吳玉泓，許雅清，李海龍，程小麗，明海霞，張磊，劉峰林，王瑞群

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗室；甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗室，蘭州 730000）

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脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立

吳玉泓1，2，許雅清1，李海龍1，2，程小麗1，明海霞1，張磊1，劉峰林1，王瑞群1

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗室；甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗室，蘭州 730000）

【摘要】目的 建立脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。方法 通過灌服大黃水煎液、肌肉注射氫化可的松并結(jié)合TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）混合乙醇灌腸建立脾腎陽虛型UC動物模型。將60只大鼠隨機(jī)分為空白組、脾腎陽虛型UC模型7、14 d及21 d組，采用酶聯(lián)免疫法檢測各組大鼠血清中FT3、FT4、T的含量。結(jié)果 與空白組比較，脾腎陽虛型UC模型7、14 d及21 d組大鼠血清中FT3、FT4、T的含量均有降低（P＜0.05）；尤以模型21 d組差異顯著。結(jié)論 FT3、FT4、T是脾腎陽虛的敏感指標(biāo)，檢測血清FT3、FT4、T可以更好地佐證脾腎陽虛；證明了脾腎陽虛型UC動物模型復(fù)建成功。

【關(guān)鍵詞】潰瘍性結(jié)腸炎；脾腎陽虛；酶聯(lián)免疫法；大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性非特異性的炎癥腸道性疾病，臨床以腹痛、腹瀉、黏液膿血便及里急后重為主，表現(xiàn)為以大腸黏膜和黏膜下層形成炎癥和潰瘍?yōu)樘攸c(diǎn)，屬于當(dāng)代極難治療的疾病之一［1］。目前國內(nèi)外針對UC的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制仍未闡明，可能是遺傳、環(huán)境和免疫等多因素共同作用的結(jié)果，其中又以免疫學(xué)因素最為重要。臨床上一般將UC分為急性發(fā)作期和緩解期，急性發(fā)作期多是由濕熱等邪氣停積于大腸引發(fā)炎癥所致，而緩解期多是由于久病及腎，傷及腎陽，最終導(dǎo)致脾腎陽虛?？偨Y(jié)分析各類文獻(xiàn)報道也可以發(fā)現(xiàn)UC始終存在脾失健運(yùn)的情況，脾虛是UC發(fā)病之本，而情志因素則為主要誘因，久病久瀉傷及腎臟則脾腎陽虛［2］。為了能更加直觀的研究脾腎陽虛型UC，我們選擇在大鼠身上先復(fù)制該模型，以方便未來更加深入的研究。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

SPF級Wistar大鼠60只，體重（180±20）g，雌雄各半，來源于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心【SCXK（甘）2011-0001】，整個實(shí)驗過程在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗中心的SPF級實(shí)驗室內(nèi)進(jìn)行【SYXK（甘）2011-0001】，購置大鼠后適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 藥品、試劑

三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS，購自Sigma公司，批號111M5001V）；氫化可的松注射液（批號13060211）；FT3、FT4、T Elisa試劑盒：購自南京建成生物工程研究所，批號20140301A。

大黃水煎液制備：大黃中藥材（購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房），常規(guī)水煎后，按13.5 g（生藥）/kg體重計量濃縮到濃度為1.35 g/mL。

1.3 主要儀器

水浴鍋：DZKW-4型。連續(xù)波長酶標(biāo)儀（Benchmark Plus）：Bio-Rad公司，產(chǎn)自美國。高速冷凍離心機(jī)（Biofuge-Stratos）：上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司，型號為CT14RD。顯微鏡：日本Olympus，CX21型。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 分組與造模

將60只Wistar大鼠按照體重及性別，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組，即空白組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組。

脾腎陽虛型UC大鼠模型的制備采用病證結(jié)合法建立，參考文獻(xiàn)方法［3-4］。第一階段復(fù)制“脾虛”模型：給空白組大鼠灌以蒸餾水每只2 mL/d，模型組各組大鼠上午大黃水煎液灌胃，每只2 mL/d，下午蒸餾水灌胃，每只2 mL/d，連續(xù)14 d后空白組體重（200±20）g、模型組體重（190±20）g；第二階段復(fù)制“脾腎陽虛”模型：第15天在模型組大鼠左右肢臀部交替注射氫化可的松25mg/（kg·d），并給予蒸餾水灌胃每只2 mL/d，連續(xù)10 d，第25天禁食不禁水，第26天用100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合試劑灌腸，空白組用等體積蒸餾水灌腸，進(jìn)而建立脾腎陽虛型UC大鼠模型，其體重為空白組（230±20）g、模型組（200±20）g。

1.4.2 標(biāo)本采集及處理

空白組、模型21 d組于造模21 d末，模型7、14 d組于造模7 d末、14 d末禁食不禁水24 h，用10%的水合氯醛麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺，在股動脈處取血，室內(nèi)放置10 min后3000 r/min離心10 min，取血清置4℃冰箱保管，ELISA法檢測血清FT3、FT4、T的含量具體操作參照試劑盒說明書。后脫頸處死大鼠剖腹剪取整個結(jié)腸組織并縱軸剪開，生理鹽水清洗干凈，截取病變結(jié)腸中的一部分，固定于4%多聚甲醛溶液中，等待常規(guī)HE染色制作病理切片。

1.4.3 病理切片制備

常規(guī)石蠟包埋，制作病理切片，進(jìn)行HE染色。具體步驟：①石蠟切片。②脫蠟至水（進(jìn)行此步驟前先烤片，60℃ 2 h）：二甲苯Ⅰ、Ⅱ液各15 min，100%無水乙醇Ⅰ、Ⅱ液各5 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ液各5 min，85%乙醇3 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水清洗1 min×3次。③ 蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化5 s，自來水浸泡15 min，返藍(lán)。④伊紅染色2 min，蒸餾水洗凈。⑤常規(guī)脫水：70%乙醇1 min，80%乙醇1 min，85%乙醇3 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ液各3 min，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ液各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ液各10 min。⑥選用中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

釆用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，方差齊性分析用F檢驗，計量資料以（±s）表示，組間比較選用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　實(shí)驗結(jié)果

2.1 各組大鼠一般生存狀況

空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應(yīng)敏捷，飲食量正常，活動情況無異常，毛發(fā)濃密柔順伴有光澤，糞便為棕褐色顆粒。脾腎陽虛型UC大鼠模型組則多數(shù)在第4天后開始出現(xiàn)蜷臥、瞇眼等部分癥狀，第9天后癥狀開始明顯，大鼠蜷臥扎堆，食量減少，體重開始減輕，便形質(zhì)軟，部分動物瞇眼弓背，游泳耐力下降。往后動物癥狀逐漸加重，體形消瘦（模型組動物相比空白組體重偏輕20～30 g），便形稀溏，肛周污穢，少食怠動，畏寒，成群蜷縮或弓背，毛發(fā)失去光澤而枯槁疏散等脾腎陽虛癥狀（模型7 d組死亡2只，模型14 d組死亡1只，模型21 d組死亡2只）。

2.2 鏡下觀察病理組織切片結(jié)果

2.2.1 空白組

該組大鼠組織切片可見結(jié)構(gòu)清楚，無水腫、潰瘍形成（圖1A）。

2.2.2 模型7 d組

切片顯示腸腔表面有炎性滲出物，黏膜腺體消失，基層、漿膜層有多個浸潤的淋巴細(xì)胞，纖維組織增生，局部可見淋巴濾泡形成（圖1B）。

2.2.3 模型14 d組

切片顯示結(jié)腸整個黏膜脫落消失，黏膜腺體消失，黏膜層、黏膜下層有明顯炎性細(xì)胞浸潤，伴纖維增生（圖1C）。

2.2.4 模型21 d組

切片顯示黏膜層、黏膜下層炎性細(xì)胞減少，毛細(xì)血管減少，膠樣組織纖維增生，肉芽組織向瘢痕過渡（圖1D）。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清中FT3、FT4、T的含量變化

與空白組比較，模型組各組大鼠血清中FT3、FT4、T的含量都有所降低，差異有顯著性（P＜0.01 或P＜0.05），尤以模型21 d組最為顯著（見表1）。

3　討論

圖1　大鼠結(jié)腸組織病理切片（HE染色，×100）Note.A.Blank group 0 d.B.Model group 7 d.C.Model group 14 d.D.Model group 21d.Fig.1 Pathological changes of the rat colonic tissue

本課題根據(jù)“病證結(jié)合”方法選用中藥混合西藥，取中藥和西藥的長處來共同制備脾腎陽虛型UC動物模型。利用苦寒瀉下的中藥大黃和對機(jī)體尤其針對腎臟有毒副作用的西藥氫化可的松注射液，先后制備脾陽虛和腎陽虛模型。而研究中所選用的TNBS誘導(dǎo)建立的UC大鼠模型是研究結(jié)腸黏膜免疫和炎癥反應(yīng)的重要模型，目前已經(jīng)被普遍采用。該模型最初被成功復(fù)制是在1984年，由 Sharon等［5］在大鼠身上成功復(fù)制，至此之后便在國外被廣泛應(yīng)用和改進(jìn)，而最近幾年也逐漸出現(xiàn)在國內(nèi)，關(guān)于該模型的報道也越來越多。此模型在大、小鼠身上均被復(fù)制。首先TNBS是體內(nèi)一種半抗原的物質(zhì)，可以與結(jié)腸里的大分子蛋白相互結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生一種完全抗原，誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，引起UC發(fā)病。建立該模型，方法簡便，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，炎癥持續(xù)時間長，效果好，與人類UC相似。

表1　各組大鼠血清中FT3、FT4、T的含量（±s）Tab.1 The levels of FT3，F(xiàn)T4，and T in in serum of every groups

表1　各組大鼠血清中FT3、FT4、T的含量（±s）Tab.1 The levels of FT3，F(xiàn)T4，and T in in serum of every groups

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note.Compared with the blank group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

組別Groups　n　FT3/pmol/L　FT4/pmol/L　T/ng/mL空白組0 d組Blank（0 d）　15　3.653±0.250　10.871±1.025　146.040±11.708模型7 d組Model（7 d）　10　3.255±0.440　10.184±0.985　142.750±7.114△模型14 d組Model（14 d）　10　2.970±0.227△　9.516±1.085△　140.292±10.702△模型21 d組Model（21 d）　10　2.551±0.165△△　8.061±0.647△　134.165±9.745△△

采用苦寒之藥大黃瀉下和糖皮質(zhì)激素類藥物氫化可的松共同制備脾腎陽虛型大鼠模型，造模后觀察大鼠一般生活情況，發(fā)現(xiàn)大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡不振、反應(yīng)明顯遲鈍、活動減少、畏寒喜蜷臥扎堆、皮毛枯槁疏散、飲食飲水減少、大便質(zhì)軟或稀溏、游泳耐力減少等現(xiàn)象，類似于中醫(yī)的脾腎陽虛證癥狀。在此基礎(chǔ)上選用TNBS混合乙醇灌腸制備潰瘍性結(jié)腸炎模型，大鼠普遍出現(xiàn)大便質(zhì)軟稀溏現(xiàn)象，HE染色病理切片鏡下觀察到模型組大鼠結(jié)腸組織明顯充血、水腫，有潰瘍和糜爛形成。

作為“下丘腦-垂體-靶腺軸”終端產(chǎn)物，F(xiàn)T3、FT4、T分別反映甲狀腺軸功能和性腺軸，在腎陽虛的病機(jī)學(xué)中甲減起很重要的作用，氣血虧虛、脾陽虛，相當(dāng)于甲狀腺功能減退的中期；腎陽虛衰、水濕內(nèi)停，相當(dāng)于甲狀腺功能減退的后期［6］。游離T3、T4生物活性很強(qiáng)，不會被血液中的甲狀腺素結(jié)合球蛋白改變、影響，F(xiàn)T3和FT4的測定對評價甲狀腺功能很有意義，故可以由此來判定腎陽虛。而睪丸酮（T）的變化是脾陽虛的敏感指標(biāo)，檢測血清FT3、FT4、T可以更好的佐證脾腎陽虛［7］。脾腎陽虛型UC模型組大鼠血清中FT3、FT4、T的明顯降低，提示這些激素參與了體溫變化，同時也證明了脾腎陽虛型UC動物模型復(fù)建成功。此造模方法從時間動態(tài)上觀察潰瘍性結(jié)腸炎動物模型制備的具體情況，方法簡單，易操作，周期短，成功率高，可作為潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制和相關(guān)藥物作用研究的理想模型。

參考文獻(xiàn)

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［3］ 陳賢坤，王立峰，趙慧，等.強(qiáng)肌健力方對脾腎兩虛大鼠細(xì)胞因子水平的影響［J］.放射免疫學(xué)雜志，2010，23（3）：282-283.

［4］ 趙海梅，劉端勇，湯菲，等.四神丸對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜修復(fù)的保護(hù)機(jī)制研究［J］.中成藥，2009，31（12）：1935 -1937.

［5］ Sharon P，Stenson WF.Enhanced synthesis of eukotriene B4 by colonic mucosa in inflammatory bowel disease［J］.Gastroenterology，1984，86（3）：453-460.

［6］ 葉涵婷，陳超，朱曙東.白術(shù)水煎液對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型及血清IL-6，IL-17的影響［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，37 （1）：69-71.

［7］ 謝夢洲，何軍鋒，屈婭婷，等.脾腎陽虛慢性咳嗽大鼠模型的研制［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，9（30）：30-33.

Preparation of a rat model of ulcerative colitis with spleen and kidney Yang deficiency

WU Yu-hong1，2，XU Ya-qing1，LI Hai-long1，2，CHENG Xiao-li1，MING Hai-xia1，ZHANG Lei1，LIU Feng-lin1，WANG Rui-qun1
（1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Province Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Translation；New products of Gansu Province Chinese Medicine Engineering Laboratory，Lanzhou 730000）

【Abstract】Objective To establish a rat model of ulcerative colitis（UC）with spleen and kidney Yang deficiency.Methods The rat model of ulcerative colitis with spleen and kidney Yang deficiency was established by oral administration of Rhubarb decoction，intramuscular injection of hydrocortisone，and combined with ethanol enema of TNBS（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid）.Sixty Wistar rats（body weight 180±20 g，male：female=1∶1）were randomly divided into blank control group and groups of UC models with spleen kidney Yang deficiency for 7 days，14 days and 21days.The serum levels of FT3，F(xiàn)T4，and T of the rats were detected by ELISA assay.Results Compared with the blank control group，the serum levels of FT3，F(xiàn)T4，and T in the groups of UC rat models with spleen kidney Yang deficiency for 7 days，14 days and 21days were decreased to a different extent（P＜0.05），especially，decreased dramatically in the model group for 21 days.Conclusions FT3，F(xiàn)T4，and T are sensitive indexes with spleen and kidney Yang deficiency.The detection of serum levels of FT3，F(xiàn)T4，and T can better verify the spleen and kidney Yang deficiency in the rats，and prove that the spleen and kidney Yang deficiency type UC animal model is successfully prepared.

【Key words】Ulcerative colitis；Spleen and kidney Yang deficiency；Enzyme linked immunosorbent assay；Rats Corresponding author：WU Yu-hong，E-mail：172924249@qq.com

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0116-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.002

［基金項目］國家自然科學(xué)基金項目（81260520）。

［作者簡介］吳玉泓（1967-），男，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)病證結(jié)合動物模型及治則治法研究。Email：172924249@qq.com。

［收稿日期］2015-09-17