李朝靜，李培培，陳 敏，王 軍*（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京　100083）

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高效液相色譜-熒光法同時檢測葡萄汁中3種苯并咪唑類農(nóng)藥

李朝靜，李培培，陳 敏，王 軍*
（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

摘 要：建立同時檢測葡萄汁中3種苯并咪唑類農(nóng)藥（多菌靈、噻菌靈、麥穗寧）殘留的分散固相萃取處理結(jié)合高效液相色譜方法。樣品經(jīng)乙腈提取，無水MgSO4和NaCl鹽析后，用N-丙基乙二胺固相萃取材料分散凈化，然后采用高效液相色譜-熒光檢測器根據(jù)不同的保留時間選擇相應(yīng)的最佳檢測波長同時測定3種農(nóng)藥。通過對提取鹽、凈化劑、色譜條件的優(yōu)化，方法的加標回收率在85%～115%之間，相對標準偏差在1.95%～9.75%之間，多菌靈、噻菌靈和麥穗寧檢出限分別達到17.60、1.20、0.06 μg/L。該方法簡單、準確、重復(fù)性良好，滿足葡萄汁中多種苯并咪唑類農(nóng)藥殘留同時分析的需求。

關(guān)鍵詞：葡萄汁；苯并咪唑類農(nóng)藥；QuEChERS；高效液相色譜-熒光檢測

李朝靜, 李培培, 陳敏, 等. 高效液相色譜-熒光法同時檢測葡萄汁中3種苯并咪唑類農(nóng)藥[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 192-196. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612034. http://www.spkx.net.cn

LI Zhaojing, LI Peipei, CHEN Min, et al. Simultaneous determination of three benzimidazole fungicide residues in grape juice by high performance liquid chromatography with fluorescence detector[J]. Food Science, 2016, 37(12): 192-196. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612034. http://www.spkx.net.cn

苯并咪唑類農(nóng)藥是一類以苯并咪唑環(huán)為母體的高效、廣譜內(nèi)吸性有機殺菌劑，包括多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈、麥穗寧、2-氨基苯并咪唑等[1-3]。該類農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等多種作物生長期和儲存期真菌性病害的防治，在環(huán)境中比較穩(wěn)定[4]，在植物源性食品中殘存期較長，易在水果及果汁中殘留，進而對人體造成危害[3,5-7]。為了保證消費者安全，各國對水果及果汁中苯并咪唑類農(nóng)藥殘留量都十分重視，分別制定了最大殘留限量標準，范圍在0.01～10 mg/kg[6,8]。葡萄汁是目前市場上最受歡迎的果汁之一，檢測其中該類農(nóng)藥殘留對保護消費者健康非常必要。

目前苯并咪唑類農(nóng)藥主要利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行同時分析檢測[3,9-13]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法具有良好的選擇性和靈敏度，但儀器昂貴、使用成本高、操作較為復(fù)雜，應(yīng)用受到一定限制。高效液相色譜儀應(yīng)用較普遍，操作簡便且成本較低。Lin Ling等[14]應(yīng)用高效液相色譜在紫外波長280 nm處檢測蔬菜、水果中吡蟲啉、多菌靈、噻菌靈殘留。辜雪英等[15]利用高效液相色譜-紫外檢測器在267 nm波長處測定了柑橘中多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈和硫菌靈的殘留量，Veneziano等[16]利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器在288 nm波長處對50種香蕉樣品中苯并咪唑類農(nóng)藥（多菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈）殘留進行了檢測分析。熒光檢測法因具有較高靈敏度、雜質(zhì)干擾小等特點越來越受研究者的青睞。李盛安等[17]建立了超高效液相色譜-熒光檢測器對番石榴中多菌靈殘留的分析方法，檢出限較低，方法回收率在84.6%～93.5%之間。楊秀敏等[18]利用固相微萃取處理樣品后在激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長315 nm條件下完成對果汁中多菌靈和噻菌靈的測定。但是利用高效液相色譜-熒光法檢測水果、果汁中苯并咪唑類農(nóng)藥的研究主要集中在一種或兩種該類農(nóng)藥的同時檢測，且利用該方法在不同波長下同時分析不同農(nóng)藥的相關(guān)研究報道很少。本實驗選擇常用于防治葡萄病害的多菌靈、噻菌靈、麥穗寧為研究對象，建立了一種QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe）前處理結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測器在不同波長下同時分析3種農(nóng)藥的方法，為同時檢測葡萄汁中多種苯并咪唑類農(nóng)藥殘留提供了一種準確、高靈敏度、簡便的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）百靈威科技有限公司；Cleanert PSA填料、Cleanert C18填料天津博納艾杰爾有限公司；NaCl、MgSO4、NaAc、水合檸檬酸氫二鈉（Na2HCit?1.5H2O）、二水檸檬酸三鈉（Na3Cit?2H2O）、乙酸銨（均為分析純）北京化工廠；標準品（純度）：多菌靈（＞99.5%）、噻菌靈（＞99.5%）、麥穗寧（＞99.0%）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）美國Agilent公司；QL-861渦旋混合器海門市其林貝爾儀器公司；飛鴿TDL-5-A離心機上海安科公司；Milli-Q超純水機美國Millipore公司；PWC 124電子分析天平艾德姆衡器（武漢）有限公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

分別準確稱取多菌靈、噻菌靈、麥穗寧標準品10 mg（精確至0.000 1g），用甲醇溶解并定容到100 mL，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的標準儲備液，貯于－20 ℃保存。分別移取各標準儲備液適量于10 mL容量瓶中，用甲醇定容到10 mL，制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標準工作液。

1.3.2色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相為乙腈-水-0.05 mol/L乙酸銨（30∶60∶10，V/V）；根據(jù)各種農(nóng)藥殘留不同保留時間，采用分段設(shè)定熒光波長，波長檢測條件如表1所示。

表1　熒光檢測器波長檢測條件Table 1 Wavelength settings of fluorescence detector

1.3.3樣品處理

取葡萄汁10.0 mL于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10.0 mL乙腈，渦旋1 min，加入4 g無水MgSO4、1 g NaCl、1 g無水NaAc，迅速振蕩溶解鈉鹽后渦旋1 min，以3 000 r/min離心5 min。取靜置后的上清液6 mL置于15 mL離心管中，加入900 mg無水MgSO4和100 mg PSA，渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜后待測定。

1.3.4高效液相色譜-熒光檢測法測定

將配制好的標準工作液和處理好的樣品溶液按照1.3.2節(jié)的色譜條件依次進樣，進行定性及定量分析。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

為了提高檢測靈敏度，分別確定3種農(nóng)藥最佳激發(fā)與發(fā)射波長。多菌靈的熒光激發(fā)波長約在280 nm[19-20]。固定該激發(fā)波長，在300～400 nm波長范圍內(nèi)對多菌靈標準溶液進行發(fā)射波長掃描，確定多菌靈最佳發(fā)射波長310 nm。然后固定最佳發(fā)射波長310 nm，在200～300 nm波長范圍內(nèi)進行激發(fā)波長優(yōu)化掃描，確定多菌靈熒光最佳激發(fā)波長為285 nm；同樣方法優(yōu)化得到噻菌靈的最佳激發(fā)與發(fā)射波長分別為305、354 nm；麥穗寧的最佳激發(fā)與發(fā)射波長分別為309、345 nm。

優(yōu)化色譜條件，比較了乙腈（A相）-水（B相）、乙腈（A相）-水（B相）-乙酸銨溶液（C相）、以及甲醇（A相）-水（B相）3種不同組成流動相的分離效果，同時比較了Phenomenex HYPERSIL ODS-C18和Agilent ZORBAX SB-C18分離柱分離效果，發(fā)現(xiàn)當流動相比例為V（乙腈）∶V（水）∶V（0.05 mol/L乙酸銨溶液）= 30∶60∶10，使用Agilent ZORBAX SB-C18分離柱時，3種農(nóng)藥可以實現(xiàn)基線分離，且峰形對稱。多菌靈、噻菌靈和麥穗寧保留時間大約在5.40、7.00 min和8.00 min。采用在不同保留時間段選取對應(yīng)農(nóng)藥的最佳激發(fā)與發(fā)射波長進行熒光分析，使3種農(nóng)藥的響應(yīng)值都實現(xiàn)優(yōu)化，提高了檢測靈敏度。因此最終選擇流動相及比例V（乙腈）∶V（水）∶V（0.05 mol/L乙酸銨溶液）=30∶60∶10，Agilent ZORBAX SB-C18分離柱。具體優(yōu)化得到的色譜條件見1.3.2節(jié)中所述。

2.2QuEChERS的優(yōu)化

QuEChERS各個方法所用試劑及用量之間存在差異，但其原理相似[21-24]。首先加入乙腈，通過渦旋使水相與乙腈充分接觸，以達到農(nóng)藥充分轉(zhuǎn)移的目的，然后加入無水MgSO4和提取鹽，其中無水MgSO4起到吸水作用，提取鹽是為了提高離子強度，提供合適的萃取環(huán)境。加入PSA、C18或石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）等吸附劑能除去干擾物起到凈化作用。

2.2.1提取鹽的選擇

QuEChERS提取鹽主要有NaCl、無水NaAc、Na2HCit?1.5 H2O和Na3Cit?2 H2O。其中NaCl的作用是溶于樣品水溶液中提高離子強度，使水與乙腈分離；無水NaAc緩沖鹽可以使萃取環(huán)境處于一個弱堿性環(huán)境，Na2HCit?1.5 H2O和Na3Cit?2 H2O緩沖鹽組合使用可以使萃取環(huán)境的pH值保持在5.5左右，并確?；衔锾崛∵^程中體系pH值保持穩(wěn)定。

以加標0.5 mg/L多菌靈、0.1 mg/L噻菌靈、0.01 mg/L麥穗寧的葡萄汁為樣品，分別采用NaCl（A組）、NaCl＋NaAc（B組）和NaCl＋Na3Cit?2 H2O＋Na2HCit?1.5 H2O （C組）為提取鹽，其他實驗條件相同，做優(yōu)化比較，實驗結(jié)果見圖1。

圖1　不同提取鹽體系對3種農(nóng)藥回收率的比較Fig. 1　Comparison of different extraction salts for the recovery of three fungicides

從圖1可以看出，對于多菌靈和噻菌靈來說，A組的回收率低于B和C組，這是由于苯并咪唑類農(nóng)藥含有苯并咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，在較高的pH值條件下更容易轉(zhuǎn)移到有機溶劑中[2,25]，A組只加入NaCl，萃取環(huán)境pH值就是葡萄汁本身的酸堿度，通常在2.7～3.8之間，因此不易萃取到有機溶液中，導(dǎo)致回收率較低；B組中NaAc緩沖鹽可以使萃取環(huán)境處于一個弱堿性環(huán)境，利用該緩沖鹽萃取回收率最優(yōu)，所以最終選擇NaCl＋NaAc為提取鹽。

2.2.2吸附凈化劑的選擇

常用的QuEChERS吸附除雜凈化劑主要有3種，分別是C18、PSA、GCB。其中GCB強烈吸附非極性干擾物，但其六元環(huán)結(jié)構(gòu)會吸附平面及對稱結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，對苯并咪唑類農(nóng)藥會吸附而造成損失[26]，因此選用C18和PSA作為吸附劑比較前處理除雜效果。

圖2　不同凈化劑的凈化效果色譜圖比較Fig. 2　Comparison of the purification efficiencies of different sorbents

圖3　不同凈化劑對3種農(nóng)藥回收率的比較Fig. 3　Comparison of different purification reagents for the recovery of three fungicides

以加標0.5 mg/L多菌靈、0.1 mg/L噻菌靈、0.01 mg/L麥穗寧的葡萄汁為樣品，分別采用PSA（a組）、PSA＋C18（b組）、C18（c組）吸附劑，其他實驗條件相同，對比除雜后對這3種農(nóng)藥的吸附影響，結(jié)果如圖2、3所示。從圖2可以看出，a組雜質(zhì)峰面積最小，說明PSA雜質(zhì)去除效果較好，農(nóng)藥殘留回收率良好。通過圖3測定結(jié)果比較，對于多菌靈來說，3 組回收率相似；對于噻菌靈和麥穗寧，a組回收率均高于b、c組。因此選取PSA作為凈化劑。

2.3分析方法參數(shù)驗證

圖4　多菌靈、噻菌靈和麥穗寧標準溶液色譜圖Fig. 4　Chromatograms of mixed standard solution of carbendazim, thiabendazole and fuberidazole

取適量多菌靈、噻菌靈和麥穗寧標準儲備液，用甲醇配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標準工作液，質(zhì)量濃度范圍分別為0.1～3、0.01～0.5、0.002～0.05 mg/L，高效液相色譜-熒光檢測器進行分析，標準溶液色譜圖如圖4所示。分別以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，多菌靈標準工作曲線方程為y=2.834 8x＋0.147 2，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 7，線性范圍為0.1～3 mg/L；噻菌靈標準工作曲線方程為y=35.623x＋0.262 9，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8，線性范圍為0.01～0.5 mg/L；麥穗寧標準工作曲線方程為y=591.29x＋0.586 5，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 6，線性范圍為0.002～0.05 mg/L。

以3 倍信噪比計算檢出限，10 倍信噪比計算定量限，結(jié)果如表2所示。

表2　多菌靈、噻菌靈、麥穗寧的檢出限和定量限Table 2 LODs and LODs for carbendazim, thiabendazole and fuberidazole

由表2可以看出，采用根據(jù)各物質(zhì)保留時間不同分段設(shè)定熒光激發(fā)與發(fā)射波長進行分析具有很好的靈敏度，適合低含量農(nóng)藥殘留的分析。

在空白葡萄汁中加多菌靈、噻菌靈、麥穗寧進行加標回收率實驗，加標質(zhì)量濃度分為低、中、高3 個級別，即多菌靈加標質(zhì)量濃度為0.25、0.5、2 mg/L；噻菌靈加標質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.5 mg/L，麥穗寧加標質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.03 mg/L，每一個質(zhì)量濃度做5 次平行實驗評價方法精密度。按照優(yōu)化后的QuEChERS方法進行樣品前處理，1.3.2節(jié)所示色譜條件進樣，加標樣品色譜圖如圖5所示，加標回收率和相對標準偏差見表3。

圖5　多菌靈、噻菌靈、麥穗寧的加標樣品色譜圖Fig. 5　Chromatograms of samples spiked with carbendazim, thiabendazole and fuberidazole

表3　多菌靈、噻菌靈、麥穗寧的回收率和相對標準偏差（n=5）Table 3 Recovery and RSD of carbendazim, thiabendazole and fuberidazole (n=5)

從表3可以得出，該方法中多菌靈、噻菌靈和麥穗寧的回收率為85.0%～115.0%，說明方法的準確度良好，相對標準偏差在1.95%～9.75%之間，符合定量分析要求。

2.4葡萄汁樣品分析

實驗選取國內(nèi)5 個品牌6種葡萄汁及國外兩個品牌葡萄汁，按照上述優(yōu)化后的條件處理，按照優(yōu)化后的色譜條件進行檢測，檢測結(jié)果見表4。

表4　葡萄汁樣品檢測結(jié)果（n=3）Table 4 Analytical results for benzimidazole fungicide residues in grape juice samples (n=3)

從表4可見，8種葡萄汁中均未檢測出多菌靈和麥穗寧農(nóng)藥殘留，只含有微量的噻菌靈殘留，但殘留量均低于最大殘留限量標準，說明這些葡萄汁中該類農(nóng)藥殘留控制良好。該檢測方法準確性良好，檢出限和定量限低，適合于葡萄汁中多菌靈、噻菌靈和麥穗寧農(nóng)藥殘留的同時分析。

3　結(jié) 論

建立了利用QuEChERS前處理樣品，采用高效液相色譜分離后根據(jù)各物質(zhì)保留時間不同分區(qū)設(shè)定最佳熒光激發(fā)與發(fā)射波長同時檢測葡萄汁中多菌靈、噻菌靈和麥穗寧農(nóng)藥殘留的方法。該方法簡便、分離效果好，并具有檢測靈敏度高、準確性好的特點，方法的檢出限分別為17.60、1.20、0.06 μg/L。3種苯并咪唑類農(nóng)藥的回收率為85.0%～115.0%，相對標準偏差在1.95%～9.75%之間，符合定量分析要求。該方法適合同時分析葡萄汁中多菌靈、噻菌靈和麥穗寧農(nóng)藥殘留，并對其他各類果蔬飲料中這3種苯并咪唑類農(nóng)藥殘留分析具有重要的借鑒作用。

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Simultaneous Determination of Three Benzimidazole Fungicide Residues in Grape Juice by High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

LI Zhaojing, LI Peipei, CHEN Min, WANG Jun*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing100083, China)

Abstract:An analytical method was established for th e simultaneous determination of 3 benzimidazole fungicide (carbendazim, thiabendazole and fuberidazole) residues in grape juices by using high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) after quick easy cheap effective rugged safe (QuEChERS) cleanup. The fungicide residues in grape juice samples were extracted into acetonitrile with the addition of anhydrous MgSO4and NaCl. Then, the samples were analyzed after the fungicide residues in the supernatant were purified with N-propyl ethylenediamine (PSA) sorbent. The detection was performed with fluorescence detector under the corresponding optimal wavelengths according to different retention times of the three compounds. Under the optimized analytical conditions including extraction salts, purification reagent, mobile phase composition and chromatographic parameters, the recovery of the method for spiked samples ranged from 85% to 115% with relative standard deviation (RSD) between 1.95% and 9.75%. Meanwhile, the limits of detection (LODs) for carbendazim, thiabendazole and fuberidazole were 17.60, 1.20 and 0.06 μg/L, respectively. The simple and accurate method is appropriate for the simultaneous analysis of the three benzimidazole fungicide residues in grape juices with good repeatability.

Key words:grape juice; benzimidazole fungicides; quick easy cheap effective rugged safe (QuEChERS); high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD)

收稿日期：2015-09-06

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B04）

作者簡介：李朝靜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全分析。E-mail：lizhaojing0610@163.com

*通信作者：王軍（1975—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全分析。E-mail：wangjun1@cau.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612034

中圖分類號：O657.72

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0192-05引文格式：