劉凌云 劉 浩 趙 晶 王艷霞 王棚濤

河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/棉花生物學(xué)國家重點實驗室/植物逆境生物學(xué)重點實驗室， 河南開封 475004

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擬南芥低葉綠素?zé)晒釲CF3基因的克隆與功能分析

劉凌云 劉 浩 趙 晶 王艷霞 王棚濤*

河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/棉花生物學(xué)國家重點實驗室/植物逆境生物學(xué)重點實驗室， 河南開封 475004

摘 要：葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)在測定葉片光合作用中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨特的作用。本研究借助葉綠素?zé)晒獬上駜x， 從擬南芥EMS誘變突變體庫中篩選到一株低葉綠素?zé)晒馔蛔凅wlcf3-1 （lower chlorophyll fluorescence 3-1）。遺傳分析表明lcf3-1突變體為單基因隱性突變。突變基因圖位克隆結(jié)果顯示LCF3是PsbW的等位基因。另外， LCF3基因的T-DNA插入突變體及功能回補轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素?zé)晒夥治鼋Y(jié)果均證明LCF3基因突變導(dǎo)致擬南芥葉綠素?zé)晒釬v/Fm值降低。進一步實驗結(jié)果顯示， LCF3蛋白定位于葉綠體， 且LCF3基因在植株中普遍表達。PsbW蛋白可能細微調(diào)整PSII-LHCII超復(fù)合體的組裝及穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：擬南芥； 葉綠素?zé)晒猓?光合作用； 圖位克隆

本研究由國家自然科學(xué)基金項目（31170253）和河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目（142300413206）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31170253） and the Basic and Advanced Technology Research Project in Henan Province （142300413206）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ lingyunl@henu.edu.cn

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.010.html

光合作用是綠色植物最重要的生理活動之一，該作用分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)2個階段， 是植物和光合細菌將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的重要過程。光反應(yīng)中光的吸收是由僅能吸收利用長波光的系統(tǒng) PSI （photosystem I）和只能吸收利用短波光的系統(tǒng) PSII （photosystem II）完成［1-2］。其中PSII是由多個亞單位組成的色素-蛋白復(fù)合體， 該復(fù)合體參與植物光合系統(tǒng)中光解放氧過程［3］。藍藻PSII復(fù)合體主要由分子量＜10 kD的低分子量蛋白組成， 高等植物PSII復(fù)合體則含有藍藻中不具備的3個低分子量蛋白PsbR、PsbTn和PsbW［4］， 這3個蛋白的細胞定位及功能特點還不完全清楚。

PsbW是一個6.1 kD的PSII低分子量蛋白亞基，最初發(fā)現(xiàn)是菠菜PSII的組成成分［5-6］， 該蛋白僅參與PSII但不涉及PSI蛋白復(fù)合體的組成［7-8］， 具有穩(wěn)定PSII同源二聚體結(jié)合的潛在作用［9］。然而， 近年發(fā)現(xiàn)PsbW與Lhcb蛋白一起參與PSII后續(xù)組裝步驟［10-13］，并且PsbW缺失導(dǎo)致有序排列的PSII-LHCII （lightharvesting complex II）超復(fù)合體的大結(jié)構(gòu)域不能形成，從而使PSII亞單位之間能量傳遞效率降低， 同時PSII對光脅迫響應(yīng)的調(diào)節(jié)變慢［14］。

植物吸收太陽光主要用于光合作用、熱耗散和葉綠素?zé)晒?。葉綠素?zé)晒獍l(fā)射除了受到激發(fā)能的傳遞、天線色素和反應(yīng)中心色素性質(zhì)和定位的影響外，還受PSII反應(yīng)中心供體側(cè)和受體側(cè)氧化還原狀態(tài)的影響［15-17］。葉綠素各熒光參數(shù)的變化間接反映葉綠體及其內(nèi)部葉綠素狀態(tài)。因此， 葉綠素?zé)晒獬蔀楣夂献饔醚芯恐袠O重要的富含信息的高效指示劑。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)是一種以光合作用理論為基礎(chǔ)， 利用體內(nèi)葉綠素作為天然探針， 研究和探測植物光合生理狀況及各種外界因子對其影響的新型植物活體測定和診斷技術(shù)。本研究運用此技術(shù)，篩選出葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值較野生型低的突變體lcf3-1， 并對其進行分子克隆及基因定位研究。轉(zhuǎn)基因回補實驗證實該基因是PsbW的等位基因。LCF3定位于葉綠體， 并在植物中普遍表達。對LCF3的研究使葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)篩選突變體的理論和方法得到不斷的完善， 并且為光合作用機制的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

將野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）的生態(tài)型Columbia （Col）用于表型篩選， 生態(tài)型Landsberg erecta （Ler）用于圖位克隆。擬南芥突變體lcf3-1是EMS （甲基磺酸乙酯）誘變Col野生型得到的低葉綠素?zé)晒馔蛔凅w。

1.2 材料種植

擬南芥種子用0.01%升汞懸浮浸泡5 min， 無菌水漂洗5次后， 播種于含0.6%瓊脂的MS培養(yǎng)基上。4℃春化2～4 d后放入培養(yǎng)間， 待種子萌發(fā)， 生長10 d左右移至土中繼續(xù)生長。生長條件為22℃ （晝）/18℃ （夜）， 光周期為16 h （光）/8 h （暗）， 光強為120～130 μmol m-2s-1。

1.3 突變體的遺傳分析

以突變體lcf3-1為母本、野生型Ler為父本， 雜交得到F1代， F1自交獲得F2代。觀察F2代表型， 并統(tǒng)計植株表型的分離比。

1.4 轉(zhuǎn)基因材料的獲得

以野生型Col基因組DNA為模板， 以LCF31F∶5'-GGGGGATCCTCTCAGAATGCAGAATATCAGA-3'和LCF31R∶ 5'-CCCAAGCTTCCATGTTAACTATAT GTGTATTC-3'為引物擴增LCF3基因構(gòu)建回補載體LCF3∶pCAMBIA1300-COM； 以LCF32F∶ 5'-GGGAA GCTTCAGATATAGTTCACAGCAACAT-3'和LCF32R∶5'-CCCGGATCCGCGGAGGCAGTAAAGCTAGCC-3'為引物構(gòu)建pLCF3∶pCAMBIA1391-GUS載體； 以野生型Col的cDNA為模板， 分別以LCF33F∶ 5'-GGGG GTACCATGGCTAGCTTTACTGCCTCCG-3'和LCF3 3R∶ 5'-GGGGGATCCGAGTGAAAGACCAGATTCT TC-3'及LCF34F∶ 5'-GGGAAGCTTATGGCTAGCTTT ACTGCCTCCG-3'和LCF34R∶ 5'-GGGGGTACCGA GTGAAAGACCAGATTCTTC-3'為引物構(gòu)建帶GFP標簽的永久表達載體LCF3∶super1300+-GFP和瞬時表達載體LCF3∶∶pHBT-GFP。將以上獲得的重組載體分別以農(nóng)桿菌介導(dǎo)［18］或者PEG介導(dǎo)［19］的方法轉(zhuǎn)入突變體lcf3-1或野生型擬南芥Col， 以及野生型Col葉肉細胞原生質(zhì)體。對其中永久表達植株通過潮霉素篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因材料進行功能分析， 葉肉細胞原生質(zhì)體瞬時表達LCF3∶GFP在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光， 進行LCF3蛋白亞細胞定位分析。

1.5 葉綠素?zé)晒獾臏y定

參照 Wang等［20］方法進行 β-葡糖苷酸酶（GUS）的組織化學(xué)染色和共聚焦顯微鏡觀察 GFP熒光定位。利用葉綠素?zé)晒獬上駜x（CF Imager， Technologica公司）于25℃下測定葉綠素?zé)晒忖邕^程。葉片暗適應(yīng)30 min后， 測定Fv/Fm值。Fv/Fm比值反映光合系統(tǒng)II光化學(xué)反應(yīng)的最大光合效率。該參數(shù)被廣泛應(yīng)用于光合系統(tǒng)受脅迫程度的檢測， Fv/Fm值降低暗示光合系統(tǒng)II受損傷。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素?zé)晒馔蛔凅wlcf3-1的表型分析

突變體 lcf3-1在植株形態(tài)和葉片顏色及開花時間上與野生型均無明顯差異。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)lcf3-1 10 d后， 利用葉綠素?zé)晒獬上駜x檢測其葉綠素?zé)晒獗硇停?發(fā)現(xiàn)突變體Fv/Fm值低于Col及Ler野生型（圖1-B）。將突變體lcf3-1移栽土中培養(yǎng)25 d后， 其Fv/Fm值仍低于野生型（圖1-D）， 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示兩者之間存在顯著相差（P ＜ 0.05）。經(jīng)暗處理3 d后， 二者在葉綠素含量上無明顯區(qū)別（圖2-A）， 但二者Fv/Fm值相差0.20左右， 較暗處理前差異明顯增大（圖2-B）。

圖1 葉綠素?zé)晒馔蛔凅w的篩選Fig.1 Mutants screening by chlorophyll fluorescence imaging

圖2 lcf3-1突變體葉綠素含量及Fv/Fm值Fig.2 Chlorophyll content and chlorophyll fluorescence Fv/Fmin WT and lcf3-1 mutant

表1 突變體遺傳分析Table 1 Genetic analysis of lcf3-1 mutant

2.2 突變體lcf3-1的遺傳分析

將突變體與Col野生型回交， 回交F1代所有植株均表現(xiàn)野生型表型， F1代自交得到F2代， F2代種下后經(jīng)暗處理， 葉綠素?zé)晒獬上駲z測Fv/Fm， 發(fā)現(xiàn)F2代表型出現(xiàn)分離， 分離比例接近 3∶1 （表 1）， 這表明lcf3-1為單基因隱性突變， 可以通過圖位克隆的方法找到該突變位點。

2.3 LCF3基因的圖位克隆

將lcf3-1突變體和Ler野生型雜交得到F1代， F1自交得到F2代， 挑選F2代中具有l(wèi)cf3-1突變體表型的88株植株分別提取DNA， 利用TAIR網(wǎng)站上的引物（marker）信息粗定位。經(jīng)過 PCR及凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)lcf3-1突變位點與第 2染色體中下游NGA168 BAC明顯連鎖， 重組率約為10.94%。由此推斷， 該突變基因位于第 2染色體下端附近。在此基礎(chǔ)上擴大遺傳群體， 用616個F2代lcf3-1低葉綠素?zé)晒獗硇椭仓甑腄NA在NGA168 BAC的兩端分別設(shè)計引物進一步細定位， 發(fā)現(xiàn)突變位點可能位于 T6B20 BAC上， 重組率為1.62% （圖3-A）。通過進一步精細定位和測序確定突變基因為 At2G30570， 該基因只含有一個內(nèi)含子， lcf3-1突變體中At2G30570內(nèi)含子的3′端剪接邊界區(qū)發(fā)生突變， 由鳥嘌呤（G）轉(zhuǎn)換為腺嘌呤（A）（圖3-B）， 從而使lcf3-1突變體中LCF3基因的 mRNA出現(xiàn)不同大小的剪接版本（圖 4）， 表明lcf3-1突變體中LCF3正常的剪接過程出現(xiàn)了錯誤。

2.4 LCF3影響葉綠素?zé)晒獗硇偷墓δ茯炞C

從SALK中心獲得了PsbW （At2G30570）基因的T-DNA插入突變體 SAIL_885_A03， 命名為 lcf3-2，并通過半定量RT-PCR檢測其At2G30570未表達（圖5）。在lcf3-1突變體背景下構(gòu)建了PsbW自身啟動子驅(qū)動的 PsbW回補轉(zhuǎn)基因植株， 暗處理后， 突變體lcf3-1和lcf3-2均顯示出明顯低于野生型的低葉綠素?zé)晒獗硇停▓D6-A）， 而lcf3-1突變體背景的回補轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出和野生型相似的表型（圖6-B）。這一結(jié)果進一步證實 lcf3-1突變體的低葉綠素?zé)晒獗硇褪怯蒐CF3/PsbW （At2G30570）基因突變所致。

2.5 LCF3蛋白亞細胞定位分析

LCF3基因突變導(dǎo)致擬南芥低葉綠素?zé)晒獗硇?，推?LCF3蛋白可能是在葉綠體中發(fā)揮作用。pHBT-GFP空載體轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體時，GFP熒光幾乎充滿整個細胞質(zhì)部分（圖7-A）。融合蛋白LCF3∶∶GFP的綠色熒光則特異地出現(xiàn)在細胞內(nèi)葉綠體中（圖7-B）。另外LCF3∶super1300+-GFP永久轉(zhuǎn)基因植株也顯示氣孔保衛(wèi)細胞中LCF3∶GFP融合蛋白綠色熒光與葉綠體紅色自發(fā)熒光完全重合（圖7-C）。以上結(jié)果說明LCF3蛋白定位于葉綠體中。

圖3 LCF3基因的克隆Fig.3 Map-based cloning of LCF3 gene

圖4 lcf3-1突變體基因突變位點分析Fig.4 Analysis of mutation site of lcf3-1 mutant

圖5 野生型及l(fā)cf3-2突變體中LCF3基因表達情況Fig.5 Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA insertion line lcf3-2 by RT-PCR

圖6 LCF3基因突變導(dǎo)致低葉綠素?zé)晒獗硇偷尿炞CFig.6 Verification of the function of LCF3 gene on chlorophyll fluorescence

2.6 LCF3基因組織表達分析

利用分離得到的 LCF3基因啟動子與報告基因GUS融合的轉(zhuǎn)基因植株， 檢測 LCF3在擬南芥不同組織中的表達模式。組織化學(xué)染色表明， 14 d齡植株葉片與根成熟區(qū)有強烈的GUS表達， 而根尖分生組織沒有GUS表達。植物抽薹后對花進行GUS活性染色， 發(fā)現(xiàn)花萼、花藥以及柱頭中均有GUS表達（圖8）。這一結(jié)果暗示LCF3可能在植物發(fā)育的不同時期均有作用。

3 討論

本文根據(jù)葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)原理， 用葉綠素?zé)晒獬上駜x篩選出熒光參數(shù) Fv/Fm值比野生型低的擬南芥突變體 lcf3-1， 并發(fā)現(xiàn)其低葉綠素?zé)晒獗硇涂梢苑€(wěn)定遺傳。對lcf3-1突變體的遺傳分析表明， lcf3-1是單基因隱性突變體。突變基因經(jīng)圖位克隆最終將突變位點限定在擬南芥第2染色體中下部的T6B20 和F7F1 BAC之間， 對這2個BAC間所有基因的生物信息學(xué)分析， 找到 3個可能與光合作用有關(guān)的基因， 并進行基因測序， 最終認定lcf3-1突變體中突變基因LCF3為At2G30570。在lcf3-1突變體中， 該基因內(nèi)含子3'邊界一個堿基發(fā)生突變， 由鳥嘌呤（G）轉(zhuǎn)換為腺嘌呤（A）。該突變導(dǎo)致LCF3基因的轉(zhuǎn)錄本在剪切成熟過程中發(fā)生錯誤， 部分轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子無法被剪切， 導(dǎo)致所編碼的蛋白功能異常。我們所克隆的LCF3突變基因與已經(jīng)報道的PsbW基因是等位基因。LCF3基因突變導(dǎo)致擬南芥葉綠素?zé)晒釬v/Fm值低于野生型。LCF3的 T-DNA插入缺失突變體lcf3-2也表現(xiàn)出類似于lcf3-1的低葉綠素?zé)晒獗硇?。結(jié)合我們獲得的表型回補轉(zhuǎn)基因植株能夠恢復(fù)擬南芥 lcf3-1突變體低葉綠素?zé)晒獗硇停?證明該突變體出現(xiàn)的低葉綠素?zé)晒獗硇痛_實是由PsbW （At2G30570）基因突變所致。

圖7 LCF3蛋白亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of LCF3

圖8 LCF3基因的組織表達分析Fig.8 Organ-specific expression of LCF3 in Arabidopsis

PsbW基因編碼一個分子量為6.1 kD的小分子蛋白， 存在于真核光合細胞中， 是光系統(tǒng) II蛋白復(fù)合體的一個成分。已有文獻報道PsbW基因T-DNA插入敲除突變體與反義抑制突變體均導(dǎo)致光系統(tǒng) II超分子復(fù)合體不穩(wěn)定［14］。只有光系統(tǒng) II （PSII）與集光復(fù)合體（LHCII）未結(jié)合形成超分子復(fù)合體時， 能夠檢測或分離出游離的PsbW蛋白。PsbW蛋白缺失表現(xiàn)出葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fv/Fm減少， 光系統(tǒng) II核心蛋白磷酸化作用顯著降低， 以及暗適應(yīng)葉片中質(zhì)體醌池氧化還原狀態(tài)的明顯改變。此外， PsbW蛋白缺失還導(dǎo)致質(zhì)體醌池中氧化還原反應(yīng)加快。PsbW缺失突變體和反義抑制突變體能夠光自養(yǎng)正常生長， 說明PsbW蛋白對光合細胞來說不是必不可少的亞基。雖然PsbW缺失突變體植株P(guān)SII-LHCII超復(fù)合體結(jié)構(gòu)改變， 但突變體細胞中葉綠體結(jié)構(gòu)與野生型類似。因此PSII-LHCII超分子復(fù)合體的穩(wěn)定性對植物葉綠體類囊體膜上基粒的形成可能不是必需條件［21］。PsbW 蛋白亞基在高等植物葉綠體中的進化源于陸生植物， 其與葉綠體膜上的捕光天線色素蛋白一起參與光合作用。PsbW蛋白可能細微調(diào)整PSII-LHCII超復(fù)合體的組裝及穩(wěn)定， 因此能在葉綠體基粒膜上形成PSII-LHCII超復(fù)合體的有序排列， 優(yōu)化陸生植物的光合作用， 有效地應(yīng)對植物生存環(huán)境條件的改變。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)技術(shù)作為光合作用研究手段，在植物光合作用突變體篩選中起到了重要作用［22-24］，本文的實驗結(jié)果也印證了這一點。同時這一技術(shù)也隨著人們對光合作用認識的不斷深入而改進。

4 結(jié)論

利用圖位克隆技術(shù)成功克隆到 LCF3基因。該基因突變導(dǎo)致擬南芥葉綠素?zé)晒饨档?。lcf3-1突變體的葉綠素?zé)晒獗硇蜑?At2G30570基因突變所致。LCF3基因在植物中普遍性表達。LCF3定位于葉綠體， 與其參與光合作用調(diào)節(jié)的功能相吻合。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00690

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 王棚濤， E-mail∶ wangpt126@126.com

收稿日期Received（）∶ 2015-06-09； Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-01-25.

Map-based Cloning and Functional Analysis of Low Chlorophyll Fluorescence Gene LCF3 in Arabidopsis thaliana

LIU Ling-Yun， LIU Hao， ZHAO Jing， WANG Yan-Xia， and WANG Peng-Tao*
Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology/State Key Laboratory of Cotton Biology/College of Life Sciences， Henan University， Kaifeng 475004， China

Abstract：Chlorophyll fluorescence has exclusive role for determining the kinetics of light energy absorption， transmission， dissipation and distribution in leaf photosynthesis.In this study， a mutant was screened by chlorophyll fluorescence equipment from EMS mutagenesis of wild-type Arabidopsis Col-0， which showed lower Fv/Fmthan wild-type and was named lcf3-1 （lower chlorophyll fluorescence 3-1）.Genetic analysis of lcf3-1 mutant suggested that the mutation was controlled by single recessive gene.LCF3 gene， which encodes PsbW protein， was isolated by map-based cloning.The T-DNA insertion mutant lcf3-2 showed low chlorophyll fluorescence phenotype as lcf3-1， and this phenotype could be complemented by LCF3 gene of wild-type.These experiments implied that the phenotype of low-chlorophyll-fluorescence resulted from LCF3 gene mutation.Furthermore， our results indicated that LCF3 protein is located in chloroplast and LCF3 gene is expressed in various tissues.PsbW protein is important for the contact and stability between several PSII-LHCII supercomplexes.

Keywords：Arabidopsis thaliana； Chlorophyll fluorescence； Photosynthesis； Map-based cloning