孫建文　達(dá)劍森

摘要：牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此，對(duì)該病的定期檢疫對(duì)公共衛(wèi)生和食品安全具有重大意義。本研究采用提純結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)和y-干擾素（IFN-y）ELISA試驗(yàn)，對(duì)揚(yáng)州市的892頭奶牛進(jìn)行結(jié)核病檢測(cè)。結(jié)果表明，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢出的31頭牛型結(jié)核陽(yáng)性牛和可疑牛中，經(jīng)IFN-yELISA試驗(yàn)檢測(cè)僅檢出9頭禽型結(jié)核可疑牛。PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)特異性較差，出現(xiàn)了較高的假陽(yáng)性率，其原因可能與禽結(jié)核分枝桿菌感染或其他非特異性因素的干擾有關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核??；結(jié)核菌素；y-干擾素；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

牛結(jié)核病（Bovinetuberculo-sis，BTB），是由牛結(jié)核分枝桿菌（M.bovis）引起的一種人和多種家畜共患的慢性傳染病，以組織器官的結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征。在家畜中，以奶牛最為易感，其次為水牛、黃牛和牦牛。農(nóng)業(yè)部將其列為二類動(dòng)物疫病，衛(wèi)生部將其列為乙類人間傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病。PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)是OIE規(guī)定的金標(biāo)準(zhǔn)，在普查牛結(jié)核病中廣泛使用，但其特異性較低，日常檢測(cè)中假陽(yáng)性率較高。近年來(lái)，IFN-yELISA試驗(yàn)以其高特異性和靈敏度的優(yōu)勢(shì)，受到廣大業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。本研究旨在通過比較PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)法和IFN-yELISA方法在檢測(cè)奶牛結(jié)核病時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)，為確定快速準(zhǔn)確的奶牛結(jié)核病診斷方法提供參考，同時(shí)也為今后開展揚(yáng)州市奶牛結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

奶?？鼓獦悠穪?lái)自2013-2015年度揚(yáng)州市某區(qū)兩個(gè)奶牛場(chǎng)，檢測(cè)對(duì)象為兩場(chǎng)全部青壯年牛和成年奶牛，3年合計(jì)檢測(cè)數(shù)為892頭（3年分別為272頭、296頭和324頭）。

1.2試劑

牛型提純結(jié)核菌素（為黑龍江省生物制品一廠產(chǎn)品）；游標(biāo)卡尺（0～150mm）（為上海量具刀具廠產(chǎn)品）。生化培養(yǎng)箱（HWS-250，為上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品）；生物安全柜（BSC-1500ⅡA2-X，為濟(jì)南鑫貝生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），酶標(biāo)儀（RT-6000，為深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品），IFN-y檢測(cè)試劑盒（BovigamTM）（為PrionicsAG公司產(chǎn)品），刺激原禽型提純結(jié)核菌素（PPD-A）和牛型提純結(jié)核菌素（PPD-B）（均為瑞士Prionics公司產(chǎn)品）。

1.3方法

1.3.1PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

根據(jù)動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2002），用牛結(jié)核菌素0.1mL注射于牛的頸中部（左側(cè)或右側(cè)），分別于72h和120h進(jìn)行兩次觀察，觀察局部有無(wú)熱腫脹痛的炎性反應(yīng)，并量取皮皺厚度得出皮厚差。結(jié)果判定：以皮厚差大于4mm為陽(yáng)性，2～4mm為可疑，小于2mm為陰性。凡檢測(cè)為可疑的牛于檢測(cè)后60d進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢后仍為可疑的牛判為陽(yáng)性。

1.3.2IFN-yELISA試驗(yàn)

PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性或可疑的牛，在30d后采抗凝血5mL，無(wú)菌條件下將抗凝血加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每份樣品作3孔重復(fù)，1.5mL/孔）；對(duì)應(yīng)孔中分別加入100uL無(wú)菌PBS（作陰性對(duì)照）、刺激原禽型提純結(jié)核菌素和牛型提純結(jié)核菌素，抗原與分裝的血液充分混勻后振蕩1min，以上操作在采血后6h內(nèi)進(jìn)行；將加樣完畢后的細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜（24h）；收集上清（不少于300uL）-20℃貯存待檢。

使用IFN-y檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，方法參照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.結(jié)果與分析

2.1PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

3年間用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)共檢測(cè)兩個(gè)奶牛場(chǎng)樣本892頭，結(jié)核陽(yáng)性和疑似的奶牛為31頭（次），檢測(cè)結(jié)果見表1，陰性牛數(shù)據(jù)未列出。

由表1可知：2013年兩個(gè)奶牛場(chǎng)第1次檢測(cè)有9頭牛判定為結(jié)核陽(yáng)性，其中A場(chǎng)有4頭，B場(chǎng)有5頭；有4頭牛判定為可疑，其中A場(chǎng)有3頭，B場(chǎng)有1頭。然后對(duì)這4頭牛進(jìn)行了嚴(yán)格的隔離，相隔60d后進(jìn)行了復(fù)檢。復(fù)檢由同一人操作，采用同樣材料和方法，結(jié)果表明：這4頭牛復(fù)檢皮厚差均小于2mm，判定為陰性。

2014年兩個(gè)奶牛場(chǎng)第1次檢測(cè)有3頭牛判定為結(jié)核陽(yáng)性，其中A場(chǎng)有1頭，B場(chǎng)有2頭；有13頭牛判定為可疑，其中A場(chǎng)有7頭，B場(chǎng)有6頭。隔離60d后復(fù)檢，結(jié)果表明：13頭可疑牛中，有5條牛判定為可疑；有8頭牛判定為陰性。

2015年兩個(gè)奶牛場(chǎng)第1次檢測(cè)有1頭牛判定為結(jié)核陽(yáng)性，屬A場(chǎng)；有1頭牛判定為可疑，屬B場(chǎng)，隔離60d后復(fù)檢，結(jié)果為陰性。

通過連續(xù)3年的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)A場(chǎng)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性數(shù)分別為4、4、1頭，其陽(yáng)性率分別為2.56%、2.38%、0.55%；B場(chǎng)逐年監(jiān)測(cè)的陽(yáng)性數(shù)分別為5、4、0頭，陽(yáng)性率分別為4.31%、3.13%、0。兩個(gè)奶牛場(chǎng)3年來(lái)陽(yáng)性率分別為3.31%、2.70%、0.31%，結(jié)果呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)。

2.2IFN-YELISA檢測(cè)結(jié)果

對(duì)初檢PPD檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性或可疑的31頭奶牛的抗凝血經(jīng)IFN-YELISA試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。但其中有9頭牛禽型結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果為可疑。

2.3兩次皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)與IFN-Y誘導(dǎo)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的比較

表2數(shù)據(jù)說(shuō)明，兩個(gè)奶牛場(chǎng)3年來(lái)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率較高，筆者推測(cè)結(jié)果可能受到禽型結(jié)核分枝桿菌感染或其他非特異性因素干擾。

3.討論

PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是國(guó)際貿(mào)易的診斷準(zhǔn)，也是在全球范圍內(nèi)用于牛結(jié)核病檢疫和凈化應(yīng)用最為廣泛的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于試劑成本較低，適于在基層廣泛使用；但同時(shí)又因其過程耗時(shí)較長(zhǎng)、影響因素較多、60d內(nèi)復(fù)檢陽(yáng)性率降低等缺點(diǎn)，其檢測(cè)結(jié)果易受某些病原感染、治療藥物、人為誤差、個(gè)體差異等較多因素影響，結(jié)果常出現(xiàn)一定比例的假陽(yáng)性、假陰性，無(wú)法保證其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。尤其是對(duì)于可疑病例，檢測(cè)工作量更大，耗時(shí)更長(zhǎng)，在基層奶牛結(jié)核病凈化工作中的弊端日益顯現(xiàn)，若單獨(dú)用該方法，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛即實(shí)行“檢疫-撲殺”策略，會(huì)誤殺一些假陽(yáng)性牛，一定程度上會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

本試驗(yàn)對(duì)892頭奶牛使用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和IFN-yELISA方法進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，從結(jié)果可以看出，PPD方法非特異性較強(qiáng)，出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性/假陰性結(jié)果。2013-2015年來(lái)對(duì)揚(yáng)州市某區(qū)的2個(gè)奶牛場(chǎng)通過PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行初檢，用IFN-yELISA試驗(yàn)對(duì)陽(yáng)性牛和可疑牛進(jìn)行復(fù)檢，PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果（13/892）與IFN-yELISA試驗(yàn)結(jié)果（0/31）的吻合度較差，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。從本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，有9頭牛的檢測(cè)結(jié)果可能與其受到禽型結(jié)核分枝桿菌感染有關(guān)。另外，在復(fù)檢前對(duì)牛群進(jìn)行了驅(qū)蟲，結(jié)果陽(yáng)性數(shù)下降，其原因可能與受寄生蟲感染等非特異性因素干擾有關(guān)。

IFN-yyELISA方法操作簡(jiǎn)單快捷、敏感性好、特異性強(qiáng)，減少了人為誤差，處于感染早期的牛也可檢出，并且可以有效區(qū)分牛、禽型結(jié)核分枝桿菌以及假陽(yáng)性牛，在奶牛結(jié)核病的檢測(cè)和凈化工作中可發(fā)揮重要作用。但是，目前將該方法進(jìn)行大規(guī)模推廣還存在一些困難，主要是因?yàn)檫M(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，檢疫成本較高，樣品前處理較為繁瑣。本試驗(yàn)證明臨床牛結(jié)核病的診斷可采取兩種方法相結(jié)合的方式，利用IFN-yELISA方法對(duì)PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性牛和可疑的奶牛進(jìn)行確診檢測(cè)，可以有效的排除禽結(jié)核的干擾，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，避免出現(xiàn)誤殺。

綜上所述，與PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比，IFN-yELISA檢測(cè)方法特異性較好，在實(shí)際檢測(cè)過程中能夠節(jié)省大量的時(shí)間，因此，在進(jìn)行牛結(jié)核病檢測(cè)時(shí)，可先采用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行篩查，檢出陽(yáng)性即采取隔離；然后采用y-干擾素ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行綜合判斷，二者檢測(cè)均為陽(yáng)性的牛應(yīng)立即予以淘汰，這樣經(jīng)過數(shù)輪檢測(cè)淘汰，既可避免誤殺、錯(cuò)殺，又可盡快達(dá)到凈化牛結(jié)核病的目的。（編輯：趙曉松）