司冠儒，張溫清，，梅　婕，葉　明，汪家勝，周　萍（.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司，江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城4000；.合肥工業(yè)大學(xué)，生物和食品工程學(xué)院，安徽合肥30000）

?

宣酒小窖芝麻香型白酒蒸餾過(guò)程中四甲基吡嗪的研究

司冠儒1，張溫清1，2，梅婕1，葉明2，汪家勝1，周萍1
（1.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司，江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城242000；2.合肥工業(yè)大學(xué)，生物和食品工程學(xué)院，安徽合肥230000）

摘要：建立了一種快速簡(jiǎn)便定量白酒中四甲基吡嗪（TMP）的高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，并對(duì)宣酒小窖芝麻香型白酒蒸餾過(guò)程中不同層次餾分酒TMP含量的變化規(guī)律進(jìn)行了分析研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法相關(guān)系數(shù)R2為0.9983，檢測(cè)限為0.25 μg/L，定量限為0.85 μg/L，在不同樣品中的回收率為92%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.51%～3.26%，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，滿足白酒中TMP的檢測(cè)要求。宣酒小窖芝麻香型白酒不同層次糟醅餾分酒中TMP變化規(guī)律明顯，丟糟中含量最高，中糟中最低；各餾分酒中TMP含量隨蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)呈不斷上升的趨勢(shì)?？焖俜治鲋ヂ橄阈桶拙普麴s過(guò)程中TMP含量的變化規(guī)律，為量質(zhì)摘酒、提高酒質(zhì)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：宣酒；四甲基吡嗪；芝麻香；蒸餾；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1215.006.html。

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），又名川芎嗪，是一種常見的烷基吡嗪類化合物，廣泛存在于食品原料、加工食品和酒精飲料中，具有堅(jiān)果、焙烤和烘烤的香氣［1-2］。在中國(guó)傳統(tǒng)白酒中亦檢測(cè)到一定量的TMP，TMP具有較低的風(fēng)味閾值，因此被認(rèn)為對(duì)中國(guó)醬香型和芝麻香型白酒的風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)。TMP作為中藥材川芎（Ligusticum wallichii）根莖的主要活性生物堿成分，已被大量研究證明具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板集聚、保肝護(hù)肝等臨床藥理作用［3-6］，這賦予了中國(guó)白酒有益健康的功能。

色譜是一種快速、高效的分離技術(shù)，但不能對(duì)分離出的每個(gè)組分進(jìn)行鑒定；質(zhì)譜是一種重要的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析的方法，是一種高靈敏度、高效的定性分析工具，但沒(méi)有分離能力，不能直接分析混合物。將兩者結(jié)合起來(lái)，把質(zhì)譜儀作為色譜儀的檢測(cè)器將能發(fā)揮兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有色譜的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是分析化學(xué)發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的分析方法之一。直接進(jìn)樣法是樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單處理或者不處理而直接分析的一種方法。該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)率好、穩(wěn)定性高。本研究基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與直接進(jìn)樣法，在前期以氣相色譜與液相色譜分析研究四甲基吡嗪的基礎(chǔ)上［7-8］，將HPLC-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于白酒中四甲基吡嗪的檢測(cè)，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同層次糟醅蒸餾過(guò)程中TMP的規(guī)律進(jìn)行研究，以期指導(dǎo)生產(chǎn)富含健康因子四甲基吡嗪的白酒工藝的研發(fā)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

酒樣：白酒樣品為本公司所產(chǎn)原酒。

儀器設(shè)備：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS 1260-6460）、色譜柱（ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution 4.6 x 100 mm 3.5-Micron），美國(guó)安捷倫公司；超純水儀（A2S-10-CE），美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司。

試劑及耗材：四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（TMP），美國(guó)西格瑪-奧德里奇公司；甲酸（色譜純）、乙醇（色譜純）、乙腈（色譜純）上海安譜科學(xué)儀器有限公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室超純水儀制備。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1取樣方法的確定及樣品前處理

將不同發(fā)酵層次糟醅及其餾分酒進(jìn)行取樣，每2min 取1個(gè)樣備用。白酒樣品過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，取過(guò)濾后樣品約1mL于液相樣品瓶中，供HPLC-MS/MS分析用。

小窖池中糟醅層次從上到下依次為丟糟、面糟、中糟、底糟，其中，面糟蒸餾后攤晾拌曲為下一輪丟糟。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)物0.1 g（精確到0.001 g）于100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成濃度為1000 mg/L的四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取1mL四甲基吡嗪儲(chǔ)備液至100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成濃度為10 mg/L的四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、8.0mL四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)使用液于10mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成濃度分別為0、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L的四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照1.2.1方法進(jìn)行前處理，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

1.2.4 HPLC-MS/MS方法

HPLC條件：流動(dòng)相，乙腈∶0.1%甲酸=35∶65；流速0.4mL/min；柱溫35℃。

MS/MS條件：干燥氣流速11 L/min；干燥氣溫度350℃；霧化器壓力50 psi；質(zhì)譜模式MRM（多反應(yīng)檢測(cè)），具體參數(shù)見表1。

2結(jié)果與討論

2.1分析條件的確定

本實(shí)驗(yàn)室前期已開發(fā)了一種檢測(cè)四甲基吡嗪的液相色譜方法［8］，本實(shí)驗(yàn)HPLC條件部分參考了該方法，基于ESI+對(duì)流動(dòng)相的要求，在水相中加入0.1%甲酸，以利于四甲基吡嗪的離子化，最終確定流動(dòng)相組成為乙腈∶0.1%甲酸=35∶65，四甲基吡嗪的響應(yīng)值與分離度均較好，同時(shí)保留時(shí)間也較短；MS/MS方法參數(shù)部分，裂解電壓（Fragmentor Voltage）主要影響毛細(xì)管末端進(jìn)入MS1的母離子的豐度，碰撞能（Collision Energy）主要影響碰撞池中產(chǎn)生的子離子的豐度，本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)2個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定的MRM參數(shù)見表1。該分析條件下，四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖見圖1。

表1 MRM檢測(cè)參數(shù)表

圖1四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和MRM質(zhì)譜圖

2.2方法的精確性和精密度

表2為采用本方法定量白酒中TMP的線性、檢出限和定量限。由表2可知，該方法有較寬的TMP檢測(cè)線性范圍，在0.25～8.0 mg/L之間線性關(guān)系較好，線性相關(guān)性系數(shù)R2為0.9983。以3倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算該方法的檢出限，以10倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其定量限。結(jié)果表明，檢出限和定量限分別為0.25 μg/L和0.85 μg/L。

在不同種類的白酒樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率，并通過(guò)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，該方法檢測(cè)不同種類白酒中TMP的回收率在92%～104%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.51%～3.26%之間，可見該方法對(duì)于TMP的檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性和精確性，能夠滿足白酒中TMP的分析檢測(cè)要求。

表2 TMP定量方法的線性、檢測(cè)限和定量限

表3 TMP定量方法的精密度（n=6）和回收率

2.3芝麻香白酒TMP在蒸餾過(guò)程中的含量變化

在上述建立的TMP檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)本廠所產(chǎn)芝麻香型白酒不同層次糟醅及其餾分酒按1.2.1方法進(jìn)行取樣、分析，所得結(jié)果見圖2。由圖2可知，各層次糟醅餾分酒中TMP的含量從2min以后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，而0min時(shí)的含量略高于2min。出現(xiàn)這種情況的原因是0min所餾出的酒含有上一甑的殘留，而整個(gè)餾酒過(guò)程，后段TMP的濃度遠(yuǎn)大于前段的濃度，所以0min濃度略高于2min濃度。四甲基吡嗪含量隨蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，這一趨勢(shì)與吳建鋒研究芝麻香蒸餾過(guò)程中吡嗪的變化規(guī)律是一致的，但吳的研究并未對(duì)不同層次糟醅中四甲基吡嗪的含量進(jìn)行分析研究［9］。依據(jù)高傳強(qiáng)與譚光迅的研究結(jié)果［10-11］，白酒中的四甲基吡嗪在蒸餾和儲(chǔ)藏階段的產(chǎn)生途徑主要為美拉德反應(yīng)，在蒸餾階段后期，由于美拉德反應(yīng)作用時(shí)間比前段時(shí)間長(zhǎng)，所以四甲基吡嗪的含量隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。

圖2芝麻香型白酒蒸餾過(guò)程中TMP含量的變化

各層次糟醅餾分酒之間，四甲基吡嗪含量以丟糟中最高，面糟其次，中糟最低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［9，12］，TMP在發(fā)酵階段的產(chǎn)生途徑主要是美拉德反應(yīng)和細(xì)菌代謝，從面糟到底糟中氧氣含量逐漸減少，所以面糟中微生物有氧代謝最旺盛，產(chǎn)熱最強(qiáng)，從而溫度最高，更有利于美拉德反應(yīng)；同時(shí)高溫也更有利于細(xì)菌利用乙偶姻產(chǎn)生四甲基吡嗪，所以面糟中TMP含量最高；底糟與窖泥接觸最充分，細(xì)菌代謝較為旺盛，所以底糟中含量略高于中糟；而丟糟中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量低于面糟，微生物種群數(shù)量受到一定的限制，但丟糟經(jīng)2輪次的發(fā)酵，可能其中四甲基吡嗪的前體物質(zhì)積累較多，所以丟糟中含量略高于面糟，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

基于HPLC-MS/MS技術(shù)，本研究建立了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)白酒中四甲基吡嗪的方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精確性均較好，能夠滿足白酒廠對(duì)四甲基吡嗪的日常檢測(cè)要求。并對(duì)芝麻香型白酒不同發(fā)酵層次糟醅蒸餾過(guò)程中TMP的含量進(jìn)行分析研究，其在整個(gè)蒸餾過(guò)程和不同層次糟醅的分布規(guī)律明顯，TMP隨著蒸餾時(shí)間的延長(zhǎng)含量逐漸增高，且在窖池中隨著層次糟醅的深入，含量依次變化，呈“面糟＞底糟＞中糟”趨勢(shì)。為指導(dǎo)研究小窖芝麻香釀造工藝特點(diǎn)、皖南特有釀造功能微生物及豐富宣酒酒體中TMP的工藝改進(jìn)，提供了一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Masuda H，Mihara S.Olfactive properties of alkylpyrazines and 3-substituted 2-alkylpyrazines［J］.Journal of Agricultural & Food Chemistry，2002，36（3）：584-587.

［2］Fan W L，Xu Y，Zhang Y H.Characterization of pyrazines in some Chinese liquors and their approximate concentrations［J］.Journal of Agricultural & Food Chemistry，2007，55（24）：9956-9962.

［3］Jones J H，Bicking J B，Cragoe E J.Pyrazine diuretics.IV.N-amidino-3-amino-6-substituted pyrazinecarboxamides［J］.J Med Chem，1967（5）：899-903.

［4］Kim S G，Kedderis G L，Batra R，et al.Induction of rat liver microsomal epoxide hydrolase by thiazole and pyrazine：hydrolysis of 2-cyanoethylene oxide［J］.Carcinogenesis，1993，14（8）：1665-1670.

［5］Lian X，Song W，Xu G，et al.The application with tetramethyl pyrazine for antithrombogenicity improvement on silk fibroin surface［J］.Applied Surface Science，2008，255（2）：480-482.

［6］Nie S Q，Kwan C Y，Epand R M.Pyrazine derivatives affect membrane fluidity of vascular smooth muscle microsomes in relation to their biological activity［J］.European Journal of Pharmacology，1993，244（1）：15-19.

［7］張溫清，王永軍，饒志明，等.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪類健康功能因子的分析研究［J］.釀酒科技，2014（8）：37-39.

［8］司冠儒，張溫清，張顯，等.HPLC快速檢測(cè)芝麻香型白酒中四甲基吡嗪［J］.釀酒，2014，41（5）：89-91.

［9］吳建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代謝機(jī)理研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)，2013.

［10］高傳強(qiáng).美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)芝麻香典型風(fēng)格形成的影響［J］.釀酒科技，2010（1）：53-56.

［11］譚光迅，韓興林，李建飛，等.蒸餾過(guò)程中的美拉德反應(yīng)［J］.釀酒科技，2010（11）：61-64.

［12］徐巖，吳群，范文來(lái)，等.中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的微生物產(chǎn)生途徑的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)［J］.釀酒科技，2011（7）：37-40.

Rapid Detection of Tetramethylpyrazine in Small-Pit Zhimaxiang Baijiu During the Distillation

SI Guanru1，ZHANG Wenqing1，2，MEI Jie1，YE Ming2，WANG Jiasheng1and ZHOU Ping1
（1.Jiangnan Istitute of Small Pit Brewing Technology，Xuanjiu Group Co.Ltd.，Xuancheng，Anhui 242000；2.College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230000，China）

Abstract:A rapid detection method of tetramethylpyrazine（TMP）in Baijiu by HPLC-MS/MS had been developed，which was used to detect TMP content in different distillate during the distillation of Zhimaxiang Baijiu.The experimental results showed that such method had good linear relationships（R2=0.9983 and detection limit=0.25 μg/L）with its quantitative limit as 0.85 μg/L.The relative standard deviation was between 0.51%-3.26%and the recovery was within 92%-104%.The method was simple，rapid，sensitive and precise.It was suitable for the detection of TMP in Baijiu.There was significant difference in TMP content in different distillate during the distillation of Zhimaxiang Baijiu （TMP content the highest in waste fermented grains and the lowest in medium fermented grains）.Besides，TMP content increased with distillation time.The analytic results provided theoretical evidence for improving liquor quality and liquor-receiving according to quality.

Key words:Xuanjiu；tetramethylpyrazine；Zhimaxiang Baijiu；distillation；Baijiu

中圖分類號(hào)：TS262.3；TS261.4；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）06-0075-03

DOI：10.13746/j.njkj.2016026

收稿日期：2016-01-20

作者簡(jiǎn)介：司冠儒，男，碩士，工程師，研究方向：釀酒微生物及白酒風(fēng)味物質(zhì)研究；張溫清，男，博士在讀，工程師。

通訊作者：周萍，女，工程師，高級(jí)檢驗(yàn)師，省白酒評(píng)委，安徽宣酒集團(tuán)食品安全總監(jiān)；葉明，男，教授，博導(dǎo)，合肥工業(yè)大學(xué)生物工程系主任。