譚太龍 馮 韜 羅海燕 彭 燁 劉睿洋 官春云

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心， 湖南長(zhǎng)沙 410128

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甘藍(lán)型油菜磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（BnPDAT1） cDNA的克隆和功能鑒定

譚太龍 馮 韜 羅海燕 彭 燁 劉睿洋 官春云*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心， 湖南長(zhǎng)沙 410128

摘 要：磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（phospholipids∶diacylglycerol acyltransferase， PDAT1）是植物三酰甘油（triacylglycerol， TAG）合成的關(guān)鍵酶。本文在甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)cDNA中克隆到3個(gè)PDAT1全長(zhǎng)編碼序列（coding sequence，CDS）， 經(jīng)比對(duì)分別定位于A02、A10、C09染色體， 分別命名為BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09， 其序列長(zhǎng)分別為1998、2002和2005 bp， 各自編碼665、666、667個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)BnPDAT1基因編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜， 具有典型的PDAT1保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對(duì)和進(jìn)化分析表明， BnPDAT1基因編碼蛋白與甘藍(lán)、擬南芥、亞麻芥PDAT1蛋白具有較高的同源性。酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 該基因編碼蛋白具有PDAT1酶活性。BnPDAT1基因在湘油15號(hào)中的表達(dá)現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)， 在開花后25～30 d達(dá)最大值， 但3個(gè)拷貝的表達(dá)變化規(guī)律存在差異。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜； 磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶； 基因克??； 酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

本文由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401419）， 湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（13B051）， 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA10A104， 2012AA101107）和湖南省作物種質(zhì)資源與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)基金開放項(xiàng)目（11KFXM08）資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （31401419）， Outstanding youth project of Hunan Provincial Education Department （13B051）， the National High Technology Research and Development Program of China （2011AA10A104，2012AA101107）， and Science Foundation of Hunan Provincial Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization in Crop （11KFXM08）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ ttl205@aliyun.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.016.html

甘藍(lán)型油菜通過(guò)不同途徑合成三酰甘油（triacylglycerol， TAG）并形成油體儲(chǔ)藏于種子中， 這種儲(chǔ)藏油脂是我國(guó)最重要的油料來(lái)源之一， 對(duì)于保證食用油供給十分重要。我國(guó)生產(chǎn)的甘藍(lán)型油菜含油量為40%左右， 與加拿大等發(fā)達(dá)國(guó)家尚具較大差距， 提高菜籽含油量可明顯提高我國(guó)油菜的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，產(chǎn)生可觀的社會(huì)效益［1］。因此， 研究甘藍(lán)型油菜種子中TAG合成與積累具有重要的意義。

植物油脂代謝具有高度的生物學(xué)復(fù)雜性， 如擬南芥的油脂代謝網(wǎng)絡(luò)涉及600多個(gè)基因［2］， 多個(gè)基因影響TAG的合成量。植物TAG合成分為脂肪酸鏈形成和TAG組裝2個(gè)過(guò)程， 其中TAG組裝量直接決定植物種子TAG的總量。植物以三磷酸甘油（sn-glycerol-3-phosphate， G3P）為骨架， 以脂肪酸（fatty acid， FA）為底物通過(guò)一系列酶促反應(yīng)合成TAG有兩種途徑。其一， Kennedy途徑， 以甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase， GPAT）、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase， LPAAT）、磷脂酸酯酶（phosphatidate phosphatase， PAP）和二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase， DGAT）連續(xù)催化合成TAG［3］；其二， 不依賴脂酰-CoA的合成途徑（即PDAT途徑），以磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（phospholipids∶diacylglycerol acyltransferase， PDAT）催 化二酰 甘 油（diacylglycerol， DAG）與磷脂（phospholipids， PC）反應(yīng)合成TAG與溶血磷脂（lyso-phospholipids， LPC）。兩條途徑對(duì)植物種子油脂累積具有重要的生理作用， 直接影響TAG合成的關(guān)鍵酶分別是DGAT與PDAT。PDAT途徑最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母［4］， 并證實(shí)PDAT對(duì)于酵母TAG合成的貢獻(xiàn)。以酵母PDAT為探針在擬南芥中獲得2個(gè)PDAT基因At5g13460 （AtPDAT1）和At3g44830 （AtPDAT2）， 對(duì)AtPDAT1的功能研究顯示了其PDAT酶活性， 能催化不同鏈長(zhǎng)的酰基轉(zhuǎn)移， 尤其是對(duì)多雙鍵、環(huán)氧化以及羥化酰基具有偏好性，顯示了PDAT在擬南芥TAG合成中的重要作用［5］。PDAT途徑在甘藍(lán)型油菜TAG合成中的貢獻(xiàn)尚未得到充分研究， 克隆甘藍(lán)型油菜PDAT基因并進(jìn)行功能解析， 將促進(jìn)油菜TAG合成路徑的完善以及高含油油菜育種的進(jìn)程。本文通過(guò)擬南芥AtPDAT1基因序列設(shè)計(jì)引物， 從甘藍(lán)型油菜品種湘油15號(hào)中克隆獲得3個(gè)PDAT拷貝， 并對(duì)其BnPDAT1進(jìn)行酵母互補(bǔ)功能驗(yàn)證， 證實(shí)BnPDAT1參與TAG合成， 具備PDAT功能活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜雙低品種湘油15號(hào)由國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。用于異源表達(dá)分析的野生酵母INVSc1及用于PDAT1基因功能鑒定的三酰甘油（TAG）合成缺陷酵母菌株H1246由徐榮華博士（中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園）惠贈(zèng)。

1.2 RNA提取與cDNA合成

在22℃、光周期為16 h/8 h條件下培養(yǎng)湘油15號(hào)至2片真葉， 取幼苗50～100 mg。加液氮充分研磨后， 使用TRIzol RNA提取試劑盒（TransGen生物技術(shù)有限公司）按其說(shuō)明書方法提取總 RNA， 以此RNA為模板合成第 1鏈 cDNA， 參見 Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（TransGen生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書合成cDNA。

1.3 BnPDAT1基因的克隆及序列分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//www.arabidopsis.org/）獲取AtPDAT1基因序列。使用Bioinformatics at Geboc數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//www.bioyq.com/blast/blast.php） “Regular Blast”進(jìn)行檢索， 獲得白菜（AA）和甘藍(lán)（CC）的PDAT1基因序列以及甘藍(lán)型油菜已知的EST序列。用Vector軟件拼接獲得油菜EST序列， 并與白菜和甘藍(lán)PDAT1基因序列比對(duì)。分析比對(duì)結(jié)果， 在5'端選取一致性較好的區(qū)域， 設(shè)計(jì)含起始密碼子的 5'端引物， 同法設(shè)計(jì)一段含有終止密碼子的 3'端引物，合成備用。設(shè)計(jì)的引物序列為 BnPDAT1-F∶5'-ATGCCCCTTTTTCAGCGGAAAAAGC-3'； BnPD AT1-R∶ 5'-TCACAGCTTCAAGTCAATACGCTCA-3'。以1.2所述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系含50 ng μL-1模板1 μL、10 mmol L-1dNTPs 0.5 μL、2 μmol L-1BnPDAT1-F 0.75 μL、2 μmol L-1BnPDAT1-R 0.75 μL、10×反應(yīng)緩沖液1 μL、HiFi高保真DNA聚合酶0.5 μL和ddH2O 15.5 μL。程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 5 min， 95℃ 50 s， 58℃ 45 s， 72℃ 3 min， 35個(gè)循環(huán)， 72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳， 用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）檢測(cè)和記錄結(jié)果。將 PCR產(chǎn)物回收后與 pMD18-T載體（TransGen生物技術(shù)有限公司）連接， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 （北京天根生化有限公司）， 篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序。通過(guò) BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//brassicadb.org/brad/）對(duì)獲得的克隆序列進(jìn)行染色體步移分析。使用 DNAman對(duì)克隆獲得的PDAT1基因全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 BnPDAT1蛋白生物信息學(xué)分析

1.4.1 BnPDAT1氨基酸序列特征與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)ANTHEPROT 6.2軟件分析來(lái)源于甘藍(lán)型油菜的PDAT1拷貝所編碼的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計(jì)編碼蛋白的氨基酸殘基組分、分析編碼蛋白的等電點(diǎn)、信號(hào)肽序列和親疏水特征并使用 Gariner模型預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用PSORT （http∶//psort.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4.2 BnPDAT1蛋白同源結(jié)構(gòu)域分析 使用DNAman對(duì)BnPDAT1蛋白進(jìn)行同源比對(duì)分析； 同時(shí)使用NCBI在線軟件（http∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）分別對(duì)不同的 BnPDAT1蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析； 使用SMART （http∶//smart.embl-heidelberg.de/）及InterPro （http∶//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析 BnPDAT1包含的特殊結(jié)構(gòu)域。

1.4.3 PDAT1蛋白聚類分析 通過(guò)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）、String數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//string.embl.de/）、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//www.pdb.org/pdb/home/home.do）檢索來(lái)源于不同物種的PDAT1相關(guān)蛋白序列， 并使用 MEGA5.0對(duì)來(lái)源不同的PDAT1相關(guān)蛋白進(jìn)行聚類分析。

1.5 BnPDAT1基因的酵母互補(bǔ)功能驗(yàn)證

1.5.1 酵母表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與酵母培養(yǎng) 將獲得的 BnPDAT1基因與 HA標(biāo)簽基序融合連接PYES2.0載體， 用氯化鋰法轉(zhuǎn)化到酵母菌株 H1246［酵母突變體H1246中編碼TAG合成的DGA1 （編碼DGAT）和LRO1 （編碼PDAT）以及編碼固醇脂合成的基因ARE1和ARE2都被敲除了， 因此H1246不能合成中性油脂， 且 H1246不能形成油體］［6］， 同時(shí)將對(duì)照質(zhì)粒（未連接 BnPDAT1基因的 PYES2.0載體）轉(zhuǎn)化入酵母菌株H1246和INVSc1。

參考徐榮華等［7］的方法培養(yǎng)酵母， 將轉(zhuǎn) BnPDAT1基因的酵母（H1246）及轉(zhuǎn)對(duì)照質(zhì)粒的酵母（H1246與INVSc1）在尿嘧啶缺陷的合成完全培養(yǎng)基（synthetic minimal defi ned medium lacking uracil， SC-U）抑制培養(yǎng)基（2%葡萄糖）中220轉(zhuǎn)min-1、30℃過(guò)夜培養(yǎng)， 以紫外分光光度計(jì)測(cè) OD600后， 離心收集菌體， 用SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基（2%半乳糖）重懸菌體至OD600=0.4，在220轉(zhuǎn)min-1、30℃條件下培養(yǎng)， 誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)36 h，收集備用。

1.5.2 BnPDAT1基因在酵母中的表達(dá)分析 使用TRIzol RNA提取試劑盒（TransGen生物技術(shù)有限公司）分別提取轉(zhuǎn)BnPDAT1基因酵母（H1246）及轉(zhuǎn)對(duì)照質(zhì)粒酵母的總RNA， DNaseI消化后以1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 分別根據(jù)克隆到的BnPDAT1基因設(shè)計(jì)特異性引物， 以RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

1.5.3 轉(zhuǎn)BnPDAT1基因酵母的蛋白印跡分析

參考 Isola等［8］的方法提取轉(zhuǎn) BnPDAT1基因和空載體的酵母總蛋白， 用于蛋白印跡分析。參照魯少平等［9］的方法進(jìn)行Western blot。一抗使用HA標(biāo)簽抗體， 從山羊中提取獲得， 二抗使用小鼠抗山羊抗體， ECL發(fā)光檢測(cè)。

1.5.4 轉(zhuǎn) BnPDAT1基因酵母的油脂薄層層析（thinlayer chromatography， TLC） 使用液氮反復(fù)凍融并研磨破碎酵母細(xì)胞， 使用正己烷∶異丙醇（3∶2）法［10］提取酵母油脂進(jìn)行TLC分析， 分析不同酵母菌株中三酰甘油（TAG）、游離脂肪酸（FFA）和二酰甘油（DAG）的合成。

1.6 甘藍(lán)型油菜中BnPDAT1基因時(shí)空表達(dá)分析

以1.2方法提取甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)不同時(shí)期的種子、根、葉、花和角果皮總RNA， 按照寶生物的 PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real-time）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 獲得cDNA第1鏈作為qRT-PCR模板。仔細(xì)分析1.3中克隆獲得的BnPDAT1片段， 從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得其上下游非翻譯區(qū)（untranslated region， UTR）， 根據(jù)BnPDAT1各拷貝 UTR特點(diǎn)設(shè)計(jì)分型引物， 以UBC21作為內(nèi)參基因［11］， 用于 BnPDAT1的時(shí)空表達(dá)分析， 每樣品進(jìn)行3次重復(fù)。在ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)上運(yùn)行qRT-PCR。PCR體系包含1 μL cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green-Master with ROX、10 μmol L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序?yàn)?5℃ 10 min； 95 ℃ 15 s， 60℃ 15 s， 72℃ 32 s， 35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后繪制95℃ 20 s， 60℃ 20 s， 95℃ 20 s， 59℃ 20 s熔解曲線， 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性和引物二聚體。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnPDAT1基因全長(zhǎng)CDS序列的克隆

以湘油15號(hào)cDNA為模板， 克隆到3個(gè)CDS序列， 長(zhǎng)度分別為1998、2002和2005 bp， 分別定位于A02、A10和C09染色體， 分別命名為BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDATI-C09。通過(guò)BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)， 確認(rèn) 3個(gè) CDS序列的完整性， 并以 3 條CDS的共同序列作為模板對(duì)BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索， 未發(fā)現(xiàn)更多PDAT1同源序列。通過(guò)DNAman多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDATI-C09相似度為 95.29%， 顯示了所克隆的PDAT1拷貝在進(jìn)化上的高度同源性， 也體現(xiàn)了甘藍(lán)型油菜基因組異源多倍性的特點(diǎn)。

2.2 BnPDAT1生物信息學(xué)分析

BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDATI-C09基因各自編碼長(zhǎng)度 665、666、667氨基酸殘基的蛋白， 分別命名為 BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDATI-C09。這3個(gè)預(yù)測(cè)的BnPDAT1蛋白的氨基酸組成、摩爾質(zhì)量、比體積和等電點(diǎn)見表1。

親疏水性分析顯示， BnPDAT1蛋白疏水區(qū)域分布比較均衡， 疏水性氨基酸多于親水性氨基酸， 且N端有明顯的親水區(qū)域。未發(fā)現(xiàn)BnPDAT1具信號(hào)肽序列， 暗示其不存在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)， 其合成與功能定位處于相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域。PSORT亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示， BnPDAT1被定位于質(zhì)膜的可信度為0.790， 顯示BnPDAT1是一種膜錨定蛋白。

BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和 BnPDAT1-C09的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖 1， BnPDAT1-A02具44% α螺旋， 30% β折疊， 13% β轉(zhuǎn)角， 13%無(wú)規(guī)卷曲；BnPDAT1-A10 相應(yīng)的比例為 33%、21%、24%和22%； BnPDAT1-C09相應(yīng)的比例為33%、21%、24% 和22%。

通過(guò)SMART分析發(fā)現(xiàn)， BnPDAT1蛋白在結(jié)構(gòu)上都具有相似序列特征和相近排布位置的一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域（LCC）和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）， 如表2所示。

表1 BnPDAT1蛋白信息匯總表Table 1 Summary of the deduced BnPDAT1 proteins

圖1 BnPDAT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Secondary structure of BnPDAT1

表2 BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09蛋白特殊結(jié)構(gòu)匯總表Table 2 Summary of specific region of BnPDAT1-A02， BnPDAT1-A10， and BnPDAT1-C09

同源比對(duì)（圖2）發(fā)現(xiàn)， BnPDAT1蛋白存在4段保守的α/β水解酶折疊區(qū)（α/β HF）。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)， BnPDAT1蛋白在100 （N末端）～300 （C末端）區(qū)間內(nèi)符合PLN02733超家族特征； 全長(zhǎng)序列基本符合 PLN02517超家族特征， PLN02733與 PLN02517均為磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶超家族， 因此預(yù)測(cè)， BnPDAT1具有?；D(zhuǎn)移功能， 這與報(bào)道的PDAT1蛋白功能一致。

通過(guò)不同數(shù)據(jù)庫(kù)， 共獲得30種來(lái)源于不同植物的PDAT1相關(guān)蛋白序列， 聚類分析結(jié)果如圖3。

圖2 BnPDAT1氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of the amino acid sequences of BnPDAT1

圖3 不同植物PDAT1蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PDAT1 in different plant species

PDAT1相關(guān)蛋白聚類上分為單、雙子葉PDAT1以及單、雙子葉PDAT1類似蛋白4大類， PDAT1蛋白在單雙子葉植物之間有較遠(yuǎn)的遺傳距離。BnPDAT1與甘藍(lán)、擬南芥、亞麻芥 PDAT1蛋白具有較高的同源性。PDAT1及相關(guān)蛋白在進(jìn)化樹中的位置與相對(duì)應(yīng)的物種進(jìn)化上的位置比較一致， 顯示PDAT1蛋白在起源上可能比較古老。

2.3 BnPDAT1基因的酵母互補(bǔ)功能驗(yàn)證

2.3.1 BnPDAT1基因在酵母中正常表達(dá) RT-PCR分析結(jié)果（圖 4）顯示在轉(zhuǎn)基因酵母（H1246）中，BnPDAT1基因正常編碼了mRNA， 而對(duì)照組酵母菌株（轉(zhuǎn)空載體的H1246和INVSc1）中無(wú)BnPDAT1基因編碼的mRNA表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)基因酵母菌株的RT-PCR檢測(cè)Fig.4 RT-PCR analysis of transgenic yeast

2.3.2 轉(zhuǎn)BnPDAT1基因酵母合成BnPDAT1蛋白

蛋白印跡（Western blot）結(jié)果（圖 5）顯示， 轉(zhuǎn)BnPDAT1基因的酵母中均有 BnPDAT1蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)空載體的酵母中未發(fā)現(xiàn)BnPDAT1蛋白。

2.3.3 BnPDAT1基因恢復(fù)酵母突變體（H1246）油脂合成能力 轉(zhuǎn)BnPDAT1基因酵母總油脂TLC分析（圖6）發(fā)現(xiàn)， BnPDAT1基因恢復(fù)酵母H1246的TAG合成能力， 顯示BnPDAT1基因在油脂合成中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)空載體的H1246菌株相對(duì)其他菌株有高得多的DAG含量， 轉(zhuǎn)入BnPDAT1之后DAG含量明顯降低， TAG含量明顯上升， 顯示BnPDAT1能催化DAG合成TAG。

圖5 轉(zhuǎn)基因酵母菌株中BnPDAT1蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of BnPDAT1 in transgenic yeast

圖6 轉(zhuǎn)基因酵母的油脂TLC層析Fig.6 TLC analysis of lipid in complementation quadruple mutant strain H1246

2.4 甘藍(lán)型油菜中BnPDAT1時(shí)空表達(dá)特征

為進(jìn)一步了解 BnPDAT1在甘藍(lán)型油菜中的功能， 對(duì)甘藍(lán)型油菜不同時(shí)期、不同組織中 BnPDAT1表達(dá)進(jìn)行了分析， BnPDAT1的分型定量引物為∶BnPDAT1-A02-F∶ 5'-TGAATGGTCTGAGCGTATT-3'；BnPDAT1-A02-R∶ 5'-CCATGATGATGATCTCTCTTG-3'； BnPDAT1-A10-F∶ 5'-GAATGGTCAGAGCGTATT G-3'； BnPDAT1-A10-R∶ 5'-TGATGATGATGATGATG AGC-3'； BnPDAT1-C09-F∶ 5'-GAATGGTCAGAGCG TATTG-3'； BnPDAT1-C09-R∶ 5'-CGTGGAAGCAATA AGTTCA-3'； 內(nèi)參引物為BnUBC21-F∶ 5'-CCTCTGC AGCCTCC TCAAGT-3'； BnUBC21-R∶ 5'-TATCTCCC CTGTCTTGAAATGC-3'。處于種子不同發(fā)育時(shí)期的湘油15號(hào)不同器官組織中BnPDAT1 3個(gè)拷貝表達(dá)狀況如圖7所示。

圖7 種子不同發(fā)育時(shí)期種子、葉和花中BnPDAT1的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative quantity of BnPDAT1 expression in seeds， leaf，and flower

湘油15號(hào)種子中BnPDAT1的表達(dá)量隨種子發(fā)育表現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)， 在授粉后25～30 d表達(dá)量達(dá)到最大值； 但BnPDAT1各拷貝的表達(dá)變化規(guī)律有一定差異， 在授粉25 d后的種子中BnPDAT1-A10和授粉30 d后種子中的BnPDAT1-A02幾乎不表達(dá)， 同時(shí)與之對(duì)應(yīng)的另外2個(gè)拷貝高表達(dá)， 這暗示BnPDAT1的表達(dá)可能具有整體調(diào)控的特點(diǎn)， 需要進(jìn)一步對(duì)不同品種（系）的油菜中BnPDAT1表達(dá)特征進(jìn)行分析驗(yàn)證。2個(gè)拷貝表達(dá)特點(diǎn)在多個(gè)不同含油量材料中同樣存在（未發(fā)表）。湘油15號(hào)花、葉片、種子中均有BnPDAT1表達(dá)， 但葉片中BnPDAT1-A10表達(dá)量極低。BnPDAT1蛋白催化PC與DAG合成TAG， 在油菜發(fā)育過(guò)程中， 尤其是種子發(fā)育與油脂儲(chǔ)存的過(guò)程中發(fā)揮重要功能， BnPDAT1在種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)， 與種子發(fā)育過(guò)程中TAG積累模式相吻合， 種子發(fā)育中期快速合成和積累TAG， 在種子發(fā)育后期TAG存儲(chǔ)漸漸飽和， TAG合成量下調(diào)。BnPDAT1在花、葉中表達(dá)水平低于種子油脂合成期，與種子發(fā)育初期表達(dá)水平相當(dāng)， 也顯示了BnPDAT1是一種TAG合成的關(guān)鍵酶， 在花、葉中存在的大量非TAG合成的脂質(zhì)代謝活動(dòng)并不能觸發(fā)BnPDAT1的大量表達(dá)。

3 討論

從甘藍(lán)型油菜中克隆獲得3個(gè)BnPDAT1基因拷貝， 各自編碼的BnPDAT1蛋白的生物信息學(xué)分析顯示其具有PDAT功能結(jié)構(gòu)域， 與甘藍(lán)BrPDAT1蛋白和擬南芥AtPDAT1蛋白均具有較高同源性。通過(guò)酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)BnPDAT1基因參與TAG合成過(guò)程，能夠恢復(fù)中性油脂合成缺陷型酵母的TAG合成與油體形成， 說(shuō)明所克隆的BnPDAT1基因具有TAG合成功能。

對(duì) PDAT及其相似蛋白的聚類分析顯示了PDAT蛋白在進(jìn)化上較高的保守性， 3個(gè)BnPDAT1拷貝分別與2個(gè)不同的甘藍(lán)BrPDAT1拷貝具有高度同源性， BnPDAT1-A10與BnPDAT1-C09處在進(jìn)化樹同一低階分支位置， BnPDAT1-A02則處在進(jìn)化樹更高一節(jié)點(diǎn)的同一分支位置， 這顯示了甘藍(lán)型油菜A、C亞基因組在進(jìn)化關(guān)系上仍然具有較高的同源性， 也間接證實(shí)“禹氏三角”中白菜與甘藍(lán)的近緣關(guān)系［12］。預(yù)測(cè) BnPDAT1蛋白被定位于細(xì)胞質(zhì)膜， 這與PDAT1催化PC和DAG反應(yīng)生產(chǎn)TAG的過(guò)程發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［13］相吻合， 表明油菜中 BnPDAT1蛋白合成和修飾過(guò)程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 隨后錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜發(fā)揮功能。

本文通過(guò)酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)， 驗(yàn)證了BnPDAT1能發(fā)揮TAG合成酶功能， 恢復(fù)缺陷型酵母的TAG合成能力， 這與酵母內(nèi)源PDAT蛋白在TAG合成中的作用一致， PDAT途徑被認(rèn)為是酵母TAG合成的輔助途徑［14］， 而單獨(dú)轉(zhuǎn)入 BnPDAT1即可恢復(fù)缺陷酵母TAG合成表型， 顯示了 BnPDAT1蛋白能獨(dú)立合成TAG， 也暗示了 BnPDAT1可能在逆境狀態(tài)下合成TAG過(guò)程中發(fā)揮重要功能。

對(duì)植物PDAT蛋白研究顯示了其高度的底物偏好性， PDAT對(duì)環(huán)烷化、羥化以及含多雙鍵底物具有高效催化作用［15］。同樣 BnPDAT1蛋白的合成與表達(dá)可能存在明顯的組織特異性， 催化TAG合成中的作用可能因底物類型、豐度和合成部位差異而明顯不同， BnPDAT1對(duì)TAG甘油骨架中sn-2、sn-3位置的脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)和類型的影響尚待進(jìn)一步研究， 這對(duì)于油菜品質(zhì)育種將是一個(gè)新的方向。

TAG合成是影響甘藍(lán)型油菜產(chǎn)量和菜籽油質(zhì)量的最關(guān)鍵因素， 研究甘藍(lán)型油菜TAG合成、積累規(guī)律， 對(duì)于指導(dǎo)油菜育種與生產(chǎn)具有重要意義。而BnPDAT1被證實(shí)可參與 TAG合成， 可能在油菜TAG合成網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位， 對(duì)BnPDAT1基因的深入研究具有重大的科研和社會(huì)價(jià)值。本文克隆獲得的BnPDAT1有3個(gè)拷貝， 分別定位在A02、A10、C09染色體上， 進(jìn)化上分別來(lái)源于白菜和甘藍(lán)， 序列相似性超過(guò)95%， 這顯示PDAT基因起源較早且保守， 在原始的蕓苔屬植物中即已存在且具有重要功能。但具有不同含油量水平的油菜中 BnPDAT1基因的拷貝狀態(tài)尚需研究， 以進(jìn)一步證實(shí) PDAT途徑在油菜TAG合成中的作用。同樣湘油15號(hào)中克隆所得BnPDAT1的3個(gè)拷貝在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控模式和各自對(duì)TAG合成量的貢獻(xiàn)尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)cDNA中克隆到3個(gè)PDAT1全長(zhǎng)編碼序列（coding sequence， CDS）， 被分別定位于 A02、A10、C09染色體， 并命名為BnPDAT1-A02、BnPDAT1-A10和BnPDAT1-C09， 其序列長(zhǎng)分別為1998、2002、2005 bp， 各自編碼665、666和 667個(gè)氨基酸殘基。該基因編碼蛋白與其他植物 PDAT1具有較高相似度， 具有典型的 PDAT1結(jié)構(gòu)域， 具有PDAT1酶活性。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00658

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 官春云， E-mail∶ guancy2011@aliyun.com

收稿日期Received（）∶ 2015-11-13； Accepted（接受日期）∶ 2016-03-02； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-11.

Cloning and Characterization of Phospholipids：Diacylglycerol Acyltransferase （BnPDAT1） cDNA from Brassica napus L.

TAN Tai-Long， FENG Tao， LUO Hai-Yan， PENG Ye， LIU Rui-Yang， and GUAN Chun-Yun
College of Agronomy， Hunan Agricultural University/National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan， Changsha 410128， China

Abstract：Phospholipids∶diacylglycerol acyltransferase （PDAT1） is a key enzyme in triacylglycerol （TAG） biosynthesis of plants.In this study， three novel PDAT1 coding sequences （CDSs） were isolated from cDNA of Brassica napus L.cv.Xiangyou 15 seeds，which were mapped to the chromosomes A02， A10， and C09， and designated as BnPDAT1-A02， BnPDAT1-A10， and BnPDAT1-C09， respectively.Three BnPDAT1 CDSs were 1998， 2002， and 2005 bp in length and encoded predicted proteins with 665， 666， and 667 amino acid residues， respectively.BnPDAT1 proteins were predicted to be located on the cell membrane and have a typical PDAT1 conserved domain.Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of BnPDAT1 were highly homologous to previously reported PDAT1 in Brassica oleracea， Arabidopsis thalian，and Eruca sativa.Furthermore， the catalytic enzyme activity of the cloned BnPDAT1 genes was confirmed by the yeast complementary experiment.The expression level of BnPDAT1s increased gradually in seed development and reached the maximum from 25 to 30 days after flowering.However， three BnPDAT1 copies were also found to be different in expression pattern.

Keywords：Brassica napus L； PDAT1； Gene clone； Yeast complementary experiment