王曉昌，李京寧，張惠玲，劉　亞，付麗霞（.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品系，寧夏銀川750000；.寧夏食品檢測(cè)中心，寧夏銀川750000）

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優(yōu)良非釀酒酵母的分離與發(fā)酵性能研究

王曉昌1，李京寧2，張惠玲1，劉亞1，付麗霞1
（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品系，寧夏銀川750000；2.寧夏食品檢測(cè)中心，寧夏銀川750000）

摘要：非釀酒酵母對(duì)葡萄酒的風(fēng)味有重要影響。本實(shí)驗(yàn)利用WL培養(yǎng)基對(duì)寧夏賀蘭山東麓采集的葡萄種植園土樣和葡萄果實(shí)表面上附著的非釀酒酵母進(jìn)行了初步的分離鑒定，為釀造出具有寧夏地區(qū)獨(dú)具風(fēng)格和特色的地域性酒種提供基礎(chǔ)性探索依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)鑒定出：戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母。并且初步對(duì)4種非釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵性能研究。結(jié)果表明，戴爾有孢圓酵母在耐SO2、耐酒精度和產(chǎn)酒度實(shí)驗(yàn)中均有良好表現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：非釀酒酵母；同質(zhì)化；分離；發(fā)酵性能；葡萄酒

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1443.015.html。

葡萄酒釀造最初采用的是自然發(fā)酵技術(shù)，自然發(fā)酵前期會(huì)有大量非釀酒酵母參與。與釀酒酵母相比，非釀酒酵母能產(chǎn)生和分泌甘油、高級(jí)醇、各種揮發(fā)性化合物以及多種胞外酶，這些物質(zhì)與葡萄汁相互作用，對(duì)提升葡萄酒的香氣、風(fēng)味等感官特征有很大的作用。

但是非釀酒酵母對(duì)葡萄酒風(fēng)味的影響一般是難以預(yù)測(cè)的，非釀酒酵母可能會(huì)產(chǎn)生不良的氣味和口感。近幾十年，許多葡萄酒生產(chǎn)國放棄了傳統(tǒng)的自然發(fā)酵法，開始利用商用酵母進(jìn)行純種發(fā)酵。相比較而言，商用釀酒酵母耐高酒精度、耐高溫，具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)有限營養(yǎng)物的能力，使葡萄酒的風(fēng)味更有保障，提高生產(chǎn)效率并且使酒的釀造便于控制，保證安全高效生產(chǎn)［1］。但由于商用釀酒酵母的使用，不能很好地體現(xiàn)葡萄酒的復(fù)雜性和典型性。因此，分離出優(yōu)良的非釀酒酵母，了解其發(fā)酵性能，使之發(fā)揮酵母優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用于釀造葡萄酒中的研究成為行業(yè)熱點(diǎn)。

2007年，楊瑩等［2］用WL培養(yǎng)基對(duì)分離的34株酵母菌進(jìn)行分類鑒定，并用26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析方法對(duì)這些酵母菌進(jìn)行分子鑒定，依次驗(yàn)證WL培養(yǎng)基鑒定結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，大多數(shù)菌株經(jīng)2種方法的分類鑒定的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)采用WL培養(yǎng)基對(duì)酵母菌進(jìn)行初步鑒定。

1材料與方法

1.1材料

采樣：寧夏賀蘭山東麓葡萄種植園土樣、赤霞珠葡萄。

1.2培養(yǎng)基及試劑

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，氯霉素100 mg/L（在篩選過程中排除細(xì)菌的干擾）。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉4.0 g，胰蛋白酶5.0 g，葡萄糖50.0 g，磷酸二氫鉀0.55 g，氯化鉀0.425 g，氯化鈣0.125 g，硫酸鎂0.125 g，氯化鐵0.0025 g，硫酸錳0.0025 g，瓊脂20.0 g，溴甲酚綠0.022 g，pH6.5，定容至1 L［3］。

發(fā)酵性能所需試劑：無水乙醇、亞硫酸、檸檬酸。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種的分離純化

（1）將采集的不同品種的葡萄漿果在實(shí)驗(yàn)室中除梗，每種葡萄漿果取等量漿液5mL分別放入5個(gè)無菌燒杯中破碎，每個(gè)燒杯中分別加入200mL、400mL、600mL、800mL和1000mL無菌蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋。

（2）將采集的葡萄種植園土樣取等量土樣5 g分別放入5個(gè)無菌燒杯中，每個(gè)燒杯中加入200mL、400mL、600mL、800mL和1000mL無菌蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋。

（3）在超凈工作臺(tái)中將稀釋液分別涂布于YPD平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d。待培養(yǎng)基表面長出單個(gè)菌落，選取菌落疏密分布適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，隨機(jī)挑選40個(gè)菌落，編號(hào)1～40，并在YPD平板培養(yǎng)基上以劃線方式分離純化。將純化后的酵母菌在28℃恒溫下培養(yǎng)2d，放入4℃冰箱保藏，待測(cè)。

1.3.2酵母菌的分類鑒定

將已保藏的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，活化24h，讓各菌株盡量處于同一個(gè)生長狀態(tài)。然后劃線接種于WL培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d，觀察記錄菌落的形態(tài)和顏色，然后根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色將所采集的菌株進(jìn)行初步分類［4］。

1.3.3發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

將采集的葡萄漿果除梗、破碎，得到的葡萄汁滅菌待用。

（1）耐SO2實(shí)驗(yàn)：取10mL滅菌葡萄汁分裝于滅菌試管（內(nèi)裝有杜氏管），加入亞硫酸使SO2濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，用移液槍吸100μL活化菌液接入上述滅菌葡萄汁中，25℃培養(yǎng)，記錄起始發(fā)酵時(shí)間［5］，發(fā)酵時(shí)間為從接種菌株到累計(jì)產(chǎn)氣0.1mL（約為杜氏管的1/4）所需時(shí)間。

（2）耐酒精度實(shí)驗(yàn)：取10mL滅菌葡萄汁分裝于滅菌試管（內(nèi)裝有杜氏管），用移液器加入無水乙醇使葡萄汁中乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為8.0%vol、10.0%vol、12.0%vol、14.0%vol，用移液槍吸100μL活化菌液接入上述滅菌葡萄汁中，25℃培養(yǎng)，記錄起始發(fā)酵時(shí)間［6］。

（3）最佳發(fā)酵溫度測(cè)定：取10mL滅菌葡萄汁分裝于滅菌試管（內(nèi)裝有杜氏管），分別將溫度控制在10℃、15℃、20℃、25℃，用移液槍吸100μL活化菌液接入上述滅菌葡萄汁中，記錄起始發(fā)酵時(shí)間。

（4）最佳發(fā)酵pH值：取10mL滅菌葡萄汁分裝于滅菌試管（內(nèi)裝有杜氏管），調(diào)pH值分別為5、6、7、8，用移液槍吸100μL活化菌液接入上述滅菌葡萄汁中，25℃培養(yǎng)，記錄起始發(fā)酵時(shí)間［6］。

（5）產(chǎn)酒精度測(cè)定：取400mL滅菌葡萄汁，用移液槍吸4mL活化菌液接入上述滅菌葡萄汁中，設(shè)定25℃培養(yǎng)4d。然后將發(fā)酵醪液等量分裝入4個(gè)蒸餾燒瓶中，加100mL蒸餾水，置1000 W電爐上蒸餾出100mL液體，搖勻后用酒精計(jì)和溫度計(jì)分別測(cè)定其酒精度和溫度，然后查表校正為20℃酒精濃度［7］。

2結(jié)果與分析

2.1利用WL培養(yǎng)基分離出的非釀酒酵母菌落形態(tài)

分離的菌株在WL培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，通過觀察其菌落形態(tài)和顏色，可分為5類。以上5類酵母菌在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

圖1 5類酵母菌在WL培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果

表1 5類酵母菌在WL培養(yǎng)基上的分類結(jié)果

2.2利用WL培養(yǎng)基鑒定分離純化后的酵母菌

WL培養(yǎng)基是被設(shè)計(jì)用來監(jiān)測(cè)飲料發(fā)酵過程中的微生物類群的［8］。Cavazza等［3］研究表明，在葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型的酵母菌種都可以用WL培養(yǎng)基進(jìn)行區(qū)分，主要基于菌落顏色及菌落形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)篩選到的5類酵母在WL培養(yǎng)基上形成的菌落顏色和形態(tài)見表1［9］。

如表1所示，初步鑒定，從葡萄汁中分離出的20株酵母菌株中：1—3號(hào)、5—10號(hào)、13—15號(hào)、19號(hào)、20號(hào)為戴爾有孢圓酵母；4號(hào)、16號(hào)為釀酒酵母；12號(hào)為葡萄汁有孢漢生酵母；11號(hào)、18號(hào)為異常漢生酵母；17號(hào)為東方伊薩酵母。

2.3發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)

由于本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)篩選非釀酒酵母，4號(hào)、16號(hào)為釀酒酵母，故排除。

2.3.1耐SO2實(shí)驗(yàn)

分離出的4種非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母）在不同濃度SO2的滅菌葡萄汁中的起始發(fā)酵時(shí)間見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄汁有孢漢生酵母和異常漢生酵母耐SO2能力較弱，僅可在SO2濃度為100 mg/L以下的葡萄汁中生長，在濃度為200 mg/L時(shí)便無法生長。戴爾有孢圓酵母和東方伊薩酵母耐SO2能力較強(qiáng)，可以在SO2濃度為150 mg/L的葡萄汁中生長，但在濃度為200 mg/L時(shí)，4種非釀酒酵母均無法生長。

表2不同SO2濃度對(duì)起酵時(shí)間的影響

2.3.2耐酒精度實(shí)驗(yàn)

分離出的4種非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母）在不同濃度酒精度的滅菌葡萄汁中的起始發(fā)酵時(shí)間見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戴爾有孢圓酵母耐酒精能力最強(qiáng)，在14.0%vol的酒精度下可以生長；其次是東方伊薩酵母，可耐受12.0%vol的酒精度；耐酒精能力最弱的是葡萄汁有孢漢生酵母和異常漢生酵母。

表3不同酒精濃度對(duì)起酵時(shí)間的影響

2.3.3最佳發(fā)酵溫度

分離出的4種非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母）在不同溫度的滅菌葡萄汁中的起始發(fā)酵時(shí)間見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度越低，起酵時(shí)間越慢。在同等溫度下各菌株表現(xiàn)較接近。戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母和異常漢生酵母在20℃左右，發(fā)酵能力最強(qiáng)。東方伊薩酵母隨著溫度的升高，發(fā)酵能力不斷上升（本實(shí)驗(yàn)溫度最高為25℃）。

表4溫度對(duì)起酵時(shí)間的影響

2.3.4最佳發(fā)酵pH值

分離出的4種非釀酒酵母（戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母）在不同pH值的滅菌葡萄汁中的起始發(fā)酵時(shí)間見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種非釀酒酵母在各個(gè)pH值環(huán)境下，起始發(fā)酵時(shí)間較為接近，最佳發(fā)酵pH值均在6～7。

表5不同pH值對(duì)起酵時(shí)間的影響

2.3.5產(chǎn)酒能力測(cè)定

分離出的4種非釀酒酵母在滅菌葡萄汁中產(chǎn)酒精情況見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，戴爾有孢圓酵母產(chǎn)酒能力最強(qiáng)，其次是東方伊薩酵母，葡萄汁有孢漢生酵母和異常漢生酵母產(chǎn)酒能力最弱。

表6菌株產(chǎn)酒精情況

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采集寧夏賀蘭山東麓葡萄種植園土樣和葡萄，利用WL培養(yǎng)基從中分離出5種酵母：釀酒酵母、戴爾有孢圓酵母、葡萄汁有孢漢生酵母、異常漢生酵母和東方伊薩酵母。其中戴爾有孢圓酵母數(shù)量最多，說明采集的樣品中戴爾有孢圓酵母占的比重較大。葡萄酒生產(chǎn)中最主要的酵母菌——釀酒酵母在漿果表面及自然發(fā)酵前期并不普遍存在，只在發(fā)酵中后期少量存在，一般其數(shù)量小于10～100 cfu/g［10］，在本實(shí)驗(yàn)中分離出了釀酒酵母，原因可能是采摘的葡萄放置時(shí)間稍久，葡萄表面有破裂，導(dǎo)致葡萄汁溢出，提前開始自然發(fā)酵。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)4株非釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵性能研究。通過采用滅菌的葡萄汁做小瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母在耐SO2、耐酒精度和產(chǎn)酒度實(shí)驗(yàn)中均有良好表現(xiàn)，在最佳發(fā)酵溫度和最佳發(fā)酵pH值實(shí)驗(yàn)中與其他菌株差異不大。東方伊薩酵母在最佳發(fā)酵溫度實(shí)驗(yàn)中，隨著溫度上升，發(fā)酵速率也隨著上升，本實(shí)驗(yàn)中未測(cè)到其最佳發(fā)酵溫度，其余3種菌株最佳發(fā)酵溫度均在20℃左右。葡萄汁有孢漢生酵母和異常漢生酵母各方面發(fā)酵性能較弱。本研究后續(xù)將對(duì)選出的優(yōu)良菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)香的研究。

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Isolation of Quality Non-Saccharomyces Yeasts and Study on Their Fermentation Performance

WANG Xiaochang1，LI Jingning2，ZHANG Huiling1，LIU Ya1and FU Lixia1
（1.Department of Food Science，School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750021；2.Ningxia Food Testing Center，Yinchuan，Ningxia 750000，China）

Abstract：Non-Saccharomyces yeasts have important influence on grape wine flavor.In the experiments，non-Saccharomyces yeasts were isolated from soil samples and grapes in vineyards in Ningxia Helan Mountain by WL culture mediums and then identified，which could provide basic research evidence for Ningxia local wine yeast.Four kinds of non-Saccharomyces yeasts including Torulaspora delbrueckii，Hanseniaspora uvarum，Hansenula anomala and Issatchenkia orientalis were identified and their fermentation performance was explored.The results suggested that Torulaspora delbrueckii had good performance in SO2resistance，alcohol resistance and the production of alcohol.

Key words:non-Saccharomyces yeasts；homogenization；separation；fermentation performance；grape wine

中圖分類號(hào)：TS261.1；TS262.6；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）06-0057-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015474

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目（413-0393）。

收稿日期：2015-12-21；修回日期：2016-03-01

作者簡介：王曉昌（1990-），男，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵，E-mail：408420456@qq.com。

通訊作者：張惠玲（1963-），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，E-mail：zhl5792@163.com。