劉　勇，安艷芳，王仲霞，楊建業(yè)，吳　君

(1南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳　518101； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰　442000)

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細(xì)胞穿透肽CCL融合蛋白的構(gòu)建與表達(dá)

劉勇1，2，安艷芳2，王仲霞2，楊建業(yè)2，吳君2

(1南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518101； 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰442000)

[摘要]目的評(píng)估細(xì)胞穿透肽CCL融合蛋白構(gòu)建的可能性。方法將CCL6-PEP-6XHis構(gòu)建至pABP質(zhì)粒，然后提取pABP-CCL6-PEP質(zhì)粒進(jìn)行人胚腎HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)，以及CCL6-PEP-6XHis 蛋白層析純化和檢測。結(jié)果成功構(gòu)建并純化細(xì)胞穿透肽CCL融合蛋白。將CCL6-PEP-6XHis Tag 基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、接入T 載體、克隆、培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，所得序列與目的基因一致。成功將CCL6-PEP-6XHis基因構(gòu)建至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pABP 中，經(jīng)質(zhì)粒提取和酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，HindⅢ + XbaⅠ切出約430 bp的條帶，符合預(yù)期，酶切鑒定正確。蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測結(jié)果陽性，表明純化得到的目標(biāo)蛋白帶有hisx6標(biāo)簽。結(jié)論細(xì)胞穿透肽CCL融合蛋白能夠人工構(gòu)建，并通過真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞穿透肽； CCL； 基因表達(dá)； 重組融合蛋白質(zhì)

[Chin J Infect Control，2016，15(6)：361-366]

由于多重耐藥菌傳播快，開發(fā)新的抗菌藥物迫在眉捷，是重要的醫(yī)學(xué)問題[1]?？咕?antibacterial peptides)是廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，具有一定抗菌譜的小分子肽，是哺乳動(dòng)物抗感染防御中的重要成分,可參與先天免疫和炎性應(yīng)答諸多方面,具有保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2-6]。CCL6是抗微生物肽(AMP)的重要一員，在腸道等器官大量分布，易于提取，是具有臨床潛力的藥物之一[7-8]。但CCL6由于分子小，易被蛋白酶降解,限制了其臨床應(yīng)用。利用新型技術(shù)提高抗菌肽的穿透力，是抗菌肽研究的熱點(diǎn)和關(guān)鍵問題[7,9]。假設(shè)細(xì)胞穿透肽也可以促進(jìn)抗菌肽的定位及提高局部濃度，從而可大幅度提高抗菌肽的體內(nèi)外抗菌活性。本研究評(píng)估構(gòu)建細(xì)胞穿透肽CCL6融合蛋白的可能性。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人胚腎HEK293細(xì)胞(ATCC,Catalog #CRL21573) 為本研究室保存。大腸埃希菌DH5α、質(zhì)粒pSectagA、pEGFP2C1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pABP、CD 293 TGE medium、(cat#CM-1156) BP fectin轉(zhuǎn)染試劑購自北京百普賽斯生物科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1CCL6-PEP-6XHis基因密碼子優(yōu)化及合成在Pubmed上查詢CCL6及PEP蛋白基因序列，利用Premier Primer軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，設(shè)計(jì)合成的CCL6-PEP-6XHis Tag基因，再根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。切膠回收目的片段，將PCR 產(chǎn)物連入T 載體，挑取克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。通過比對，獲得正確的CCL6-PEP-6XHis 基因序列。

1.2.2質(zhì)粒pABP-CCL6-PEP重組和酶切、測序鑒定CCL6-PEP基因片段以Hind Ⅲ和入XbaⅠ雙酶切,并與同樣酶切的pABP載體于14℃連接過夜, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL Top10 感受態(tài)細(xì)胞，挑取4個(gè)單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。反應(yīng)均按常規(guī)方法操作，利用Primer軟件設(shè)計(jì)添加含Hind Ⅲ和入XbaⅠ酶切位點(diǎn)的CCL6-PEP-6Xhis的產(chǎn)物引物，并利用所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pABP HindⅢ + XbaⅠ酶切線性化載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL Top10 感受態(tài)細(xì)胞，接種平板過夜培養(yǎng)，挑取若干單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒；對所提質(zhì)粒進(jìn)行Hind Ⅲ + XbaⅠ酶切鑒定，并進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3CCL6-PEP-6XHis質(zhì)粒制備與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5a菌中，接種平皿挑取單菌落放大培養(yǎng)，并用DNA提取試劑盒制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA。將HEK293細(xì)胞以0.5×106cells/mL 接種密度接種至 3 L細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中，初始工作體積為1.2 L，培養(yǎng)溫度37℃攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min。當(dāng)活細(xì)胞密度達(dá)(1.5～2.0)×106cells/mL 時(shí), 用0.8 L 的新鮮無血清/化學(xué)成分界定培養(yǎng)基(CD 293 TGE medium)稀釋至終體積為2.4 L?；罴?xì)胞密度稀釋后15 h再度達(dá)到(1.5～2.0)×106cells/mL 時(shí)，用BP fectin作為轉(zhuǎn)染試劑，以3 μL轉(zhuǎn)染試劑/106細(xì)胞, 和1 μL DNA/106細(xì)胞的劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染復(fù)合物根據(jù)ACRO Biosystems 說明書進(jìn)行，并在轉(zhuǎn)染24 h后，以5%/5% (V/V) 比例加入Feed X Supplement補(bǔ)料, 并在轉(zhuǎn)染24 h 和96 h后分別加入ACRO Biosystems 20 mmol/L 及4 mmol/L葡萄糖和谷氨酰胺濃縮液。整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每天觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后收獲HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.4CCL6-PEP-6XHis蛋白的層析純化和檢測收集無血清細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，所得培養(yǎng)液上清采用0.45 μm濾膜過濾、澄清，去除細(xì)胞碎片顆粒，使用5 mL金屬螯合親和層析進(jìn)行分離，依次采用40、100、250 和500 mmol/L咪唑階段梯度進(jìn)行洗脫，對洗脫物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。然后使用Anti-hisx6 抗體對Peak4(峰4)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測。

2結(jié)果

2.1CCL6-PEP-6XHis基因密碼子優(yōu)化及合成經(jīng)過Primer軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，需要合成的CCL6-PEP-6XHis Tag 基因見圖1～2。針對該序列共設(shè)計(jì)18條引物(CCL6-01、02……18 )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收目的片段，連接PCR產(chǎn)物入T 載體，挑取若干克隆進(jìn)行培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，所得序列符合目的基因。

藍(lán)色部分：mouse CCL6 序列；紅色部分：PEP1 序列；黃色部分：6XHis Tag 序列

圖2　CCL6-PEP-6XHis基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Figure 2Electrophoretogram of PCR product of CCL6-PEP-6XHis gene

2.2質(zhì)粒pABP-CCL6-PEP 重組成功將CCL6-PEP-6XHis基因構(gòu)建至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pABP 中。設(shè)計(jì)載體構(gòu)建引物，設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。見表1、圖3。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pABP Hind Ⅲ + XbaⅠ酶切線性化載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL Top10 感受態(tài)細(xì)胞，接種平板過夜培養(yǎng)。隔夜培養(yǎng)平板培養(yǎng)出>100 個(gè)單菌落。見圖4。

表1　設(shè)計(jì)載體構(gòu)建引物

A:PCR粗產(chǎn)物;B:回收產(chǎn)物;C:酶切后產(chǎn)物

Figure 3Electrophoretogram of PCR product, extracted PCR product, and restriction enzyme-digested PCR product of pABP-CCL6-PEP gene

圖4　質(zhì)粒pABP-CCL6-PEP重組克隆隔夜培養(yǎng)平板

Figure 4Overnight incubated plates of recombinant clones of plasmid pABP-CCL6-PEP

2.3.1酶切鑒定挑取4 個(gè)單菌落過夜振蕩培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，對所提的4 管質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，HindⅢ + XbaⅠ切出約430 bp的條帶，符合預(yù)期，表明酶切鑒定正確。見圖5。

圖5　質(zhì)粒pABP-CCL6-PEP及其酶切鑒定電泳圖

Figure 5Electrophoretogram of plasmid pABP-CCL6-PEP and restriction enzyme digestion

2.3.2表達(dá)載體測序結(jié)果對表達(dá)載體pABP-CCL6-PEP進(jìn)行測序鑒定，比對結(jié)果表明，測序完全正確，符合設(shè)計(jì)。見圖6。

圖6　pABP-CCL6-PEP基因測序圖

2.4CCL6-PEP-6XHis質(zhì)粒制備與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

2.4.1CCL6-PEP-6XHis質(zhì)粒制備將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5a菌中，接種平皿培養(yǎng)后挑取單菌落放大培養(yǎng)，并用DNA提取試劑盒制備轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA。提取質(zhì)粒名稱CCL6-PEP-6XHis，DNA比光度為1.82，數(shù)量為13.2，轉(zhuǎn)染DNA為3.8 mg。

2.4.2細(xì)胞培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的生長曲線見圖7。細(xì)胞峰活細(xì)胞密度(Peak VCD)達(dá)4.8 million/mL，總細(xì)胞密度(TCD)達(dá)7.66 million/mL，活細(xì)胞比VCD/TCD為63%。

2.5CCL6-PEP-6XHis蛋白的層析純化和檢測

2.5.1CCL6-PEP-6XHis蛋白層析純化約2.8 L無血清細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過15 min低速離心(4 000 r/min)去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，依次采用不同濃度咪唑階段梯度進(jìn)行洗脫，層析分離圖譜見圖8。以上金屬螯合親和層析收集各洗脫峰，SDS-PAGE還原電泳檢測。峰4(P4)為500 mmol/L咪唑洗脫后所得目標(biāo)蛋白。總細(xì)胞上清液為2 650 mL,目標(biāo)蛋白約43 mL,根據(jù)紫外分光儀波長280 nm檢測，目標(biāo)蛋白低于最低檢測閾值。

圖7CCL6-PEP-6XHis質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)生長曲線

Figure 7Growth curve of transient expression of plasmid CCL6-PEP-6XHis in HEK293 cell

2.5.2目標(biāo)蛋白SDS-PAGE電泳分析根據(jù)SDS-PAGE電泳分析(見圖9)，目標(biāo)蛋白(約15 kD)與金屬螯合填料(IMAC)結(jié)合較強(qiáng)，需使用500 mmol/L 咪唑洗脫(P4)。根據(jù)電泳條帶估計(jì)，純化得到0.05～0.1 mg痕量目標(biāo)蛋白，當(dāng)前方案的表達(dá)量較低。

圖8　CCL6-PEP-6XHis蛋白金屬螯合親和層析分離純化層析圖譜

柱M:蛋白Marker;柱1:細(xì)胞培養(yǎng)上清液；柱2:未洗脫前離心液；柱3—5: 分別為40、100、250 mmol/L 咪唑洗脫后；柱6:第三峰(P3)尾峰的250 mmol/L咪唑洗脫后；柱7—8: 500 mmol/L 咪唑洗脫后 (CCL-PEP-6XHis)，其中柱8采用20倍濃縮

圖9CCL6-PEP-6XHis蛋白層析分離純化還原電泳分析圖

Figure 9Electrophoretogram of chromatographic separation and purification of CCL6-PEP-6XHis protein

2.6CCL6-PEP-6XHis蛋白Western Blot檢測使用Anti-hisx6抗體對P4進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果確定為陽性，表明純化得到的目標(biāo)蛋白帶有hisx6標(biāo)簽，但由于濃度較低，顯色條帶肉眼觀察較淺。見圖10。

1泳道：陽性對照；2泳道：空白對照； 3泳道：Marker； 4泳道：洗脫后的P4

圖10CCL6-PEP-6XHis蛋白Western Blot 檢測結(jié)果

Figure 10Western Blot analysis on CCL6-PEP-6XHis protein

3討論

多重耐藥菌是臨床期待解決的問題。腸道分泌的CCL6具有廣泛抗病原體作用，且對人體無害，是一種理想的候選抗菌藥物[7,10-12]。但CCL6由于分子小,易被蛋白酶降解,限制了其臨床應(yīng)用。利用新型技術(shù)提高抗菌肽的穿透力，是抗菌肽研究的熱點(diǎn)和關(guān)鍵問題。本研究成功構(gòu)建了細(xì)胞穿透肽CCL6融合蛋白，為進(jìn)一步高表達(dá)目的蛋白及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

研究[13]表明，HEK293細(xì)胞是比較理想的宿主細(xì)胞。本課題中的CCL6由于具有殺菌作用，不宜于采用傳統(tǒng)的大腸埃希菌培養(yǎng)。初試中載體細(xì)菌起初濃度呈指數(shù)增加，但隨時(shí)間進(jìn)展，尤其3 d后數(shù)量又呈指數(shù)下降，大腸埃希菌表達(dá)的CCL6由于自身的殺傷作用導(dǎo)致產(chǎn)量低下。表明CCL6具有強(qiáng)大的殺菌作用，且與濃度呈正相關(guān)，大腸埃希菌并非其理想表達(dá)系統(tǒng)。由于CCL6機(jī)制主要為破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，因而對細(xì)胞無損傷[10]。本組研究采用HEK 293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，避免了對宿主的破壞，提高了蛋白的產(chǎn)出率。

CCL6的最低抑菌濃度值較高，達(dá)到理想殺菌效果的濃度需100 nmoL左右，表明CCL6的細(xì)胞壁穿透能力有待進(jìn)一步提高。該濃度的CCL6價(jià)格昂貴，限制了其在臨床廣泛使用。因而增強(qiáng)CCL6的透壁能力十分必要。PEP-1是一種穿透蛋白，能夠增強(qiáng)靶分子的細(xì)胞壁穿透能力。既往研究[14-15]表明，PEP-1能夠增強(qiáng)靶蛋白的穿透能力，提高生物活性，如SOD,EGFP和過氧化氫酶等。理論上PEP-1可以提高CCL6的穿壁能力，但能夠提高CCL6的穿壁能力是否一定提高殺菌能力尚需要進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步評(píng)估CCL6的殺菌機(jī)制，開發(fā)新一代抗菌素奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。本研究的限制之處為靶蛋白的濃度和產(chǎn)量還不夠高，未來實(shí)驗(yàn)中需要予以進(jìn)一步改良和優(yōu)化。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1]Wittekamp BH, Bonten MJ. Antibiotic prophylaxis in the era of multidrug-resistant bacteria [J]. Expert Opin Investig Drugs, 2012,21(6):767-772.

[2]Vila-Farrés X, Giralt E, Vila J. Update of peptides with antibacterial activity [J]. Curr Med Chem, 2012,19 (36):6188-6198.

[3]Liao Z, Wang XC, Liu HH, et al. Molecular characterization of a novel antimicrobial peptide from Mytilus coruscus [J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34 (2):610-616.

[4]Gottschalk S, Gottlieb CT, Vestergaard M, et al. Amphibian antimicrobial peptide fallaxin analogue FL9 affects virulence gene expression and DNA replication inStaphylococcusaureus[J]. J Med Microbiol, 2015, 64(12): 1504- 1513.

[5]Chen B, Fan DQ, Zhu KX, et al. Mechanism study on a new antimicrobial peptide Sphistin derived from the N-terminus of crab histone H2A identified in haemolymphs of Scylla paramamosain [J]. Fish Shellfish Immunol, 2015,47(2): 833-846.

[6]Goh HF, Philip K. Purification and characterization of bacteriocin produced by weissella confusa A3 of dairy origin [J]. PloS one, 2015,10(10):e0140434.

[7]Kotarsky K, Sitnik KM, Stenstad H, et al. A novel role for constitutively expressed epithelial-derived chemokines as antibacterial peptides in the intestinal mucosa [J]. Mucosal Immunol, 2010,3(1):40-48.

[8]Liu JY, Li F, Wang LP, et al. CTL-vs Treg lymphocyte-attracting chemokines, CCL4 and CCL20, are strong reciprocal predictive markers for survival of patients with oesophageal squamous cell carcinoma [J]. Br J Cancer, 2015,113(5):747-755.

[9]Zhang YE, Wang JN, Tang JM, et al. In vivo protein transduction: delivery of PEP-1-SOD1 fusion protein into myocardium efficiently protects against ischemic insult [J]. Mol Cells, 2009,27(2):159-166.

[10] Bukharin OV, Valyshev AV. mechanisms of resistance ofenterococcito antimicrobial proteins and peptides [J]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2012,5:89-94.

[11] Corrales-Garcia L, Ortiz E, Castaeda-Delgado J, et al. Bacterial expression and activities of recombinant variants of human β-defensins on pathogenic bacteria andM.tuberculosis[J]. Protein Expr Purif, 2013,89 (1):33-43.

[12] Hu H, Wang C, Guo X, et al. Broad activity against porcine bacterial pathogens displayed by two insect antimicrobial peptides moricin and cecropin B [J]. Mol Cells, 2013,35(2):106-114.

[13] Chumanov RS, Kuhn PA, Xu W, et al. Expression and purification of full-length mouse CARM1 from transiently transfected HEK293T cells using Halo Tag technology [J]. Protein Expr Purif, 2011,76(2):145-153.

[14] 黃光慶,王家寧, 唐俊明,等. 細(xì)胞穿透肽 PEP-1介導(dǎo)過氧化氫酶轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠心肌H9C2細(xì)胞 [J]. 鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010,29(2):103-107.

[15] 張永軍，王家寧，唐俊明，等. PEP-1-CAT融合蛋白預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 [J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,29(12):2429-2432.

(本文編輯：左雙燕)

Construction and expression of cell-penetrating peptide CCL fusion protein expression vector

LIUYong1,2,ANYan-fang2,WANGZhong-xia2,YANGJian-ye2,WUJun2

(1ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen518101,China; 2RenminHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the construction of expression vector for fusion protein of cell-penetrating peptide CCL (PEP-CCL). MethodsCCL6-PEP-6XHis was inserted into plasmid pABP, pABP-CCL6-PEP plasmid was extracted and then transfected into HEK293 cells, CCL6-PEP-6XHis was expressed and purified by chromatography and detected with Western Blot. ResultsPEP-CCL express vector was successfully constructed and purified. PCR product of CCL6-PEP-6XHis Tag was ligated with T vector, recombinant was transferred into the host cells, then host cells were cultured, plasmid was extracted and sequenced, the sequence was identical to targeted gene. CCL6-PEP-6XHis was successfully inserted into the eukaryotic expression vector pABP, plasmid was extracted and digested, electrophoresis results revealed that a fragment with 430bp was digested by Hind Ⅲ+XbaⅠ, which was identical to the expected value. Western Blot revealed that CCL6-PEP fusion protein could be recognized by His monoclonal antibody. ConclusionPEP-CCL express vector can be constructed and expressed in eukaryotic cells.

[Key words]cell-penetrating peptide; CCL; gene expression; recombinant fusion protein

[收稿日期]2015-08-23

[基金項(xiàng)目]湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目支持(D20112101)

[作者簡介]劉勇(1973-)，湖北省十堰市人，男(漢族)，副主任醫(yī)師，主要從事危重病研究。 [通信作者]吳君E-mail:1091372776@qq.com

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.06.001

[中圖分類號(hào)]R3Q2-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2016)06-0361-06

·論著·