葉文斌

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣　742500)

?

無花果多糖提取工藝及其功能研究

葉文斌

(隴南師范高等專科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣742500)

摘要：【目的】 優(yōu)化無花果多糖提取工藝，研究其生物功能.【方法】 采用響應(yīng)面與酶法聯(lián)用優(yōu)化無花果(Ficuscarica)多糖的提取工藝，測定無花果多糖對糖尿病誘導(dǎo)大鼠血脂代謝指標(biāo)的影響.【結(jié)果】 無花果多糖提取最佳優(yōu)化條件為酶解溫度50.36 ℃，酶用量0.06 g和pH 4.73.該條件下無花果多糖提取預(yù)測值為34.47%，驗證值為34.13%.用無花果多糖連續(xù)給大鼠灌胃給藥28 d，發(fā)現(xiàn)無花果多糖能顯著降低正常大鼠血糖(P<0.05)，極顯著降低腎上腺素引起的高血糖(P<0.01)，有效降低糖尿病大鼠的 FBG、HbAlc、TC、TG，升高 HDL含量.【結(jié)論】 獲得了無花果多糖提取最佳工藝參數(shù)，無花果多糖能夠顯著降低糖尿病大鼠血糖，并顯著改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂.

關(guān)鍵詞：效應(yīng)面法；酶法；無花果多糖；優(yōu)化工藝；四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大常見病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告，全世界目前約有1.5億DM患者，預(yù)測2025年將上升到3億[1]，近年糖尿病及其病發(fā)癥的發(fā)生率越來越高.糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與整體血糖水平的升高有密切的關(guān)系[2]，同時糖尿病長時間的高糖環(huán)境會導(dǎo)致糖脂代謝的紊亂，從而引起臟器病變及并發(fā)癥[3-6].血液中糖化血紅蛋白(HbAlc)與血糖濃度成正比，所以檢測血中 HbAlc水平可以直觀地反映出血糖水平，更好地監(jiān)測機體糖代謝的情況[4].國外有學(xué)者研究證實了HbA1c是診斷血糖水平的重要指標(biāo)[5]，而且HbA1c與空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)低密度脂蛋白(LDL)呈正相關(guān).在控制血糖水平的同時，有效調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂對治療糖尿病及其并發(fā)癥有重要意義.植物多糖在自然界中廣泛存在，具有降血糖、提高免疫力、防止心肌缺血等復(fù)雜的生物活性與功能[6-13]，它能促進(jìn)胰島素分泌，提高血漿胰島素水平[14]，抑制糖異生途徑和調(diào)控糖原的合成、分解及促進(jìn)血糖利用[15].目前，市場上治療糖尿病的藥物主要是化學(xué)合成藥，雖然短期療效顯著，但常伴有不同程度的副作用，如心血管疾病、過敏反應(yīng)等[2].

無花果(Ficuscarica)為?？茻o花果屬植物的果實，在甘肅省隴南市白龍江兩岸栽培面積約有333.3 hm2，是甘肅省主要的無花果栽培基地.無花果營養(yǎng)豐富，無花果多糖系其主要有效成分，但是由于其水溶性和分子量大，給提取純化帶來了困難.近年來有關(guān)無花果多糖提取工藝研究的報道較多，但僅限于壓榨、水溶和溶劑萃取等傳統(tǒng)提取方法的研究，而且傳統(tǒng)提取工藝復(fù)雜、提取率低、耗時也較長[16-19].同其他植物多糖一樣具有復(fù)雜的生物活性與功能，有關(guān)無花果多糖在降血壓、防治神經(jīng)痛、抗凝血、抗血栓、抗氧化、增強免疫力方面的研究逐漸增多[5-7]，而關(guān)于無花果多糖在降血糖、血脂方面的研究較少.鑒于此，試驗根據(jù)無花果多糖特點，用酶法和響應(yīng)面法聯(lián)用，進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究，并采用ALX誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型來觀察無花果多糖對糖尿病大鼠降血糖和降血脂的作用效果，以期開發(fā)無毒無副作用的降糖替代藥物，對無花果多糖綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)無花果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展.

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗材料與動物無花果采自甘肅省隴南市武都區(qū)白龍江沿岸，品種為‘紫果’，挑選大小均勻成熟度相同，無機械損傷，顏色鮮艷，無病蟲害的果實；SD大鼠，雄性，合格證號SCXK(甘)2009-0004，體質(zhì)量185～220 g，試驗動物和飼料均購自蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心.

1.1.2試驗藥品四氧嘧啶，Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片，上海醫(yī)藥(集團)有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)；格列苯脲片，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)；血糖試紙，愛奧樂醫(yī)療器械(深圳)有限公司；普魯卡因腎上腺素注射液，遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國)有限公司生產(chǎn)；苯酚、濃硫酸、葡萄糖 (純度>99.99%，sigam公司)，復(fù)合酶(纖維素酶≥40萬μ/mL，木聚糖酶≥260萬μ/ mL，果膠酶≥ 2萬μ/ mL， 三者比為3∶1∶2) 和氏璧生物科技有限公司；其他試劑均為分析純.

1.1.3試驗儀器RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海千載科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV759紫外-可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5000B型低速冷凍大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-18型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；全自動生化分析儀AU5800，貝克曼庫爾特有限公司；全自動血糖檢測儀，愛奧樂醫(yī)療器械(深圳)有限公司；LC-6A高壓液相色譜儀(配有 RI-10A示差折光檢測器、7725i手動進(jìn)樣器、 CTO-10AS柱溫箱、CBM-20A在線控制器和LC-solution分析軟件)日本島津公司；TSK-Gel SW3000和TSK-Gel SW4000色譜柱日本 Tosoh公司等.

1.2試驗方法

1.2.1無花果多糖的提取流程將無花果果實在50 ℃烘干后將其粉碎，過40目篩，用無水乙醇回流脫脂，50 ℃時干燥，然后加入一定量的水，在一定溫度下添加相應(yīng)的復(fù)合酶進(jìn)行一定時間的酶解，通過復(fù)合酶的酶解徹底降解無花果中的纖維素和果膠，使無花果多糖充分溶解便于提取，提取液經(jīng)過減壓濃縮得濃縮液，取上清液與 Sevag試劑(氯仿∶正丁醇體積比4∶1)按體積比5∶1混合、振蕩、離心棄去變性蛋白，重復(fù)4次.合并水層，用 95%的乙醇沉淀(體積比3∶1)，5 000 r/min離心10 min，沉淀物溶于熱水中，攪拌狀態(tài)下慢慢加入斐林試劑，析出銅絡(luò)合物，靜置1 h，傾出上清液，用水洗滌3次，離心分離得絡(luò)合物，向絡(luò)合物中加4 ℃蒸餾水，再滴加0.5 mol/L的HCl使之全部溶解，用95% 的乙醇沉淀(體積比3∶1)、離心、所得絮狀物分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥得潔白無花果多糖粉[16-19].

1.2.2無花果多糖含量的測定方法本試驗采用苯酚-硫酸法[16-17]測定總的無花果多糖含量.先把葡萄糖用苯酚、硫酸試劑處理后，進(jìn)行紫外掃描，在489 nm 處有最大吸收；再利用標(biāo)準(zhǔn)糖濃度和其用苯酚、硫酸試劑處理后在489 nm 處的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定待測樣品溶液的吸光度，然后根據(jù)回歸方程計算相應(yīng)的濃度從而求出多糖含量.

無花果多糖的提取率(%) =

1.2.3無花果多糖的單因素試驗分別稱取1.0 g無花果粉末多份，分別置于250 mL錐形瓶中，用100 mL 蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)pH 至4.8，備用.用時添加不同酶劑量攪拌均勻后用保鮮膜封口，置于50 ℃ 恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min，酶解24 h，以蒸餾水為空白對照，重復(fù)5次.測定酶用量對提取無花果多糖的影響：分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12 g 工業(yè)用復(fù)合酶；測定溫度對提取無花果多糖的影響：取備用無花果粉末勻質(zhì)液體加入工業(yè)用復(fù)合酶0.06 g，溫度設(shè)置為35、40、45、50 、55、60、66 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)酶解；測定pH 對提取無花果多糖的影響：在備用無花果粉末勻質(zhì)液體中分別加入工業(yè)用復(fù)合酶0.06 g，以1 mol/L CH3COOH 溶液和1 mol /LNaOH 溶液調(diào)節(jié)成pH 值分別為4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2 、5.5、6.0的系列梯度進(jìn)行試驗.各單因素試驗后測定無花果多糖來確定適合的單因素條件.

1.2.4糖尿病動物模型建立將SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在禁食不禁水12 h 后，稱質(zhì)量，測量FBG.隨機取10只大鼠作為正常對照組，將其余60 只大鼠腹腔一次性注射240 mg/kg新鮮配制的3% ALX 溶液.72 h 后眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測定FBG，將FBG≥11.5 mmol/L 者視為造模成功.糖尿病模型組，等量生理鹽水每天灌胃一次，二甲雙胍藥物對照組，按250 mg/kg bw，劑量每天灌胃一次，紋黨多糖低、中、高劑量組(100、250、500 mg/kg bw)，每天灌胃一次.試驗期間，大鼠自由飲食和飲水，連續(xù)觀察28 d，每隔7 d，測定FBG 和稱量體質(zhì)量，測定FBG前禁食不禁水12 h.

1.2.5對正常大鼠血糖水平的影響取SD大鼠 50只，隨機分為 5組.空白組(等容量生理鹽水)、格列本脲對照組(2.5 mg/kg bw)、紋黨多糖低、中、高劑量組(100、250、500 mg/kg bw)，各組灌胃給藥、2次/d、連續(xù) 7 d、末次給藥前禁食 12 h，給藥后 1 h眼眶靜脈叢采血，用血糖儀測定FBG的血糖值.

1.2.6對腎上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影響取SD大鼠 60只，隨機分成 6組，分組及給藥方法同1.2.5，設(shè)腎上腺素為對照組.末次給藥前禁食 12 h，給藥后 30 min各組腹腔注射腎上腺素 0.2 mg/kg bw，30 min后眼眶采血測定FBG.

1.2.7大鼠急性毒性試驗(LD50)測定小鼠急性毒性試驗，半數(shù)致死量(LD50)以紋黨多糖一次性灌胃給藥，約等于 50 mg /10 g bw，相當(dāng)于5 000 mg/kg bw，觀察28 d，看有無異常反應(yīng)，小鼠是否活動自如.

1.3檢測指標(biāo)

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，采用血糖儀和血糖試紙，剪尾取血測各組大鼠FBG；測定FBG后，迅速處死動物并采血，離心收集血清，采用全自動生化分析儀測TC、TG、HDL、LDL水平.

1.4統(tǒng)計分析

2結(jié)果與分析

2.1無花果多糖的純度檢測

無花果多糖溶液的紫外光譜在 260 nm和280 nm波長處未見蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收.無花果種子多糖的HPLC-GPC色譜圖見圖1，只出現(xiàn)一個峰，保留時間為11.897 min，所檢測到的峰沒有裂峰的出現(xiàn)，說明分離和純化的無花果種子多糖是由一種多糖組成的，面積歸一化計算純度為 99.95%.

圖1　無花果多糖的HPLC-GPC 色譜圖Fig.1　HPLC profile of polysaccharides extractedfrom Ficus carica L.

2.2多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立

以標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：y=5.108 6x+0.006 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，線性良好.

2.3影響無花果多糖的單因素試驗

不同的酶解溫度對無花果多糖溶出率的影響見圖2.45～55 ℃無花果多糖的提取率之間差異較為明顯，在50 ℃時無花果多糖的提取率最高.因此，溫度選擇45 ℃以上，考慮到酶解溫度以及能量節(jié)約宜選擇提取溫度為50 ℃.從圖3中可以得出，無花果多糖含量隨著溶液pH值的增加呈先增加后減少的趨勢.當(dāng)溶液的pH值達(dá)到4.8時，含量達(dá)到最大值.當(dāng)溶液的pH 值超過5.0時，多糖的溶出率反而減少，說明這時溶液的pH值超過酶的最適pH，活性開始降低，所以最佳pH值為4.8.不同酶用量對無花果多糖溶出率的影響見圖4，無花果多糖溶出率隨著復(fù)合酶的增加而增加，無花果多糖在酶用量為0.06 g處增加明顯，無花果多糖溶出率有最大值，此后維持穩(wěn)定.說明此時酶量足夠，已經(jīng)與底物充分作用，因此復(fù)合酶的最佳酶用量為0.06 g.

圖2　酶解溫度對無花果多糖含量的影響Fig.2　Effect of enzymolysis temperature on extractionyield of Ficus carica L.polysaccharides

圖3　酶解pH值對對無花果多糖含量的影響Fig.3　Effect of enzymolysis pH on extraction yieldof Ficus carica L.polysaccharides.

圖4　酶解濃度對無花果多糖含量的影響Fig.4　 Effect of enzymolysis concentration on extractionyield of Ficus carica L.polysaccharides

2.4無花果多糖提取工藝條件響應(yīng)面分析試驗

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，利用 Design Expert 8.0.6.1 軟件設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面法試驗，以酶解溫度、酶用量和pH為主要考查因素，分別用A、B和C 來表示，并以1、0、-1 表示自變量的高低水平，以無花果多糖含量為響應(yīng)值，表現(xiàn)出20個試驗點.因素水平見表1，試驗設(shè)計、二次回歸擬合及方差分析和結(jié)果見表2，從回歸分析中可以得出兩者的一次項、二次項均有顯著影響.各試驗因子對響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系.各試驗因子對無花果多糖(Y)的響應(yīng)值的影響分別為:Y=-2591.85+21.84A-1184.86B+869.78C+2.958AB-0.52AC+237.50BC-0.19A2-129.80B2-89.05C2.方差分析結(jié)果由表3可知，模型P<0.01說明酶解溫度、酶用量和pH及其二次項對無花果多糖的影響極顯著，而交互項無顯著影響.無花果多糖模型決定系數(shù)為R2= 0.999 4，經(jīng)擬合檢驗，無花果多糖：P<0.000 1，差異極顯著[20]，由此說明方程能很好地反映無花果多糖含量與酶解溫度、酶用量和pH之間的關(guān)系，而且對無花果多糖提取率影響的大小順序為A：酶解溫度>B：酶用量>C：pH.因此，可以應(yīng)用于無花果多糖含量提取的理論預(yù)測.依據(jù)回歸方程，3個因素的響應(yīng)面圖如圖5-7， 相應(yīng)的響應(yīng)面均為凹型曲面，說明無花果多糖的含量響應(yīng)值存在著極高值，且響應(yīng)曲面的等高線中心均位于-1～1，說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi).通過分析兩者的響應(yīng)面分析結(jié)果可以確定，無花果多糖的提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度為50.36 ℃，酶用量為0.06 g和pH為4.73，在此條件下，無花果多糖的最高含量為34.47%.無花果多糖提取工藝優(yōu)化條件的重復(fù)試驗驗證結(jié)果由表4可知，無花果多糖的平均提取率為34.13%，預(yù)測值比較兩者無顯著差異(P>0.05)，所以經(jīng)過驗證此優(yōu)化條件是最佳組合工藝.

2.5無花果多糖對正常大鼠血糖水平的影響

格列本脲是降低血糖的特效藥物之一，由于其能刺激胰腺分泌胰島素而降低血糖，還通過增加門靜脈胰島素水平或?qū)Ω闻K直接作用，抑制肝糖原分解和糖原異生作用，也可增加胰外組織對胰島素的敏感性和糖的利用，而緩解人體高糖環(huán)境，所以醫(yī)療使用范圍較廣.對正常大鼠血糖水平的影響研究結(jié)果表明，無花果多糖低、中、高劑量組均能降低正常大鼠血糖，與空白組比較差異極顯著性(P<0.01)，其降糖效果與格列本脲組相當(dāng)(表5).格列本脲能刺激胰腺胰島B細(xì)胞分泌胰島素，還通過增加門靜脈胰島素水平或?qū)Ω闻K直接作用，抑制肝糖原分解和糖原異生作用，也可能增加胰外組織對胰島素的敏感性和糖的利用.

表1　無花果多糖提取工藝因素與水平

表2　無花果多糖提取工藝條件設(shè)計方案

表3　無花果多糖工藝條件響應(yīng)曲面模型分析及方差分析

**表示P<0.01，*表示P<0.05.

圖5　酶解溫度和酶用量對無花果多糖含量的響應(yīng)曲面Fig.5　Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis temperature on extractionyield of Ficus carica L.polysaccharides

圖6　 酶用量和pH值度對無花果多糖含量的響應(yīng)曲面Fig.6　Response surface kyrtograph of enzymolysis concentration and enzymolysis pH on extractionyield of Ficus carica L.polysaccharides

圖7　酶解溫度和pH值對無花果多糖含量的響應(yīng)曲面Fig.7　Response surface kyrtograph of enzymolysis temperature and enzymolysis pH on extractionyield of Ficus carica L.polysaccharides

試驗編號A:酶解溫度/℃B:酶用量/gC:pH值無花果多糖含量/%平均值/%150.360.064.7333.89250.360.064.7333.99350.360.064.7334.1234.13±0.87450.360.064.7334.29550.360.064.7334.32

表5　無花果多糖對正常大鼠血糖水平的影響

與空白組比較，**表示P<0.01.

2.6無花果多糖對腎上腺素引起高血糖大鼠血糖水平影響

腎上腺素是腎上腺髓質(zhì)分泌物，能使肝糖元分解，阻礙葡萄糖進(jìn)入肌肉及脂肪組織細(xì)胞，促使血糖升高.對腎上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影響研究表明，無花果多糖對腎上腺素引起的大鼠血糖升高具有明顯的抑制作用，結(jié)果見表6.而這種抑制小鼠糖代謝的作用可能是通過促進(jìn)胰島素的釋放，提高胰島素敏感性，從而增加外周組織對葡萄糖的利用和增加肝糖元合成，調(diào)節(jié)糖代謝和抑制糖異生過程來完成降低血糖的作用.

2.7無花果多糖對糖尿病大鼠血糖的影響

ALX 是一種常用的誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生Ⅱ型糖尿病的物質(zhì)，其致病原因在于它能破壞小鼠的胰島β細(xì)胞導(dǎo)致氧化應(yīng)激而升高血糖，通過對大鼠進(jìn)行腹腔注射 ALX，對大鼠胰島β細(xì)胞進(jìn)行特殊的破壞，從而減少胰島素的來源使大鼠血糖升高，小鼠進(jìn)食量、飲水量、尿量顯著增加，體形明顯消瘦，行動遲緩，說明 ALX 誘導(dǎo)糖尿病模型成功，無花果多糖對造模成功后糖尿病大鼠血糖的作用見表7.與正常組大鼠相比，各組大鼠血糖均明顯升高，有極顯著差異(P<0.01).連續(xù)灌胃給藥后，二甲雙胍組大鼠血糖在不同時期均明顯降低，與ALX模型組相比差異極顯著(P<0.01).無花果多糖中劑量組大鼠的血糖值與模型組相比差異顯著(P<0.05)，而高劑量組與模型組比較血糖明顯降低，差異極顯著(P<0.01).結(jié)果表明無花果多糖對糖尿病模型大鼠具有明顯的降血糖作用，而且這種降血糖作用以高劑量組效果最好，與二甲雙胍組的降糖效果相仿無顯著差異(P>0.05).

表6　無花果多糖對腎上腺素致高血糖

與腎上腺素組比較，**表示P<0.01；與正常組比較，##表示P<0.01.

2.8無花果多糖對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的影響

糖化血紅蛋白是人體血液中HbAlc與葡萄糖通過非酶促的緩慢結(jié)合所形成的一種血紅蛋白組分，與血糖濃度成正比，所以檢測血中 HbAlc水平可以直觀地反映出血糖水平，能更好地反映機體糖代謝的情況.無花果多糖對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的作用見表8.無花果多糖高、中劑量組大鼠糖化血紅蛋白含量顯著下降，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05 和P<0.01)，低劑量組大鼠糖化血紅蛋白含量與模型組比較無顯著性差異(P>0.05).說明無花果多糖能夠降低糖尿病大鼠HbAlc水平，其高劑量效果與二甲雙胍組相當(dāng)(P>0.05).這也說明多糖能刺激ALX致糖尿病大鼠的胰島細(xì)胞的再生并釋放胰島素，使胰島素分泌增多，降低糖尿病大鼠HbAlc水平，有效調(diào)節(jié)和改善糖代謝水平，降低大鼠血清葡萄糖水平.

表7　無花果多糖對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

與模型組比較，**表示P<0.01，*表示P<0.05；與正常組比較，##表示P<0.01.

表8　無花果多糖對糖尿病大鼠糖化

與模型組比較，**表示P<0.01；*表示P<0.05；與正常組比較，##表示P<0.01.

2.9無花果多糖對糖尿病模型大鼠血脂代謝的影響

無花果多糖對糖尿病大鼠血脂代謝的結(jié)果見表9.與正常組相比，糖尿病模型大鼠TC、TG 和HDL 均顯著升高(P<0.05)，而LDL 顯著降低(P<0.05).給藥4周后，模型組與二甲雙胍組比較，TC、TG 、LDL和HDL 均有明顯升高(P<0.05).無花果多糖高劑量組與糖尿病模型組比較大鼠的TC、TG 和HDL，有極顯著性差異(P<0.01)，其對糖尿病模型大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用與二甲雙胍組相當(dāng)，兩組的TC、TG、HDL 及LDL 含量均無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果表明無花果多糖可以調(diào)節(jié)糖尿病大鼠血脂.

表9　無花果多糖對糖尿病大鼠血脂代謝的影響

與模型組比較，**表示P<0.01，*表示P<0.05；與正常組比較，##表示P<0.05.

2.10無花果多糖對大鼠急性毒理試驗

大鼠急性毒性試驗半數(shù)致死量(LD50)未能測出，一次性灌胃給藥約等于6 000 mg /kg bw無花果多糖，觀察28 d，大鼠給藥后外觀毛色光亮，無興奮、不安、竄動、跳躍、豎毛、流淚、流涎、凸眼、扭體反應(yīng)現(xiàn)象，給藥后攝食、進(jìn)水、大小便等均無明顯異常.觀察期間未出現(xiàn)死亡和異常反應(yīng)，大鼠活動自如.并對大鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，然后進(jìn)行心、肝、肺、脾、腎、子宮、睪丸、卵巢、腸等重要臟器病理檢查，均未出現(xiàn)出血、充血、水腫、滲出、潰瘍、穿孔、胸腔、腹腔、心包膜無積液等明顯病理變化，結(jié)果說明無花果多糖是一種無毒物質(zhì).

3討論與結(jié)論

通過酶法和響應(yīng)面法聯(lián)用，對無花果主要活性成分多糖進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究，在提取研究過程中，發(fā)現(xiàn)酶解時間是一個動態(tài)變化的過程，很難確定最佳時間，但是在酶解24 h 后多糖產(chǎn)率達(dá)到穩(wěn)定，所以將酶解時間確定為24 h.通過響應(yīng)面分析結(jié)果確定了無花果多糖的提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解溫度50.36 ℃，酶用量0.06 g和pH4.73，該條件下無花果多糖提取預(yù)測值為34.47%，驗證值為34.13%.目前提取無花果多糖的方法有很多種，傳統(tǒng)提取方法主要是水提法，操作繁瑣時間長而且提取率相對較低[16-19].酶解法條件溫和，操作簡單，節(jié)約原材料，有較高的提取率.無花果多糖提取過程中會因為一些雜質(zhì)類成分如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等而影響提取液的質(zhì)量，而適當(dāng)?shù)拿竿ㄟ^溫和的酶解反應(yīng)可將液體中雜質(zhì)除去，從而提高體系澄清度.單獨用復(fù)合酶法提取無花果多糖提取率相對較高，但其耗時較長，而且酶解法中溫度和pH值都是影響酶解產(chǎn)物的重要因素，它們不但影響酶的穩(wěn)定性，而且還影響酶的活性中心必需基團的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài).在最適pH值和溫度范圍內(nèi)，底物才能與酶充分的結(jié)合，產(chǎn)生大量的產(chǎn)物.所以用響應(yīng)面法和酶解法聯(lián)用優(yōu)化無花果多糖的提取工藝時，將溫度和pH值設(shè)計到最佳條件，改變了以往提取時無花果資源的嚴(yán)重浪費，對無花果的資源開發(fā)和利用具有重要的現(xiàn)實意義.

本試驗研究無花果多糖對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖和血脂的影響.以腹腔注射ALX建立大鼠糖尿病模型，連續(xù)灌胃給藥28 d，研究HAP對糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等指標(biāo)的影響.研究表明，大鼠進(jìn)食量、飲水量、尿量顯著增加，體形明顯消瘦，行動遲緩，符合糖尿病“三多一少”的癥狀，且胰島細(xì)胞破損明顯，導(dǎo)致糖尿病模型組大鼠的FBG 明顯高于正常對照組；經(jīng)過28 d的灌胃治療，無花果多糖治療組不同程度地降低了大鼠的FBG，高劑量治療組的降糖效果顯著；無花果多糖處理降低了大鼠HbA1c含量，作用效果與二甲雙胍組接近；與正常組相比，糖尿病模型組大鼠TC 和TG 濃度顯著升高，HDL的含量有所下降，與糖尿病模型組相比，無花果多糖各劑量組均能使糖尿病大鼠血清中TG、TC 含量降低，同時提高HDL含量，說明能夠改善糖尿病大鼠血脂代謝紊亂的情況；無花果多糖高劑量治療后主動脈內(nèi)膜相比模型組較完整平坦，內(nèi)皮黏附及浸潤于內(nèi)膜的單核細(xì)胞明顯較少，內(nèi)膜增厚明顯輕于模型組，說明無花果多糖可以調(diào)節(jié)降低糖尿病大鼠血脂，對糖尿病大鼠的血管并發(fā)癥有一定的改善作用，對治療高脂血癥、預(yù)防動脈粥樣硬化、冠心病等方面具有廣闊的開發(fā)前景，有望成為一種新型調(diào)節(jié)血脂的保健食品.本研究中一次性灌服無花果多糖最大劑量為5 000 mg/kg bw ，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于毒理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，大鼠急性毒性試驗半數(shù)致死量(LD50)未能測出，大鼠給藥觀察28 d 后，未出現(xiàn)死亡和異常反應(yīng)，大鼠活動自如，說明無花果多糖對大鼠安全無毒.雖然無花果多糖的降血糖作用不如口服降血糖藥二甲雙胍那么強，但其作用比較溫和，不會出現(xiàn)二甲雙胍那樣強烈的低血糖反應(yīng)也是其突出的優(yōu)點，用來開發(fā)無毒無副作用的降糖替代藥物具有重要意義.

參考文獻(xiàn)

[1]蘇現(xiàn)義.植物多糖降血糖作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2014,16(4):7-8

[2]王麗華,張堅,楊永利,等.長角豆膠對小鼠糖代謝的影響[J].營養(yǎng)學(xué)報,2009,31(1):89-91

[3]涂白青,翁宇靜,童智,等.糖尿病小鼠血糖波動模型的建立及其對臟器損傷的研究[J].復(fù)旦大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2008,47(5):647-651

[4]劉欣,李昂,符瑤,等.Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)3-硝基酪氨酸、糖化血紅蛋白等生化指標(biāo)的含量測定及臨床意義[J].北華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2012,13(3):305-308

[5]戴偉娟,司端運,辛勤.無花果多糖對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].中草藥,2000,31(5):355-356

[6]戴偉娟,司端運,仲傳法.無花果多糖對小鼠單核吞噬細(xì)胞吞噬功能影響的研究[J].中醫(yī)藥刊,2002,20(1):98-99

[7]王力男,王勤,苗明三.無花果多糖對環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].中醫(yī)學(xué)報,2010,25(149):676-678

[8]Liu M,Wu K,Mao X Q,et al.Astragalus polysaccharide improve insulin sensitivity in KKAy mice,regulation of PKB/GLUT4 signaling in skeketal muscle[J].J Ethnopharmocol,2010,127(1):32-37

[9]Wang J L,Zhang J,Zhao B T,et al.Structural features and hypoglycaemic effects ofCynomoriumsongaricumpolysaccharides on STZ induced rats[J].Food Chem,2010,120(2):443-451

[10]Hu F D,Li X D,Zhao L G,et al.Antidiabetic properties of purified polysaccharide fromHedysarumpolybotrys[J].Can J Physiol Pharmacol,2010,88(1):64-72

[11]SUN G L,LIN X ,SHEN L,et al.Mono-PEGylated radix ophiopogonis polysaccharide for the treatment of myocardial ischemia[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,49(4):629-636

[12]Xu J ,Wang Y,Xu D S,et al.Hypoglycemic effects of MDG-1,a polysaccharide derived from ophiopogon japonicas,in the ob / ob mouse model of type 2 diabetes mellitus[J].International Journal of Biological Macromolecules,2011,49(4):657-662

[13]Kim H M，Kang J S，Kim J Y，et al.Evaluation of antidiabetic activity of polysaccharide isolated fromPhellinuslinteusin nonobese diabetic mouse[J].Int Immunopharmacol,2010,10(1):72-78

[14]劉娟,韓曉強,姜博.玉米須多糖治療糖尿病作用機制的研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,17(4):242-244

[15]何云,戚玉敏,劉景升,等.山藥多糖對糖尿病大鼠胰島素及血小板的影響[J].河北北方學(xué)院學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2009,26(1):29-31

[16]王振斌,馬海樂,王超.無花果多糖提取技術(shù)研究[J].食品科學(xué),2006,27(2):174-177

[17]余希成,盧俊,曹為民.水溶性無花果多糖的微波提取技術(shù)[J].食品研究與開發(fā),2009,30(9):19-23

[18]陳運江.大孔徑樹脂分離純化無花果多糖工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),20103,7(2):320-321

[19]趙叢枝,苑社強,王磊.響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2提取無花果多糖工藝[J].中國食品學(xué)報,2013,13(7):46-51

[20]張明會,樊亮,高婷婷.響應(yīng)面法與正交設(shè)計提取天麻素工藝比較[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,49(3):60-65

(責(zé)任編輯趙曉倩)

Optimization of polysaccharide extraction process fromFicuscaricaand its function

YE Wen-bin

(Longnan Teachers College,School of Agriculture and Forestry Technology,Chengxian 742500,China)

Abstract：【Objective】 To optimize the technology of polysaccharides extration fromFicuscarica，and study its health to alloxan-induced diabetic rats function.【Method】 Extracting process of polysaccharides fromFicuscaricawere optimized by response surface methodology and enzymolysis,and investigating the effects of polysaccharides on glucose and lipidemia and acute toxicity in alloxan-induced diabetic rats.【Result】 The optimal extraction conditions were hydrolysis temperature of 50.36 ℃,hydrolysis concentration of 0.06 g ,extraction pH of 4.73 and extracting three times.Under the conditions,the predicted and proved value of polysaccharides extracted were 34.47% and 34.13% ,respectively.If polysaccharides were continuously intragastric administration for 28 days ,the polysaccharides could significantly reduce blood glucose adrenaline induced hyperglycemia in normal rats and could decrease the levels of FBG ,HbAlc,TC and TG in serum in alloxan-induced diabetic rats,and increase the concentrations of HDL significantly.【Conclusion】 The optimal process parameters for extracting polysaccharides fromFicuscaricawas obtained ,and the polysaccharides could significantly decrease the blood glucose and improve the disorder of lipid metabolism in alloxan-induced diabetic rats.

Key words：response surface methodology;enzymolysis;Ficuscaricapolysaccharides;optimization process;alloxan-induced diabetic rat

基金項目：甘肅省教育廳資助項目(0928B-1)；甘肅省自然科學(xué)基金項目(1107RJZK243)；隴南師范高等?？茖W(xué)校重點項目(2014LSZK01001).

收稿日期：2015-04-01；修回日期：2015-05-04

中圖分類號：R 284.2 ；Q 946.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)03-0140-10

第一作者：葉文斌(1982-)，男，碩士，講師，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)、果蔬保鮮及植物生理生態(tài).E-mail:yewenbinbest@sohu.com