王愛華，王松峰，孫福山*，黃明迪，王耀鋒，楊樹勛，趙存孝，夏 巍，喬萬鵬，王希玲（.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 660；.甘肅隴南市煙草公司，甘肅 隴南 76000；.甘肅慶陽市煙草公司，甘肅慶陽 75000；.山東臨沂煙草有限公司沂水分公司，山東 沂水 7600）

?

變黃期階梯升溫烘烤工藝對多酚類及相關(guān)物質(zhì)的影響

王愛華1，王松峰1，孫福山1*，黃明迪2，王耀鋒3，楊樹勛2，趙存孝3，夏 巍2，喬萬鵬2，王希玲4
（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.甘肅隴南市煙草公司，甘肅 隴南 746000；3.甘肅慶陽市煙草公司，甘肅慶陽 745000；4.山東臨沂煙草有限公司沂水分公司，山東 沂水 276400）

摘 要：采用電熱式溫濕度自控密集烤煙箱，研究了變黃期階梯升溫烘烤工藝對多酚類物質(zhì)、相關(guān)酶活性及含氮化合物的影響。結(jié)果表明，密集烘烤過程中，各烘烤工藝的總酚、綠原酸、咖啡酸和蕓香苷含量總體上均呈上升趨勢。除烘烤變筋期，變黃期階梯升溫烘烤工藝的總酚和綠原酸含量高于對照?？Х人帷⑹|香苷、莨菪亭等含量在烘烤過程中變化各不相同，烘烤結(jié)束兩工藝差異較小。棕色化反應(yīng)的敏感期，變黃期階梯升溫烘烤工藝的多酚氧化酶（PPO）活性較低；烘烤期間，該工藝的過氧化物酶（POD）活性明顯高于對照。烘烤過程中，變黃期階梯升溫烘烤工藝的苯丙氨酸和酪氨酸均表現(xiàn)出“降-升-降”的趨勢；烘烤中后期，變黃期階梯升溫烘烤工藝的蛋白質(zhì)降解得較低，而兩種氨酸含量則較高?？傊?，變黃期階梯升溫烘烤工藝有利于烤后煙葉總酚、綠原酸含量和芳香值的提高，利于蛋白質(zhì)的降解及苯丙氨酸和酪氨酸的積累。

關(guān)鍵詞：變黃期階梯升溫；密集烘烤工藝；多酚類物質(zhì)；酶活性；氨基酸

多酚在煙草的調(diào)制特性，色澤和等級，以及煙氣香味等各個方面起著重要作用，是衡量煙草品質(zhì)的一個重要因素，因而在提高煙葉品質(zhì)的研究中，多酚類物質(zhì)的重要性是不容忽視的。以往的研究大都關(guān)注苯丙烷類物質(zhì)和相關(guān)酶在抗病反應(yīng)中的作用，前人還對生長發(fā)育過程中煙葉多酚物質(zhì)含量水平的變化進(jìn)行過探討，關(guān)于某些栽培因子以及品種和成熟度對烤煙煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響也進(jìn)行了一些研究［1-7］，而目前針對烘烤過程中次生代謝的研究缺乏，關(guān)于密集烘烤工藝對多酚類物質(zhì)的影響的研究更少［8-11］。本研究通過研究變黃期階梯升溫烘烤工藝對多酚類物質(zhì)、相關(guān)酶活性和含氮化合物的影響，進(jìn)一步豐富多酚代謝理論，對于防止煙葉發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)，從根本上提高煙葉品質(zhì)也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗于 2014年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所進(jìn)行，以諸城市賈悅鎮(zhèn)大田長勢長相良好的優(yōu)質(zhì)煙葉供試，品種為中煙100。土壤類型為褐土，肥力中等。采收成熟一致的中部葉（9～11葉位）在智能化自控電烤箱中進(jìn)行烘烤。

1.2 試驗處理

按煙葉變黃溫度、變黃程度和定色溫度不同，設(shè)置2個處理，分別為G1和G2，處理G1為對照，處理G2為變黃期階梯升溫烘烤工藝，具體見表1。表1中“變片”指烘烤過程中煙葉完成主要變黃，變黃 7～8成，片軟；“變筋”指煙筋變黃，達(dá)到黃片黃筋；“干片”指煙葉葉片完全干燥。

1.3 試驗要求

在烘烤期間煙葉變化的關(guān)鍵階段（鮮煙、變片、凋萎、變筋、干片、干筋）末期取樣，樣品分成兩部分，一部分用于PPO和POD活性的測定，一部分殺青后用作多酚類、蛋白質(zhì)、苯丙氨酸和酪氨酸含量測定。烘烤工藝關(guān)鍵點按照設(shè)置進(jìn)行，其他操作技術(shù)均依常規(guī)密集烘烤工藝進(jìn)行。

1.4 測定內(nèi)容和方法

綠原酸、咖啡酸、蕓香苷、槲皮素、莨菪亭和七葉亭等多酚類物質(zhì)含量測定采用 YC/T 202—2006標(biāo)準(zhǔn)；總酚含量為檢測出的各多酚類物質(zhì)的總和；芳香值用多酚物質(zhì)總量與蛋白質(zhì)氮含量的比值表示。PPO活性采用鄰苯二酚氧化法測定［12］；POD活性用愈創(chuàng)木酚氧化法測定［13］，以每分鐘 OD470變化值表示酶活性大小。蛋白質(zhì)含量采用YC/T166 —2003；苯丙氨酸和酪氨酸含量采用水解并衍生化后液相色譜儀測定。

2 結(jié) 果

2.1 變黃期階梯升溫工藝對多酚類的影響

2.1.1 對總酚的影響 由圖1可知，各烘烤工藝處理總酚在烘烤過程中總體呈上升趨勢，處理G1在干片末期之后總酚含量稍有下降。整個烘烤過程中，處理G2的總酚含量高于G1，且在干片之后，差異表現(xiàn)較明顯。干筋期煙葉總酚含量顯著高于鮮煙葉。

2.1.2 對綠原酸的影響 本試驗烘烤過程及烘烤結(jié)束，綠原酸含量占總酚含量變化范圍為62.45%～84.22%（圖2）；處理G1和G2的總酚與綠原酸相關(guān)系數(shù)分別為0.997**和0.994**，均達(dá)到極顯著正相關(guān)。烘烤過程中，各烘烤工藝處理綠原酸含量變化規(guī)律與總酚相同，均呈現(xiàn)出整體上升趨勢，烘烤后期有波動。鮮煙至凋萎末期，各處理均呈逐漸升高趨勢，處理G2略高于處理G1；變筋末期，兩個處理的綠原酸含量差異較小，處理G1的綠原酸含量略高于處理G2；變筋末期之后，處理G2綠原酸含量仍持續(xù)升高，而處理G1稍有降低，此階段，處理G2綠原酸含量高于處理G1。

表1 不同處理關(guān)鍵溫度點指標(biāo)參數(shù)Table 1 Index parameter of key temperatures under different treatments

圖1 變黃期階梯升溫工藝對總酚的影響Fig.1 Effects of step-temperature yellowing technology on total phenols

圖2 變黃期階梯升溫工藝對綠原酸的影響Fig.2 Effects of step-temperature yellowing technology on chlorogenic acid

2.1.3 對咖啡酸的影響 各處理烤后咖啡酸含量明顯高于鮮煙葉，且總體上均表現(xiàn)出烘烤前中期先升高，之后稍有降低的趨勢（圖3）。鮮煙至凋萎末期，處理G2的咖啡酸含量升高迅速，處理G1的升幅則較小，處理G2明顯高于處理G1；變筋末期至干片末期，處理G1的咖啡酸上升幅度大，高于處理G2；進(jìn)入干筋期，由于處理G1咖啡酸含量降低，因此，烘烤結(jié)束處理G2的咖啡酸含量略微高于處理G1。

圖3 變黃期階梯升溫工藝對咖啡酸的影響Fig.3 Effects of step-temperature yellowing technology on caffeic acid

2.1.4 對蕓香苷和槲皮素的影響 各工藝處理烤后蕓香苷含量明顯高于鮮煙葉（圖4）。處理G1在變黃和定色期呈升高趨勢，進(jìn)入干筋期又有所下降；處理G2在烘烤過程中則一直呈升高趨勢。鮮煙至凋萎末期，處理G2的蕓香苷含量高于處理G1；進(jìn)入定色期之后，處理G1的蕓香苷含量上升較快，則高于處理G2。

各烘烤工藝處理的槲皮素含量較低（圖5）。槲皮素在烘烤過程變化較波折，具體表現(xiàn)為：處理G1的槲皮素含量先升高至變片末期，之后下降至變筋末期，干片期有所回升，進(jìn)入干筋期急劇下降；處理G2的槲皮素含量先升高至凋萎末期，之后再迅速降低至烘烤結(jié)束。變黃前期和干筋期，處理G1的槲皮素含量高于處理G2，而變黃中后期和定色期，則表現(xiàn)相反。

2.1.5 對莨菪亭和七葉亭的影響 由圖6可知，烘烤過程中，處理 G1的莨菪亭含量表現(xiàn)為“升-降-升”的趨勢，且在變片末期出現(xiàn)峰值，于干片末期達(dá)到最小值；處理G2的莨菪亭含量總體呈先升高后降低的趨勢，也于變片末期達(dá)到最高值。鮮煙至凋萎末期和干筋末期，處理G1的莨菪亭含量高于處理 G2；凋萎末期至干片末期，則表現(xiàn)相反。烘烤過程中，各處理七葉亭變化趨勢大致呈倒“V”型變化；除變筋末期，處理G2明顯高于處理G1，其他時期差異不太顯著。（圖7）。

2.2 變黃期階梯升溫工藝對相關(guān)酶活性的影響

2.2.1 對多酚氧化酶（PPO）活性的影響 多酚氧化酶是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的含銅金屬酶類，是呼吸鏈末端氧化酶之一，在氧的存在下，兒茶酚、花色素、綠原酸等單酚和多酚，均能被其催化而氧化，且在調(diào)制過程中由于多酚氧化酶的催化會使煙葉發(fā)生棕色化反應(yīng)。由圖8可知，隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)，各處理的 PPO活性變化總體呈現(xiàn)下降的趨勢。比較各處理PPO活性，在變筋末期之前，處理G2低于處理G1；變筋末期之后，各處理酶活性差異不大，且活性較微弱。

2.2.2 對過氧化物酶（POD）活性的影響 過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶類，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，可以催化酚類物質(zhì)的氧化。從測定結(jié)果看（圖 9），POD隨著烘烤時間的推進(jìn)，其活性升高，在凋萎末期達(dá)到最高值，之后急劇下降，干筋期酶活性幾乎全部喪失。烘烤過程中，處理G2的POD活性明顯高于處理G1。

2.3 變黃期階梯升溫工藝對相關(guān)含氮化合物的影響

2.3.1 變黃期階梯升溫工藝對蛋白質(zhì)的影響 隨著烘烤的進(jìn)行，蛋白質(zhì)逐漸降解。變黃期處理 G2的蛋白質(zhì)含量高于G1；變筋末期之后，處理G2蛋白質(zhì)含量則較低（圖10）。

圖4 變黃期階梯升溫工藝對蕓香苷的影響Fig.4 Effects of step-temperature yellowing technology on rutin

圖6 變黃期階梯升溫工藝對莨菪亭的影響Fig.6 Effects of step-temperature yellowing technology on scopoletin

圖5 變黃期階梯升溫工藝對槲皮素的影響Fig.5 Effects of step-temperature yellowing technology on meletin

圖7 變黃期階梯升溫工藝對七葉亭的影響Fig.7 Effects of step-temperature yellowing technology on esculetin

2.3.2 變黃期階梯升溫工藝對相關(guān)氨基酸的影響

隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)，處理G1的苯丙氨酸含量先稍降至變片末期，再升高至變筋末期，之后又降低至干筋末期（圖11）；處理G2先升高至凋萎末期，稍有下降后又繼續(xù)升至干片末期，之后又降低。除變筋末期，處理G2的苯丙氨酸含量高于處理G1。烘烤過程中，處理G1和G2的酪氨酸含量均表現(xiàn)出先下降后升高又下降的大致趨勢，且最低值均在變片末期，最高值則分別出現(xiàn)在凋萎末期、干片末期（圖12）。處理G2在烘烤過程中的酪氨酸含量均高于處理G1。

2.4 變黃期階梯升溫工藝對烤后多酚和芳香值的影響

多酚類化合物被作為衡量煙草質(zhì)量的一個因素，并提出把多酚物質(zhì)含量與蛋白質(zhì)氮含量的比值即“芳香值”作為判斷煙草中香氣吃味的依據(jù)［14］。由表2可知，處理G2烤后煙葉的芳香值高于G1，因此，處理G2的香氣和評吸質(zhì)量將好于處理G1。處理G2的綠原酸和總酚含量高于G1，咖啡酸、蕓香苷、莨菪亭等含量幾乎無差異。

圖8 變黃期階梯升溫工藝對PPO活性的影響Fig.8 Effects of step-temperature yellowing technology on PPO

圖10 變黃期階梯升溫工藝對蛋白質(zhì)的影響Fig.10 Effects of step-temperature yellowing technology on proteins

圖12 變黃期階梯升溫工藝對酪氨酸的影響Fig.12 Effects of step-temperature yellowing technology on tyrosine

3 討 論

3.1 烘烤工藝對多酚類物質(zhì)、相關(guān)酶活性和芳香值的影響

密集烘烤過程中，各工藝處理的總酚、綠原酸、咖啡酸和蕓香苷含量總體上均呈上升趨勢，烤后煙葉高于鮮煙葉。烘烤過程除變筋期，處理G2的總酚和綠原酸含量高于 G1，且在干筋期，差異較明顯?？Х人?、蕓香苷、槲皮素、莨菪亭和七葉亭含量在烘烤過程中變化各不相同，烘烤結(jié)束，各工藝處理差異較小。

圖9 變黃期階梯升溫工藝對POD活性的影響Fig.9 Effects of step-temperature yellowing technology on POD

圖11 變黃期階梯升溫工藝對苯丙氨酸的影響Fig.11 Effects of step-temperature yellowing technology on phenylalanine

多酚氧化酶是煙葉調(diào)制過程中決定煙葉色澤的重要酶類，調(diào)制不當(dāng)，它可氧化各種酚類物質(zhì)生成醌，再經(jīng)聚合成黑色素，導(dǎo)致棕色化反應(yīng)。POD是一類以血紅素為輔基的酶，具有不同的生物功能，主要催化 H2O2和有機(jī)過氧化物，加速多種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化，清除活性氧，也參與酚類物質(zhì)的氧化，所以，有人認(rèn)為PPO、POD、酚類可構(gòu)成一個體系表現(xiàn)出植物對逆境或成熟及衰老進(jìn)程的反應(yīng)［14］。隨著烘烤進(jìn)程的推進(jìn)，各處理的 PPO活性變化總體呈現(xiàn)下降的趨勢；而 POD則表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，峰值出現(xiàn)在變黃末期。棕色化反應(yīng)的敏感時期（45～47 ℃），工藝處理 G2的PPO活性低于G1。烘烤過程中，處理G2的POD活性明顯較高。

變黃期階梯升溫烘烤工藝（處理 G2）烤后煙葉總酚、綠原酸含量和芳香值較高；烘烤過程中，該工藝較低的PPO活性不易發(fā)生棕色化反應(yīng)，而較高的POD活性，因可能是由于處理G2采用了階梯升溫變黃工藝，變黃期設(shè)置了4個穩(wěn)溫階段，符合生理生化變化規(guī)律；利于烘烤過程中煙葉 PPO、POD等生理指標(biāo)向有益的方向進(jìn)行，利于多酚類的積累，也將利于香氣和評吸質(zhì)量的提高。

表2 烤后煙葉多酚類物質(zhì)含量及芳香值Table 2 Polyphenol substance contents and aroma values of cured tobacco leaves

3.2 烘烤工藝對相關(guān)含氮化合物的影響

煙草多酚類的合成由芳香族氨基酸（包括苯丙氨酸、酪氨酸等）脫氨經(jīng)由肉桂酸和香豆素形成的，一些關(guān)鍵化合物如莽草酸和奎尼酸在煙草中都存在。隨著烘烤的進(jìn)行，蛋白質(zhì)逐漸降解；變筋末期之后，處理G2蛋白質(zhì)含量則較低。烘烤過程中，處理G2的苯丙氨酸表現(xiàn)大致“M”趨勢，而處理G2的酪氨酸及處理G1的兩種氨基酸均表現(xiàn)出“降-升-降”的趨勢，且均在變片期（變黃7～8成之前）有降低趨勢?？傮w上，處理G2在烘烤過程中的苯丙氨酸和酪氨酸含量均高于處理G1。

在煙葉調(diào)制過程中，蛋白質(zhì)降解，苯丙氨酸和酪氨酸含量應(yīng)增加，而在變片期，處理G2的酪氨酸及處理G1的兩種氨基酸則降低較明顯，而美拉德反應(yīng)一般發(fā)生在50～55 ℃溫度下激烈進(jìn)行，這表明苯丙氨酸和酪氨酸在變片期可能參與了其他生化反應(yīng)，是否與多酚類物質(zhì)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究解決。

4 結(jié) 論

變黃期階梯升溫烘烤工藝烤后煙葉總酚、綠原酸含量和芳香值較高；烘烤過程中，該工藝不易發(fā)生棕色化反應(yīng)，利于煙葉內(nèi)含物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化，其間接影響煙葉品質(zhì)。變黃期階梯升溫烘烤工藝?yán)诘鞍踪|(zhì)的降解和苯丙氨酸以及酪氨酸的積累。

參考文獻(xiàn)

［1］ 趙銘欽，劉金霞，劉國順，等.增施不同的有機(jī)質(zhì)對烤煙多酚和石油醚提取物含量的影響［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，23（4）：536-539.

［2］ 孟祥東，趙銘欽，李元實，等.不同氮素形態(tài)及比例對烤煙多酚及相關(guān)酶活性動態(tài)的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32（1）：25-30.

［3］ 王愛華，王松峰，宮長榮.氮素用量對烤煙上部葉片多酚類物質(zhì)動態(tài)的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，33（3）：57-60.

［4］ 陳劍明，馮洪濤，夏啟東，等.云南主產(chǎn)煙區(qū)不同品種煙葉多酚研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（13）：5929-5930.

［5］ 張樹堂，楊雪彪.烤煙兩品種采收成熟度對色素和多酚化合物的影響［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，21（6）：756-760.

［6］ 劉陽，高麗君，蔡憲杰，等.采收成熟度對烤煙多酚含量和組成的影響［J］.煙草科技，2011（8）：73-78.

［7］ 徐增漢，王能如，劉領(lǐng)，等.烘烤工藝、成熟度和取樣方式對烤后煙葉多酚的影響［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46（4）：587-589.

［8］ 宮長榮，王愛華，王松峰.煙葉烘烤過程中多酚類物質(zhì)的變化及與化學(xué)成分的相關(guān)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（11）：2316-2320.

［9］ 樊寧.變黃環(huán)境對烤煙多酚氧化酶活性及多酚類物質(zhì)影響的研究［D］.貴陽：貴州農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［10］劉領(lǐng)，王能如，徐增漢，等.定色前期穩(wěn)溫點對煙葉石油醚提取物和多酚含量的影響［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（19）：5788-5789.

［11］王松峰，王愛華，王先偉，等.密集烘烤工藝對煙葉多酚類物質(zhì)含量及PPO活性的影響［J］.中國煙草學(xué)報，2013，19（5）：58-61.

［12］朱廣廉，鐘文海，張愛琴.植物生理學(xué)實驗［M］.北京：北京大學(xué)出版社，1991.

［13］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［14］鐘慶輝.煙草芳香吃味化學(xué)指標(biāo)的探索［J］.煙草科技，1981（4）：21-23.

Effects of the Step-temperature Yellowing Curing Technology on Polyphenol and Related Substance in Tobacco Leaves

WANG Aihua1， WANG Songfeng1， SUN Fushan1*， HUANG Mingdi2， WANG Yaofeng3， YANG Shuxun2，ZHAO Cunxiao3， XIA Wei2， QIAO Wanpeng2， WANG Xiling4
（1.Tobacco Research Institute of CAAS， Qingdao 266101， China； 2.Tobacco Company in Longnan， Longnan， Gansu 746000， China；3.Tobacco Company in Qingyang， Qingyang， Gansu 745000， China； 4.Linyi Tobacco Company of Shandong Province， Yinshui Branch 276400， China）

Abstract:Effects of the step-temperature yellowing curing technology on polyphenol， related enzyme activities and nitrogen compounds in tobacco leaves were studied using electric-heated flue-curing barn.The results showed that contents of total phenols，chlorogenic acid， caffeic acid and rutin increased during all bulk curing processes.Total phenols and chlorogenic acid contents of the step-temperature yellowing technology were higher than control except at the muscle-yellowing temperature stage.The contents of caffeic acid， rutin and scopoletin changed differently between the two technologies， but little difference was detected at the end of curing.Lower Polyphenol oxidase（PPO）activity during the sensitive period of the brown reaction and significantly higher Peroxidase（POD） activity during curing were observed for the step-temperature yellowing technology.With the step-temperature yellowing technology， the changes of phenylalanine and tyrosine of the showed a down-up-down trend during curing， lower proteins content and higher phenylalanine and tyrosine contents in middle and late curing period were observed.In short， the step-temperature yellowing technology was beneficial in improving the contents of total phenols， chlorogenic acid and aroma values， and was also favorable to protein decomposition and accumulation of phenylalanine and tyrosine.

Keywords:step-temperature yellowing； bulk curing technology； polyphenol substances； enzymatic activity； amino acids

中圖分類號：S572.01

文章編號：1007-5119（2016）02-0059-07

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.011

基金項目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（2014 JB01-005）；甘肅省煙草專賣局（公司）科技計劃項目“甘肅隴南特色優(yōu)質(zhì)煙葉研究與開發(fā)”（20130089）；“甘肅慶陽特色優(yōu)質(zhì)煙葉研究與開發(fā)”（QYYCKJ2013-001）；中國煙草總公司四川省公司科技項目（SCYC201402004）

作者簡介：王愛華，女，碩士，助理研究員，主要從事煙草調(diào)制加工研究。E-mail：wangaihua@caas.cn。*通信作者，E-mail：sunfushan@caas.cn

收稿日期：2015-05-11 修回日期：2016-03-23