-0052-04