寧 霄，張偉清，梁瑞強，曹 進*，張慶生（中國食品藥品檢定研究院，北京　100050）

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, CAO Jin*, ZHANG Qingsheng(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing　100050, China)

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3種β-興奮劑化學(xué)發(fā)光酶免疫試劑盒分析檢測方法的評價

寧 霄，張偉清，梁瑞強，曹 進*，張慶生
（中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

摘 要：選取3種市售β-興奮劑化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒，從線性關(guān)系、靈敏度、選擇性、檢出限、準確度、重復(fù)性及變異性等方面進行實驗，并經(jīng)農(nóng)業(yè)部1025號公告—18—2008中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法驗證比較，初步建立了一套化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒質(zhì)量評價方法。結(jié)果表明：沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺3種試劑盒在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度分別為0.7、1.8、1.0 ng/mL，檢出限分別為0.2、0.1、0.2 ng/mL，豬肝、豬肉和牛肉的回收率在81.9%～115.2%之間，重復(fù)性變異系數(shù)為3.3%～9.7%，批間變異系數(shù)為9.9%～16.5%，交叉反應(yīng)率均符合產(chǎn)品說明書要求，可以用于豬肝、豬肉、牛肉樣品中沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的殘留檢測。

關(guān)鍵詞：沙丁胺醇；鹽酸克倫特羅；萊克多巴胺；化學(xué)發(fā)光酶免疫分析；試劑盒；評價方法

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, CAO Jin*, ZHANG Qingsheng
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing100050, China)

引文格式：

寧霄, 張偉清, 梁瑞強, 等. 3種β-興奮劑化學(xué)發(fā)光酶免疫試劑盒分析檢測方法的評價[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 238-242. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612043. http://www.spkx.net.cn

NING Xiao, ZHANG Weiqing, LIANG Ruiqiang, et al. Evaluation of three β-adrenergic agonist chemiluminescence enzyme immunoassay detection kits[J]. Food Science, 2016, 37(12): 238-242. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612043. http://www.spkx.net.cn

β-興奮劑是一類合成化學(xué)興奮劑。此類物質(zhì)有較強的蛋白質(zhì)同化作用，可提高蛋白質(zhì)沉積，如果將其加入動物飼料中，能有效地促進肌肉的生長，降低脂肪比率[1-2]。然而，現(xiàn)在醫(yī)學(xué)實驗已證明其殘留會嚴重影響到人類的健康，如出現(xiàn)心慌、頭痛、惡心等癥狀，甚至還會增加致癌、致畸的風(fēng)險[3-4]。鑒于此，人們開始越來越關(guān)注動物源性食品中存在的β-興奮劑給人們身體健康所帶來的影響，全世界所有國家均已禁止畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用此類藥物[5-7]，但目前非法使用并造成嚴重食物中毒事件的報道仍然屢見不鮮[8-11]，對人體健康構(gòu)成巨大威脅。所以選擇一種快速、靈敏的檢測方法具有很強的現(xiàn)實意義。

目前商品化的β-興奮劑檢測試劑盒以其方便快捷的特點得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）試劑盒，因其靈敏度、選擇性、準確率高、無污染、操作簡便等優(yōu)點而在近年來備受推崇[12]。但產(chǎn)品質(zhì)量尚沒有相應(yīng)的行業(yè)及國家標準，存在評價體系混亂的情況。鑒于我國試劑盒使用者、生產(chǎn)者和監(jiān)管者的迫切需求，本研究選擇沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺3種市場上常見的β-興奮劑CLEIA試劑盒，開展評價技術(shù)研究[13-15]，依托美國分析化學(xué)家協(xié)會方法驗證指南，參考食品法典委員會關(guān)于殘留分析法評價指標，從線性關(guān)系、靈敏度、選擇性、檢出限、準確度、重復(fù)性及變異性等方面進行實驗[16-22]，初步建立評價方法，為規(guī)范試劑盒質(zhì)量提供解決思路。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬肝、豬肉、牛肉樣品市售。

沙丁胺醇（純度為99.5%）、鹽酸克倫特羅（純度為98.5%）、萊克多巴胺（純度為98.0%）對照品德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶德國Merck公司；甲醇、乙腈為色譜純；甲酸、乙酸、異丙醇、乙酸銨、高氯酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、叔丁基甲醚均為分析純。

試劑盒組成：預(yù)包被抗體96 孔板、酶結(jié)合物、抗體、提取液、樣品稀釋液、底物液A、底物液B、濃縮洗滌液（1∶20稀釋后使用）、6種質(zhì)量濃度的系列標準溶液。

1.2儀器與設(shè)備

SPY-D-Ⅱ型單光子檢測儀沙屏研公司；高速離心機日本Hitachi公司；渦旋振蕩器中科公司；恒溫水浴振蕩箱上海森信科技有限公司；1290-6460型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/ MS）儀美國Agilent公司；氮吹儀北京合眾日盛科技公司；pH計瑞士Mettler Toledo公司；Oasis MCX固相萃取柱（60 mg）美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

取新鮮或冷凍的陰性或供試樣品，絞碎并使均質(zhì)，稱取樣品0.5 g于10 mL離心管中，加入5 mL提取液，超聲時間10 min。80 ℃水浴加熱10 min，6 000 r/min離心10 min。移取上清液1 mL，至培養(yǎng)皿中，晾干。再加入1 mL樣品稀釋液復(fù)溶，混勻待測。

1.3.2檢測步驟

分別加標準溶液和樣品溶液50 mL到對應(yīng)的微孔中，加入酶結(jié)合物及抗體各50 mL/孔，混勻，于室溫條件下反應(yīng)30 min，加250 mL/孔洗滌液洗滌4 次，加入底物液A、B各50 mL/孔，混勻，反應(yīng)10 min后，用單光子檢測儀測定各孔發(fā)光值。

1.3.3陰性樣品制備

對市售豬肝、豬肉和牛肉樣品根據(jù)農(nóng)業(yè)部1025號公告—18—2008規(guī)定用HPLC-MS/MS方法驗證樣品為陰性。

1.3.4標準曲線和靈敏度的測定

取試劑盒中質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL的6種系列標準溶液，按步驟1.3.2節(jié)進行測定，每種質(zhì)量濃度做2 個平行，重復(fù)3 次，分3 d進行，對照組為不加任何藥物的樣品稀釋液。

1.3.5選擇性的測定

1.3.5.1同類藥物的選擇性

分別在0.5 ng/mL的待測物溶液中加入1 000 ng/mL的同類藥物以及同類藥物混合物，按1.3.2節(jié)方法做3 個平行，測定質(zhì)量濃度。計算各個交叉反應(yīng)因子的交叉反應(yīng)率。

1.3.5.2基體的選擇性

分別取豬肝、豬肉和牛肉的陰性樣品按前處理方法進行操作，用所得溶液配制0.5 ng/mL的待測物試液，按1.3.2節(jié)方法測定其質(zhì)量濃度，并與用樣品稀釋液配制的相同質(zhì)量濃度試液實測質(zhì)量濃度進行比較，計算不同基體的交叉反應(yīng)率，每種基體做3 個平行。

1.3.6檢出限和定量限的測定

取豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別重復(fù)測定20 次，分別得出樣品溶液發(fā)光值（B）與對照組溶液發(fā)光值（B0）的比值，根據(jù)其平均值（M）和標準差（s）計算出M－2s的值，帶入標準曲線方程中，求出對應(yīng)的質(zhì)量濃度，即為相應(yīng)基體的檢出限。

取豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別重復(fù)測定20 次，得出測定結(jié)果的B/B0值，根據(jù)其平均值（M）和標準偏差（s）計算出M－6s的值，帶入標準曲線方程中，求出對應(yīng)的質(zhì)量濃度值，即為相應(yīng)基體的定量限。

1.3.7準確度與重復(fù)性的測定

采用豬肝、豬肉和牛肉3種基體加標進行回收率實驗，基體按照1.3.1節(jié)步驟進行處理，分別對1、5、10 ng/mL三個質(zhì)量濃度水平進行實驗，每種基體、每種質(zhì)量濃度做10 個平行，按1.3.2節(jié)步驟檢測。

1.3.8批間差異穩(wěn)定性的測定

每種試劑盒取3 個批次的產(chǎn)品，分別對3種基體進行測試，β-興奮劑添加質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，基體按照1.3.1節(jié)步驟進行處理，每個批次進行10 個平行，按1.3.2節(jié)步驟檢測。

1.3.9HPLC-MS/MS驗證

1.3.9.1樣品前處理

采用農(nóng)業(yè)部1025號公告—18—2008中HPLC-MS/MS方法。

1.3.9.2HPLC條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 150 mm，3.5 μm）；流動相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸溶液；梯度洗脫：0～2 min，維持80% A；2～12 min，80% A線性變化至40% A；12～12.1 min，40% A線性變至4% A；12.1～18 min，維持4% A；18～18.1 min，線性變至80% A；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

1.3.9.3MS條件

離子源：電噴霧離子化正離子模式；氣流溫度：330 ℃；氣流速率：8 L/min；噴霧氣壓力：30 psi；毛細管電壓：3 500 V；多反應(yīng)監(jiān)測掃描采集參數(shù)見表1。

表1　HPLC-MS/MS采集參數(shù)條件Table l Mass spectral parameters of salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線和靈敏度

表2　CLEIA試劑盒與HPLC-MS/MS方法測定結(jié)果的比較Table 2　Results of CLEIA and HPLC-MS/MS

根據(jù)標準溶液發(fā)光值（B）與對照溶液發(fā)光值（B0）之比計算抑制率，以標準溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)（lgC）值為橫坐標，對應(yīng)的抑制率為縱坐標繪制標準曲線，以50%抑制濃度（IC50）值衡量檢測方法的靈敏度，結(jié)果見表2。IC50越低說明靈敏度越高，由此可見，3種試劑盒檢測方法均具有較高的靈敏度，且符合產(chǎn)品說明書要求。

2.2選擇性

2.2.1同類藥物的選擇性

表3　同類藥物的交叉反應(yīng)率（n=3）Table 3 Cross-reactivity of kits with related compounds (n= 3)

同類藥物選擇性實驗結(jié)果見表3，因為沙丁胺醇和鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)最相近，都含有苯環(huán)和叔胺結(jié)構(gòu)，具有類似的免疫活性基團，所以體現(xiàn)出了3.0%～2.4%的交叉反應(yīng)，其他物質(zhì)之間交叉反應(yīng)率均小于0.1%，符合產(chǎn)品說明書要求?？梢?種試劑盒均具有較好的選擇性，檢測時受結(jié)構(gòu)類似物影響小。

2.2.2基體的選擇性

表4　豬肝、豬肉、牛肉的交叉反應(yīng)率（n=3）Table 4 Cross-reactivity of kits with pork liver, pork and beef (n= 3)

如表4所示，沙丁胺醇試劑盒中豬肝基體交叉反應(yīng)率為110.7%，豬肉為96.3%，牛肉為105.9%；鹽酸克倫特羅試劑盒中豬肝基體交叉反應(yīng)率為107.7%，豬肉為91.7%，牛肉為101.0%；萊克多巴胺試劑盒中豬肝基體交叉反應(yīng)率為90.6%，豬肉為103.9%，牛肉為92.7%；說明基體對3種試劑盒的干擾均很小。

2.3檢出限和定量限測定結(jié)果

對不同基體陰性樣品進行測定，經(jīng)計算得，沙丁胺醇試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.17、0.20、0.18 ng/mL，定量限分別為0.54、0.49、0.51 ng/mL；鹽酸克倫特羅試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.15、0.15、0.14 ng/mL，定量限分別為0.48、0.54、0.46 ng/mL；萊克多巴胺試劑盒檢測豬肝、豬肉和牛肉的檢出限分別為0.16、0.19、0.16 ng/mL，定量限分別為0.41、0.45、0.37 ng/mL。

2.4準確度與重復(fù)性實驗結(jié)果

表5　試劑盒檢測法準確度與重復(fù)性測定結(jié)果（n=10）Table 5 Mean recovery rates of 10 replicates for -adrenergic agonists in negative pork liver, pork and beef samples spiked at three levels (n= 10)

如表2、5所示，在豬肝、豬肉和牛肉中分別添加3種β-興奮劑，其中沙丁胺醇的回收率為81.9%～115.2%，平均回收率為100.3%，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為4.3%～9.9%，平均CV 為6.8%；鹽酸克倫特羅的回收率為88.7%～111.4%，平均回收率為98.6%，CV為3.8%～9.7%，平均CV為5.9%；萊克多巴胺的回收率為85.8%～110.2%，平均回收率為97.7%，CV為3.3%～9.3%，平均CV為5.4%。在各樣品的添加回收率實驗中，CV均在試劑盒說明書所允許的范圍內(nèi)，證明試劑盒有較好的準確性和重復(fù)性，可以用于豬肝、豬肉和牛肉的檢測。

2.5批間差異穩(wěn)定性實驗結(jié)果

計算不同批次產(chǎn)品的測定平均值和CV，結(jié)果如表6所示，沙丁胺醇試劑盒3 個批次產(chǎn)品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為11.3%、16.5%和10.2%；鹽酸克倫特羅試劑盒3 個批次產(chǎn)品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為12.0%、15.6%和14.5%；萊克多巴胺試劑盒3 個批次產(chǎn)品中添加在豬肝、豬肉和牛肉中的CV分別為9.9%、14.7%和11.8%。數(shù)據(jù)表明試劑盒批次間穩(wěn)定性良好。

表6　試劑盒檢測法批間差異穩(wěn)定性測定結(jié)果（n=10）Table 6 Inter-assay variance of the three kits (n= 10)

2.6HPLC-MS/MS驗證結(jié)果

2.6.1標準曲線的測定結(jié)果

用甲醇逐級稀釋的3種β-興奮劑混合標準工作液（1、5、10、20、50 ng/mL）分別進樣，以樣品的峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果表明，在1～50 ng/mL范圍內(nèi)，沙丁胺醇線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6；鹽酸克倫特羅線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7；萊克多巴胺線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7。

2.6.2檢出限和定量限的測定結(jié)果

選用豬肝、豬肉和牛肉3種陰性樣品，分別用絞肉機絞勻，稱取6 份，每份10 g，在其中加入一定量的β-興奮劑標準混合液，而后按照前述樣品處理方法和所定條件進行分析，以3 倍和10 倍信噪比分別計算出本方法的檢出限為0.2 ng/mL，定量限為1.0 ng/mL。

2.6.3準確度和重復(fù)性的測定結(jié)果

表7　HPLC-MS/MS檢測法準確度與重復(fù)性測定結(jié)果（n=6）Table 7 Mean recovery rates of 6 replicates for -adrenergic agonists in negative pork liver, pork and beef samples spiked at three levels (n= 6)

實驗選用3種基體陰性試樣中添加不同量的β-興奮劑混合標準液，進行加標回收實驗，每種基體，每個化合物做3 個水平的添加，每個添加水平均做6 個平行樣，從表7可以看出，該方法具有良好的精密度和較高的準確性。以此方法為標準，對CLEIA試劑盒分析法的準確性進行驗證。對2.4節(jié)和2.6.3節(jié)測定結(jié)果進行線性回歸分析，以相關(guān)性表示兩種方法的一致性。所得沙丁胺醇線性方程為y = 0.785 5 x＋0.460 4，R2=0.987 8；鹽酸克倫特羅線性方程為y = 0.904 5x＋0.293 5，R2=0.971 9；萊克多巴胺線性方程為y = 0.887 6x＋0.314 4，R2=0.973 4，說明3種CLEIA試劑盒檢測豬肝、豬肉、牛肉中的沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺結(jié)果準確可靠。

3　結(jié) 論

本實驗針對試劑盒質(zhì)量評價體系混亂的問題，綜合CLEIA方法自身特點，以3種經(jīng)農(nóng)業(yè)備案且年銷售量占據(jù)市場上同類產(chǎn)品1/3以上的β-興奮劑CLEIA試劑盒作為檢測對象，設(shè)計了一套質(zhì)量評價方法，并與農(nóng)業(yè)部1025號公告—18—2008中的HPLC-MS/MS方法進行了比較驗證。為企業(yè)在生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制及監(jiān)管部門日常監(jiān)督檢驗工作提供了參考依據(jù)。

實驗結(jié)果表明，選擇的3種試劑盒線性關(guān)系良好、靈敏度和準確度高，在檢出限、選擇性、重復(fù)性和變異性等方面符合產(chǎn)品說明書要求。對豬肝、豬肉和牛肉中沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺的測定方便快捷，更具有針對性。

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Evaluation of Three β-Adrenergic Agonist Chemiluminescence Enzyme Immunoassay Detection Kits

Key words:salbutamol; clenbuterol hydrochloride; ractompaine; chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA); kit; evaluation method

Abstract:In this study, three commercially available β-adrenergic agonist chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) detection kits were evaluated in term of regression curve, sensitivity, specificity, detection limit, accuracy, reproducibility and inter-assay coefficients of variation. The validated test between CLEIA and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was done. This work established a methodology for the quality evaluation of CLEIA test kits. The results showed that three detection kits all had good linearity. Their sensitivities for three β-adrenergic agonists, salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine, were 0.7, 1.8, and 1.0 ng/mL, and the corresponding limits of detection (LODs) were 0.2, 0.1, and 0.2 ng/mL, respectively. The recovery rates from spiked pork liver, pork and beef were between 81.9% and 115.2%. The reproducibility and inter-assay coefficients of variation were 3.3%–9.7% and 9.9%–16.5%, respectively. Cross-reactivity rate was in compliance with the product specification requirements. The three kits can be used in detection of salbutamol, clenbuterol hydrochloride and ractompaine residues in pork liver, pork and beef.

收稿日期：2015-08-13

作者簡介：寧霄（1985—），女，助理研究員，碩士，研究方向為食品及化妝品質(zhì)量控制。E-mail：xiao200730079@hotmail.com

*通信作者：曹進（1970—），男，研究員，博士，研究方向為食品及化妝品質(zhì)量控制。E-mail：caojin@tsinghua.org.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612043

中圖分類號：TS207

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0238-05