劉　寧，李　超，陳雪峰，錢衛(wèi)東，任彩霞，李　騁

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安　710021)

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脂肪酶PalataseM.miehei的固定化及催化菜籽油水解研究

劉寧，李超，陳雪峰，錢衛(wèi)東，任彩霞，李騁

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安710021)

摘要：采用10種樹脂對脂肪酶Palatase M.miehei進(jìn)行了吸附法固定化，并將其用于催化菜籽油水解．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大孔吸附樹脂LX-8的固定化效果最好，固定化率達(dá)91.2%，其得到的固定化酶(IM-PM)酶活為731.1 U/g.經(jīng)米氏常數(shù)測定，相比游離酶而言，IM-PM的米氏常數(shù)增大，反應(yīng)速率降低；采用IM-PM催化菜籽油水解，得到了最適水解工藝為：反應(yīng)時間3 h、底物摩爾比(水/油)70∶1、攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度55 ℃、加酶量1.5%，最終水解液酸價可達(dá)83.2 mg·KOH/g.經(jīng)重復(fù)使用6次，IM-PM殘余催化活力仍可達(dá)70%.

關(guān)鍵詞：脂肪酶Palatase M.miehei；固定化；大孔樹脂；水解；菜籽油

0引言

脂肪酶PalataseM.miehei是一種液態(tài)游離酶，可用于催化油脂的水解及合成反應(yīng)．但因在使用中不易回收，使其應(yīng)用受到了一定限制[1]．與游離酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點：易與底物、產(chǎn)物分離；可在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；在非水相環(huán)境中，可提高酶的穩(wěn)定性；可增加產(chǎn)物的得率，提高產(chǎn)品質(zhì)量；酶的使用效率提高，成本降低．酶的固定化解決了工程化應(yīng)用中存在的諸多問題，極大地提高了酶的應(yīng)用價值，促進(jìn)了酶工程的飛躍發(fā)展[2-4]．酶的固定化方式包括吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合法等．其中，吸附法具有操作簡單、酶活回收率好等優(yōu)點，在固定化酶的工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛[5]．

油菜在陜西省陜南地區(qū)種植面積大，菜籽油產(chǎn)量較高．因富含不飽和脂肪酸，菜籽油具有較高的開發(fā)利用價值．將菜籽油進(jìn)行酶解，可制備甘油二酯、脂肪酸等產(chǎn)品，可作為功能性油脂和生物柴油行業(yè)精深加工的原料．

本實驗采用10種樹脂對脂肪酶PalataseM.miehei進(jìn)行了吸附法固定化，研究了各載體的固定化效果，得到了固定化脂肪酶(IM-PM)，并將其用于催化菜籽油水解反應(yīng)，研究了水解工藝條件．該研究結(jié)果可為酶的固定化及菜籽油的開發(fā)利用提供理論參考．

1材料與方法

1.1材料與試劑

脂肪酶PalataseM.miehei，丹麥Novozymes公司；菜籽油，益海糧油工業(yè)有限公司；樹脂D-101、樹脂AB-8，天津南開大學(xué)化工廠；樹脂LX-8、樹脂D-001、樹脂D-301、樹脂LX-38、樹脂LSA-21、樹脂XDA-7、樹脂LX-17、樹脂LSA-900C，西安藍(lán)曉科技有限公司；三丁酰甘油酯，分析純，日本東京株式公社；氫氧化鉀，分析純，天津化學(xué)試劑廠．

1.2儀器與設(shè)備

101-2型電鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型電子天平，德國Sartorius公司；HH-1型恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；TDL-40B型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；JBZ-14H型磁力攪拌器，上海大浦儀器有限公司．

1.3實驗方法

1.3.1樹脂預(yù)處理

稱取4g樹脂于100mL燒杯中，加入30mL的95%乙醇，浸泡24h，抽濾至濾液不呈白色渾濁，依次用30mL5%HCl和5%NaOH浸泡3h后，抽濾至濾液呈中性，冰箱存放備用．

1.3.2脂肪酶的固定化

稱取一定量的脂肪酶PalataseM.miehei加入pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)6mL，混合均勻后再加入2g大孔吸附樹脂，置于磁力攪拌器中吸附2h，過濾分離載體和上清液，抽濾，用相同緩沖液淋洗，30 ℃真空干燥4h，置于4℃保存待用．計算固定化率(ImmobilizingEfficiency，IE)[6]的公式如下：

IE=(E0V0-EfVf)/E0V0×100%

其中：E0為初始酶活力(U/mL)，V0為初始酶液的體積(mL)，Ef為濾液酶活(U/mL)，Vf為濾液的體積(mL)．

1.3.3脂肪酶活力的測定

采用水解三丁酰甘油酯pH-stat法測定脂肪酶活力，參考Mishra等[7]的方法．反應(yīng)緩沖液為0.005mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5，含0.025mol/LCaCl2)，測定溫度為37 ℃．

酶活定義為：在一定條件下，1min水解三丁酰甘油酯產(chǎn)生1 μmol丁酸所需的酶量，即為一個酶活力單位(U)．

1.3.4米氏常數(shù)(Km)測定

分別取一定量的三丁酰甘油酯作為底物于Tris-HCl緩沖液中，加入脂肪酶，置于恒溫磁力攪拌器中催化水解反應(yīng)，5min內(nèi)測定酶促反應(yīng)速率，以反應(yīng)速率和底物濃度作圖計算得到酶的Km值．

1.3.5菜籽油的水解工藝研究

將菜籽油、去離子水按照一定量的摩爾比混合后加入到250mL錐形瓶中，加入一定量的固定化酶，用保鮮膜封閉瓶口，置于恒溫磁力攪拌器中進(jìn)行水解反應(yīng)．反應(yīng)結(jié)束后，測定水解液的酸價，研究反應(yīng)時間、攪拌速率、底物摩爾比、溫度、加酶量等因素對IM-PM催化菜籽油水解效果的影響．同時研究IM-PM的重復(fù)使用效率．

2結(jié)果與討論

2.1固定化載體的篩選

選取10種不同特性的樹脂作為PalataseM.miehei的固定化載體，在pH7.0的PBS緩沖液中加入一定量的樹脂，再加入脂肪酶，于30 ℃下攪拌吸附2h后過濾，測定濾液的酶活，計算固定化率(IE)．對樹脂吸附得到的IM-PM經(jīng)真空干燥后，測定其酶活，其結(jié)果如表1所示．

表1不同樹脂對脂肪酶PalataseM.miehei的固定化效果

樹脂特性粒度/mm比表面積/(m2/g)孔徑/?IE/%IM-PM活性/(U/g)D-301離子交換0.5～0.7--82.8±0.4400.9±2.2LX-38弱極性-600-86.7±0.2506.2±1.5D-101非極性0.25～0.84480～520130～14090.9±0.1551.2±1.8LSA-21中等極性-≥63030083.2±0.473.3±0.9XDA-7離子交換---80.3±0.6146.7±1.5LX-8極性0.315～1.25-2591.2±0.2731.1±2.1D-001離子交換0.315～1.25--87.0±0.6330.7±0.6LX-17中等極性0.315～1.25≥46030087.5±0.1551.7±1.5AB-8弱極性0.315～1.25600130～14081.4±0.7146.6±2.2LSA-900C極性-1100～140020080.2±0.3104.7±0.7

由表1可知，D-101和LX-8大孔樹脂吸附脂肪酶PalataseM.miehei的固定化率較高，分別為90.9%和91.2%，所得IM-PM的酶活也較大，分別為551.2U/g和731.1U/g．大孔樹脂可以借助氫鍵、范德華力或功能基團(tuán)將酶分子固定化，樹脂的理化性質(zhì)是影響固定化能力和固定化酶催化活力的重要因素[8]．綜合固定化率和IM-PM的酶活考慮，本實驗選擇LX-8樹脂作為固定化PalataseM.miehei的載體．

2.2酶的米氏常數(shù)測定

酶的米氏常數(shù)Km等于酶促反應(yīng)達(dá)到其最大速度Vmax一半時的底物濃度，表示酶與底物之間的親和力，Km值越大，親和力越弱；反之，親和力越強(qiáng)[1]．實驗測定了IM-PM和游離脂肪酶的動力學(xué)常數(shù)，其結(jié)果如圖1所示．

圖1　酶的動力學(xué)常數(shù)測定

對圖1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，可以得到游離脂肪酶PalataseM.miehei和IM-PM的Km和Vmax值，結(jié)果如表2所示．由表2可以發(fā)現(xiàn)，酶經(jīng)固定化后，Km有所增加，Vmax降低，表明酶與底物的親和力有一定程度地降低，反應(yīng)速率相對減?。@是因為酶經(jīng)固定化后，蛋白酶分子的構(gòu)象發(fā)生了改變，與底物之間產(chǎn)生了一定的擴(kuò)散限制效應(yīng)，導(dǎo)致兩者親和力降低[9]．

表2　米氏常數(shù)及最大反應(yīng)速率測定

2.3固定化酶催化菜籽油水解工藝研究

2.3.1反應(yīng)時間對水解效果的影響

實驗研究了在不同反應(yīng)時間下，固定化酶IM-PM催化菜籽油水解反應(yīng)的效果，其結(jié)果如圖2所示．由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，水解液的酸價不斷增大．經(jīng)3h水解反應(yīng)后，產(chǎn)物水解液酸價為75.3mg·KOH/g．再進(jìn)一步延長反應(yīng)時間，水解液酸價變化不大，反應(yīng)逐漸趨于平衡．因此，從節(jié)約反應(yīng)時間考慮，本實驗選擇水解時間為3h．

圖2　反應(yīng)時間對水解效果的影響

2.3.2攪拌轉(zhuǎn)速對水解效果的影響

實驗研究了磁力攪拌器的不同攪拌轉(zhuǎn)速對IM-PM催化菜籽油水解反應(yīng)的影響，其結(jié)果如圖3所示．由圖3可知，在低于250r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，水解液酸價隨攪拌速度的升高而增大，若再繼續(xù)加快攪拌轉(zhuǎn)速，反應(yīng)效果反而降低.這可能是因為過快的攪拌速率對體系中的固定化酶造成了一定程度的機(jī)械損傷[10]，導(dǎo)致酶的活力和催化效率降低．因此，實驗選擇磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為250r/min．

圖3　攪拌轉(zhuǎn)速對水解效果的影響

2.3.3底物摩爾比對水解效果的影響

實驗研究了底物摩爾比(水/菜籽油)對固定化酶IM-PM催化菜籽油水解效果的影響，其結(jié)果見圖4所示．

圖4　底物摩爾比對水解效果的影響

由圖4可知，當(dāng)?shù)孜锬柋?水/油)為70∶1時，菜籽油水解效果最好，體系含水量過多或過少，水解效果都不佳．這可能是因為：作為油脂水解反應(yīng)底物之一，水與菜籽油的比例存在一個臨界值，低于或高于該臨界值時反應(yīng)效率都會不同程度減?。诜磻?yīng)中，添加一定量的水可為脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)提供界面，總界面面積的大小直接影響著反應(yīng)效率[11,12]．當(dāng)體系含水量較少時，增加水的比例可以增加界面面積，因此在本實驗中，當(dāng)?shù)孜锬柋?水/油)小于70∶1時，水解液酸價隨含水量升高也明顯增大；而當(dāng)?shù)孜锬柋?水/油)增至90∶1時，體系含水量過多，酶的相對濃度急劇減小，造成反應(yīng)效果降低，水解液酸價下降．因此，本實驗最終選擇底物摩爾比(水/油)為70∶1．

2.3.4反應(yīng)溫度對水解效果的影響

實驗研究了反應(yīng)溫度對固定化酶IM-PM催化菜籽油水解效果的影響，其結(jié)果如圖5所示．由圖5可以看出，在水解過程中IM-PM的最適催化溫度為55 ℃．當(dāng)溫度低于55 ℃時，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶催化活力增加，表現(xiàn)為水解液酸價不斷增大；當(dāng)溫度為60 ℃時，水解液酸價明顯下降，這可能是因為酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在此溫度下發(fā)生了熱變性失活，引起酶催化活力降低[13,14]．因此，本實驗選擇水解溫度為55 ℃．

圖5　溫度對水解效果的影響

2.3.5加酶量對水解效果的影響

實驗研究了加酶量(占底物總質(zhì)量百分比)對菜籽油水解效果的影響，其結(jié)果如圖6所示．由圖6可以發(fā)現(xiàn)，IM-PM加酶量對水解效果具有較大影響．當(dāng)?shù)陀?.5%時，隨著加酶量的增大，水解液酸價不斷升高；當(dāng)加酶量為1.5%時，其達(dá)到最高為77.5mg·KOH/g；若加酶量進(jìn)一步增至2.0%，水解反應(yīng)效率反而有所降低．由此可知，在較低的酶濃度時，隨著加酶量增大，酶促反應(yīng)效率迅速提高．當(dāng)酶濃度增大到一定程度時，再添加過多的酶，反而會導(dǎo)致酶聚結(jié)，使反應(yīng)效率降低．Duan等[15]的研究也表明由于酶分子聚結(jié)和擴(kuò)散限制問題會降低反應(yīng)效率．故本實驗最終選擇加酶量為1.5%．

圖6　加酶量對水解效果的影響

2.3.6固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)

通過以上實驗，確定了菜籽油水解條件為：水解時間3h、攪拌速率250r/min、底物摩爾比(水/油)70∶1、溫度55 ℃、加酶量1.5%．在此條件下，考察了IM-PM的重復(fù)使用次數(shù)，其結(jié)果如圖7所示．

由圖7可知，采用新酶水解，產(chǎn)物水解液酸價為83.2mg·KOH/g．經(jīng)10次重復(fù)使用，產(chǎn)物水解液酸價有一定程度地降低．利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，第5、6次反應(yīng)產(chǎn)物酸價無顯著性差異(p<0.05)；IM-PM經(jīng)6次重復(fù)酶解實驗，反應(yīng)液酸價仍在初始的70%以上(60.3mg·KOH/g)．由此可見，該固定化酶具有較好的重復(fù)使用效率．

圖7　IM-PM的重復(fù)使用次數(shù)

3結(jié)論

本實驗采用大孔樹脂對脂肪酶PalataseM.miehei進(jìn)行了固定化，發(fā)現(xiàn)LX-8樹脂固定化效果最好，固定化率達(dá)91.2%，得到的固定化酶IM-PM酶活為731.1U/g．測定了兩種酶的米氏常數(shù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)固定化后，酶與底物的親和力有所降低．

將IM-PM用于催化菜籽油水解，得到最適水解條件為：反應(yīng)時間3h、底物摩爾比(水/油)70∶1、攪拌速率250r/min、溫度55 ℃、加酶量1.5%，最終水解液酸價為83.2mg·KOH/g．經(jīng)重復(fù)使用6次后，該酶仍具有較好的催化活力．

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【責(zé)任編輯：晏如松】

ImmobilizationoflipasePalataseM.mieheiandhydrolysisofrapeseedoilcatalyzedbythisimmobilizedenzyme

LIUNing,LIChao,CHENXue-feng,QIANWei-dong,RENCai-xia,LICheng

(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi′an710021,China)

Abstract:Ten types of resins were employed as carriers for immobilization of lipase Palatase M.miehei,and the obtained immobilized lipase was used for hydrolysis of rapeseed oil.The result showed that macroporous resin LX-8 was the optimal carrier for Palatase M.miehei,which performed the highest immobilizing efficiency (91.2%).And the activity of the immobilized Palatase M.miehei (IM-PM) was 731.1 U/g.Compared with free enzyme,the Michealis constant of IM-PM increased and the reaction rates decreased.This IM-PM was employed to catalyze the hydrolysis of rapeseed oil,and the suitable hydrolysis conditions were as follows:reaction time of 3 h,substrate molar ratio (water to oil) of 70∶1,stirring speed of 250 r/min, temperature of 55 ℃,and enzyme load of 1.5%.Under these conditions,the acid value of final hydrolyzates reached 83.2 mg·KOH/g.After six times reuse,the remained activity of IM-PM was 70%.

Key words:lipase Palatase M. miehei；immobilization；macroporous resin；hydrolysis；rapeseed oil

*收稿日期:2016-05-19

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31501443)；陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2014JQ3111)；陜西省教育廳專項科研計劃項目(15JK1088)；陜西科技大學(xué)博士科研啟動基金項目(BJ15-02)

作者簡介:劉寧(1984-)，男，四川巴中人，講師，博士，研究方向：油脂化學(xué)、食品乳狀體系

文章編號：1000-5811(2016)04-0131-05

中圖分類號：Q814.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A