黃亞芳，李羅明，李俊杰，李 珂*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙　410128）

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水酶法提取楊梅核仁油的工藝優(yōu)化

黃亞芳，李羅明，李俊杰，李 珂*
（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128）

摘 要：通過響應(yīng)面法分析和全因子試驗設(shè)計，探究單一酶和復(fù)合酶用于水酶法提取楊梅核仁油的效果，優(yōu)選確定水酶法提取楊梅核仁油的酶制劑為纖維素酶。采用正交試驗對酶法水解提取楊梅核仁油的工藝進行優(yōu)化，獲得其最佳工藝條件為纖維素酶添加量2%、酶解溫度50 ℃、pH 4.8、酶解時間2.5 h、料液比1∶4（g/mL），該條件下的得油率為33.95%，提取率為50.67%。采用氣相色譜法對楊梅核仁油的脂肪酸組成進行了分析，結(jié)果表明：木洞楊梅核仁油富含不飽和脂肪酸，高達87.22%，其中油酸含量達50.31%，亞油酸含量達到36.64%，亞麻酸含量為0.27%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；水酶法；楊梅核仁油；得油率；脂肪酸

引文格式：

黃亞芳, 李羅明, 李俊杰, 等. 水酶法提取楊梅核仁油的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 65-70. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612011. http://www.spkx.net.cn

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木洞楊梅是目前湖南省種植面積最大的楊梅品種，主要產(chǎn)自懷化靖州[1]。楊梅核仁是取自楊梅在釀酒及果飲加工后的廢棄物，富含不飽和脂肪酸，根據(jù)品種不同，楊梅核仁中油脂含量可高達58.12%～70.79%[2-3]。

水酶法[4]是一種新興的提油方法。它以機械和酶解為手段降解植物細胞壁，使油脂得以釋放，可以滿足食用油生產(chǎn)中“安全、高效、綠色”的要求[5-6]。與傳統(tǒng)浸提工藝相比，其最大優(yōu)勢是在于能安全有效回收植物原料中的蛋白質(zhì)（或其水解產(chǎn)物）及碳水化合物。酶在植物油脂中的應(yīng)用研究越來越受關(guān)注，國外眾多學(xué)者對大豆[7-8]、油菜籽[9-10]、油茶[11-12]、花生[13]等油料進行了廣泛、深入的研究，認為運用復(fù)合酶比使用單一酶更有利于提高出油率。Rosenthal等[14]使用蛋白水解酶和纖維素酶使花生油提取率從無酶的72%提高到78%。Dominguez等[15]進行水酶法從葵花籽中同時提取葵花籽油和葵花籽蛋白工藝的研究，結(jié)果表明油的提取率達到了30%，而且得到了顏色淺無抗?fàn)I養(yǎng)成分的蛋白粉。

目前，也有少部分研究者將此方法應(yīng)用于楊梅核仁油的提取。Zhang Yinglao等[16]采用纖維素酶和酸性蛋白酶（質(zhì)量比1∶1）復(fù)合添加量3.15%、料液比1∶4.9（g/mL）、酶解溫度51.6 ℃、酶解時間4 h，該條件下的東魁楊梅核仁得油率為31.15%，提取率約為49.44%；陳瀟逸等[17]結(jié)合微波處理，再用纖維素酶和蛋白酶水解，復(fù)合酶用量3.5%、酶解時間90 min、酶解溫度50 ℃、料液比1∶3 （g/mL），在此條件下得油率約為36%，提取率為53.79%；這兩者研究均采用復(fù)合酶作為酶制劑，添加量為3%以上，得油率為30%以上，而林弈琪等[18]采用單一酶（酸性蛋白酶）添加量1.0%、料液比1∶6、酶解時間3 h，該條件下得油率為19.0%，相比之下酶用量降低了2%以上，但得油率也降低了10%以上。目前單一酶與復(fù)合酶對楊梅核仁油的提取效果鮮見報道，本研究基于此出發(fā)點對水酶法提取木洞楊梅核仁油的酶制劑進行了探討，比較單一酶與復(fù)合酶解的效果，并對最適酶提取楊梅核仁油的工藝進行優(yōu)化，旨在篩選適合木洞楊梅核仁油的生產(chǎn)用酶，并確定最優(yōu)酶解條件，以提高對木洞楊梅核仁油的提取率；同時采用氣相色譜法[19]對水酶法提取的楊梅核仁油進行脂肪酸組成分析，為高品質(zhì)的楊梅核仁油的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木洞楊梅核產(chǎn)地湖南靖州，按照GB/T 5512—2008《糧油檢驗：糧食中粗脂肪含量測定》[20]測定核仁含油率為67%；果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶（均為食品級）銳陽生物有限公司；其他試劑均為分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

CP114電子分析天平奧豪斯儀器（上海）有限公司；DK-BD電熱恒溫水槽上海一恒科技有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M離心機長沙英泰儀器有限公司；GC-2014型氣相色譜儀日本Kyoto公司。

1.3方法

1.3.1原料處理

楊梅核經(jīng)楊梅核專用破殼試驗機破殼后過篩初步分離，經(jīng)人工篩選獲得核仁，105 ℃干燥至水分含量4.35%，粉碎至16 目以下，得楊梅核仁粉，冷藏備用。采用索氏抽提法[20]測定其含油量為67%。

1.3.2楊梅核仁油提取工藝

量取一定體積用HCl或NaOH已調(diào)好pH值的水于50 mL離心管中，加入一定量的酶，混勻后恒溫水浴活化5 min，準(zhǔn)確稱取核仁粉5.000 g，加入離心管中，混勻置于恒溫水浴鍋中，在設(shè)定的酶解溫度及酶解時間條件下進行酶解，反應(yīng)完成后90 ℃水浴10 min滅酶，8 000 r/min離心20 min；上層為楊梅核仁油。

1.3.3楊梅核仁得油率計算

使用正己烷分離油脂，減壓蒸發(fā)回收溶劑，并將其干燥（105 ℃）至質(zhì)量恒定，稱取油脂質(zhì)量，根據(jù)式（1）、（2）計算得油率和提取率。

式中：m’為楊梅核仁油與蒸發(fā)瓶的總質(zhì)量/g；m為蒸發(fā)瓶的質(zhì)量/g；M為楊梅核仁的質(zhì)量，5 g。

式中：67%為按照GB/T 5512—2008測定的核仁含油率。

1.3.4酶制劑的選擇

1.3.4.1各酶最佳添加量的單因素試驗

采用單因素試驗考察果膠酶（10萬 U/g）、纖維素酶（5萬 U/g）、酸性蛋白酶（80萬 U/g）添加量對楊梅核仁得油率的影響。酶解條件：果膠酶最適pH 5.5、溫度55 ℃；纖維素酶最適pH 4.8、溫度50 ℃；酸性蛋白酶pH 3.5、溫度45 ℃；料液比1∶5（g/mL）；酶添加量（基于楊梅核仁的質(zhì)量百分比）梯度：0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%，3 組平行取均值。

1.3.4.2酶添加量選擇的響應(yīng)面試驗

根據(jù)果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶的酶解適合條件范圍，將反應(yīng)條件定為：pH 4.5、酶解溫度45 ℃、料液比1∶5（g/mL）、酶解時間2 h。根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面[21]設(shè)計原理，運用三因素三水平分析法選取果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶3種酶添加量，試驗設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.3.4.3單一酶與復(fù)合酶對得油率的影響

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶3種酶在最佳pH值、溫度的條件下最佳添加量分別為2.5%、2.5%及2%；根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，各酶間無交互作用，試驗采用二水平全因子設(shè)計方案，考察不同酶復(fù)合作用與單一酶作用對楊梅核仁得油率的影響，試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2　全因子試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in full factorial design

1.3.5酶解條件優(yōu)化

1.3.5.1酶解條件單因素試驗

纖維素酶的最佳酶解溫度與pH值分別為50 ℃、pH 4.8，對其酶解各條件酶添加量、酶解時間和料液比分別進行單因素試驗，確定其對楊梅核仁得油率的影響；單因素試驗中固定參數(shù)條件如下：酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.8、酶解時間2 h、料液比1∶5（g/mL）。

1.3.5.2酶解條件正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對酶添加量、酶解時間與料液比做正交試驗，最終得到水酶法提取楊梅核仁油的優(yōu)化工藝參數(shù)。

表3　酶解條件正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels used in orthogonal array design for hydrolysis conditions

1.3.6楊梅核仁油脂肪酸組成分析

參照GB/T 17376—2008《動植物油脂：脂肪酸甲酯制備》、GB/T 17377—2008《動植物油脂：脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》，采用氣相色譜法對楊梅核仁油的脂肪酸組成進行分析。

氣相色譜條件：氫火焰離子化檢測器；脂肪酸的分離依靠SP2340石英毛細管柱來完成；氮氣作載氣，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度300 ℃，進樣不分流。柱溫箱的升溫程序為：50 ℃進樣，保持2 min；10 ℃/min升至170 ℃，保持10 min；2 ℃/min升至180 ℃，保持10 min；4 ℃ min升至 220 ℃，保持10 min。

2　結(jié)果與分析

2.1酶制劑的確定

2.1.1各種酶添加量對得油率的影響

果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶在各自最佳條件下，不同添加量對楊梅核仁得油率的影響見圖1。實驗結(jié)果表明，隨著酶添加量不斷增加，楊梅核仁提取的得油率不斷增加，這是由于酶可以破壞細胞壁及細胞中的脂蛋白等結(jié)構(gòu)，使油脂溶出，有利于楊梅核仁油的釋放；果膠酶與酸性蛋白酶添加量對得油率增長趨勢影響較大，而纖維素酶添加量的影響較??；果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶分別在添加量為2.5%、2.5%及2%時獲得最高得油率，分別為32.54%、33.68%、32.03%。隨著酶添加量繼續(xù)增加，得油率反而不斷降低，這可能是底物已飽和，過多的酶與油脂發(fā)生吸附作用，引起了無效結(jié)合[22-23]。

圖1　酶添加量對楊梅核仁得油率的影響Fig. 1　Effect of amounts of enzymes used individually on the oil yield extracted from Myrica rubra kernels

2.1.2酶添加量確定的響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法進行水酶法提取工藝條件的優(yōu)化并分析3種酶之間的交互作用。選擇果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶添加量進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4　酶添加量響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 The experimental design and corresponding results for response surface analysis

從表5可知，模型P＜0.05，失擬項P＞0.05，說明模型擬合程度較好，二次多項模型具有顯著性。試驗結(jié)果分析顯示，果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶添加量對楊梅核仁的得油率均有顯著影響（P＜0.01，P＜0.05）。但三因素之間的交互作用對楊梅核仁油的得油率都不具有顯著性影響（P＞0.05）。該模型各酶添加量最終優(yōu)化方案為果膠酶1%、纖維素酶1%、酸性蛋白酶0.67%，預(yù)測得油率為31.57%。在優(yōu)化條件下，3 組平行實驗得油率為（31.48±0.27）%，相比較各種單一酶最佳添加量條件下果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶的得油率分別為32.54%、33.68%、32.03%，此復(fù)合方案沒有優(yōu)化效果。

表5　酶添加量響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance of response surface design

2.1.3不同酶復(fù)合作用對得油率的影響

響應(yīng)面試驗設(shè)計對3種酶的相互作用研究表明，三者之間的相互作用均不顯著，試驗采用23無交互作用全因子設(shè)計，各復(fù)合酶組試驗的結(jié)果如表6所示。

表6　全因子試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6　Full factorial design results

從表6可看出，6 號果膠酶與酸性蛋白酶的復(fù)合添加組的效果最好，得油率最高（29.85%），7號纖維素酶與酸性蛋白、4號果膠酶與纖維素酶及8號3種酶的組合次之，2、3、5號3種單一酶效果再次之；1號得油率為14.13%，為對照組。由此說明，在一定條件下，復(fù)合酶的提取效果比單一酶略好，加酶的提取效果較好。這是由于種仁的結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜，加入一定的酶有利于破壞其組織結(jié)構(gòu)（蛋白質(zhì)、纖維素、果膠等），從而使得油脂得以釋放出來；另一方面，酶具有專一性，不同的酶針對不同的底物，加入不同種類的酶可以將不同結(jié)構(gòu)同時破壞，使得種仁破壞的更徹底，油脂釋放出更多。

果膠酶與酸性蛋白酶的復(fù)合添加組總酶添加量為5%，得油率為29.85%；單一酶組的添加量為2%～2.5%，得油率為21.40%～27.08%，單一酶在各自最佳條件下得油率則可達到32.02%～33.68%，相比較下，單一酶的成本只有復(fù)合酶的一半，得油率仍較高；3種單一酶對楊梅核仁的酶解效果中，纖維素酶的作用效果最強，因此后期將采取纖維素酶對楊梅核仁進行提取條件優(yōu)化試驗。

2.2酶解條件的優(yōu)化

2.2.1酶解條件單因素試驗結(jié)果

2.2.1.1酶添加量對楊梅核仁浸提得油率的影響

纖維素酶添加量對楊梅核仁浸提得油率的影響如2.1.1節(jié)所示，最佳添加量為2.5%，此時得油率為33.68%。

2.2.1.2料液比對楊梅核仁浸提得油率的影響

當(dāng)酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.8、酶解時間2 h時，料液比對楊梅核仁浸提得油率的影響如圖2所示。

圖2　料液比對楊梅核仁得油率的影響Fig. 2　Effect of solid/liquid ratio on the oil yield extracted from Myrica rubra kernels

試驗采用50 mL的離心管，取5 g樣品，考慮到料液比為1∶1、1∶2（g/mL）時，液體不足與物料充分接觸，為此省略。由圖2可知，當(dāng)溶劑用量不斷增大時，得油率不斷增加，當(dāng)達到1∶4（g/mL）時，就幾乎達到飽和狀態(tài)，再增大溶劑用量，得油率也沒有明顯增加?？紤]到酶解液不能回收利用，纖維素酶的成本，選擇1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）作為正交試驗3 個水平。

2.2.1.3酶解時間對得油率的影響

當(dāng)酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.8、料液比1∶5（g/mL）時，酶解時間對楊梅核仁浸提得油率的影響如圖3所示。

圖3　酶解時間對楊梅核仁得油率的影響Fig. 3　Effect of hydrolysis time on the oil yield extracted from Myrica rubra kernels

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，楊梅核仁的得油率也不斷增大，當(dāng)達到2 h后，酶解時間的延長變化對得油率沒有顯著影響；這可能是因為纖維素酶的酶解能力是一定的，或是原料中的底物是一定的，當(dāng)酶解時間達到一定時期后，纖維素酶所能酶解的底物已經(jīng)充分降解，繼續(xù)酶解也無明顯作用效果。

2.2.2酶解條件正交試驗結(jié)果

表7　酶解條件正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 7 Orthogonal array design with experimental values of oil yield

由表7可知，酶解時間（B）對楊梅核仁得油率的影響最大，其次是纖維素酶添加量（A），最后是料液比（C）。通過K值的比較發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的最佳組合為A1B3C2，即纖維素酶添加量2%、酶解時間2.5 h、料液比1∶4（g/mL）。

在最佳提取工藝條件下，進行水酶法提油驗證實驗，其得油率為（33.95±0.23）%，比正交試驗3號（A1B3C3）得油率33.72%高出0.2%。因此最佳提取工藝為：纖維素酶最佳酶解溫度50 ℃、pH 4.8、酶添加量2%、酶解時間2.5 h和料液比1∶4（g/mL）。該條件下得油率為33.95%，提取率為50.67%。

2.3脂肪酸組成分析

采用氣相色譜法對楊梅核仁油的脂肪酸組成進行了分析，楊梅核仁油中各脂肪酸的相對含量如表8所示，木洞楊梅核仁油富含不飽和脂肪酸，高達87.22%，其中油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達50.31%，亞油酸含量達到36.64%，亞麻酸含量為0.27%。亞油酸是人體必需的脂肪酸[24]，具有降低血清總膽固醇功效[25]；亞麻酸[26]是構(gòu)成人體組織細胞的主要成分，在體內(nèi)能合成、代謝，轉(zhuǎn)化為機體必需的生命活性因子二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸[27]，是一種具有較高潛在營養(yǎng)價值的植物油脂。

表8　楊梅核仁油脂肪酸組成分析Table 8 Fatty acids composition of Myrica rubra kernel oil

3　討論與結(jié)論

通過單因素試驗對果膠酶、纖維素酶及酸性蛋白酶3種單一酶的酶解效果做了初步研究，然后通過響應(yīng)面法分析、全因子試驗設(shè)計，探究了單一酶和復(fù)合酶用于水酶法提取楊梅核仁油的效果，結(jié)果證明復(fù)合酶作用效果不理想，得油率最高組合僅為29.85%，而且酶添加量也隨著疊加作用而成倍增加，單一酶添加量為2%～2.5%，2種酶復(fù)合添加量為4.5%～5%，3種酶添加量則可達到7%，成本也隨之大大增加；優(yōu)選確定了水酶法提取楊梅核仁油的酶制劑為纖維素酶。在酶制劑確定的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對酶法水解提取楊梅核仁油的工藝進行了優(yōu)化，獲得其最佳工藝條件為纖維素酶添加量2%、酶解溫度50 ℃、pH 4.8、酶解時間2.5 h、料液比1∶4（g/mL），該條件下的得油率為33.95%。文獻[17]報道采用微波進行前處理后再采用復(fù)合酶提取，提取率比本研究略高，但前一種方法操作工藝較復(fù)雜，復(fù)合酶添加量較大，成本較高，相比較而言，本研究中的單一酶提取法成本較低，工藝也更簡便。

同時，采用氣相色譜法對木洞楊梅核仁油進行了脂肪酸組成分析，結(jié)果表明：水酶法提取的楊梅核仁油主要含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸5種脂肪酸，相應(yīng)所占百分比分別為9.78%、3.00%、50.31%、36.64%、0.27%；不飽和脂肪酸高達87.22%，可與茶油橄欖油媲美，是一種具有較高潛在營養(yǎng)價值的植物油脂。

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Optimization of Enzyme-Assisted Aqueous Extraction for Myrica rubra Kernel Oil

HUANG Yafang, LI Luoming, LI Junjie, LI Ke*
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha410128, China)

Abstract:In this study, the response surface methodology and full factorial design were employed to evaluate the extraction efficiencies of Myrica rubra kernel oil by aqueous enzymatic extraction with three individual enzymes and their combinations, and it turned out that cellulase was the best enzyme for the extraction of Myrica rubra kernel oil. Then, using an orthogonal array design, the optimum hydrolysis conditions for oil extraction were determined as follows: cellulase dose, 2%; temperature, 50 ℃; pH value, 4.8; time, 2.5 h; and solid/liquid ratio, 1:4 (g/mL). Under these conditions, the oil yield was 33.95%, which was 50.67% as compared to the oil content of Myrica rubra kernels measured according to the Chinese national standard GB/T 5512—2008. Gas chromatography analysis revealed that the kernel oil contained 87.22% unsaturated fatty acids, including 50.31% oleic acid, 36.64% linoleic acid and 0.27% linolenic acid.

Key words:response surface methodology; aqueous enzymatic extraction; Myrica rubra kernel oil; oil yield; fatty acid

收稿日期：2015-10-14

基金項目：糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心項目（湘教通[2013]448號）

作者簡介：黃亞芳（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品加工與安全。E-mail：279272649@qq.com

*通信作者：李珂（1982—），男，實驗師，博士研究生，研究方向為食品科學(xué)、微生物學(xué)。E-mail：leeke14@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612011

中圖分類號：TS224.4

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0065-06