王新超，郝素紅，高英堂，邱麗君，趙爽，韓璐

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WT1特異性CD8+T細(xì)胞治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究

王新超1，郝素紅1，高英堂2，邱麗君1，趙爽1，韓璐1

摘要：目的通過檢測(cè)Wilms'腫瘤基因1（WT1）特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷活性，探討正常外周血中提取的WT1特異性CD8+T細(xì)胞用于治療乳腺癌的可行性。方法運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)20例人白細(xì)胞抗原（HLA）-A2血清陽(yáng)性健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的濃度，通過WT1/主要組織相容性復(fù)合體（MHC）連鎖狀多聚體磁珠分選WT1特異性CD8+T細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT1特異性CD8+T細(xì)胞的功能。結(jié)果20例HLA-A2血清陽(yáng)性健康志愿者外周血中均可檢測(cè)到WT1特異性CD8+T細(xì)胞，12例健康外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的濃度＞0.5%，其中4例＞1%。WT1/MHC連鎖狀多聚體磁珠分選后，其濃度明顯增加至80%左右。WT1特異性CD8+T細(xì)胞可特異性殺傷WT1多肽負(fù)載的乳腺癌細(xì)胞株。結(jié)論健康志愿者外周血中可檢測(cè)到WT1特異性CD8+T細(xì)胞，該細(xì)胞可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用，提示W(wǎng)T1特異性CD8+T細(xì)胞用于乳腺癌過繼性免疫治療的可能性。

關(guān)鍵詞：乳腺腫瘤；免疫療法，過繼；CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；WT1；細(xì)胞免疫治療

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，部分大城市報(bào)告乳腺癌占女性惡性腫瘤之首。在美國(guó)，2015年乳腺癌在女性新發(fā)癌癥病例中約占29%［1］。免疫治療是腫瘤治療的重要模式之一，其中腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞過繼性免疫治療備受關(guān)注。純化的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞不但可以特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以避免移植物抗宿主反應(yīng)，因此，成為目前研究的焦點(diǎn)［2-3］。如何獲得高純度的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞成為治療的關(guān)鍵。

Wilms'腫瘤基因1（WT1）是一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)基因，在成人正常組織中含量非常低，但在急、慢性白血病和一些實(shí)體瘤中高表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，其在90%的乳腺癌中高表達(dá)［4-5］。WT1與惡性腫瘤的表型有關(guān)，應(yīng)用反義寡聚脫氧核苷酸治療乳腺癌，可直接作用于翻譯位點(diǎn)，故腫瘤細(xì)胞不易逃避WT1導(dǎo)向的免疫治療［6］。因此，WT1特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的研究和應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注。本研究從健康志愿者外周血中純化WT1特異性CD8+T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和增殖，通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT1特異性CD8+T細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞的效應(yīng)。

1　材料與方法

1.1主要試劑連鎖狀多聚體試劑：包括IS緩沖液、WT1連鎖狀多聚體藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）等購(gòu)自德國(guó)IBA公司；抗CD8*異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）等抗體、BD FACS沖洗液、清理液、浸潤(rùn)液以及FACS Calibur流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司，分別儲(chǔ)存于4℃、-20℃和-80℃冰箱；Ficoll-Biocoll和RPMI 1640分離液購(gòu)自德國(guó)生物化學(xué)AG公司；人AB白蛋白購(gòu)自德國(guó)DRK公司；青霉素和鏈霉素購(gòu)自天津?yàn)蠊尽?/p>

1.2血標(biāo)本外周血標(biāo)本由20例人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A2血清陽(yáng)性健康志愿者提供。外周血單核細(xì)胞由Ficoll-Biocoll分離液從血標(biāo)本中分離獲得，經(jīng)過臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其存活率＞95%。外周血單核細(xì)胞可以直接用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，或冷凍后儲(chǔ)存于-80℃超低溫冷凍箱中備用。

1.3WT1特異性CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)外周血單核細(xì)胞標(biāo)本中的WT1特異性CD8+T細(xì)胞的百分比由流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用抗CD3*甲藻葉綠素蛋白（Peridinin-Chlorophyll-Protein，PerCP）抗體檢測(cè)T細(xì)胞，抗CD8*FITC抗體檢測(cè)CD8+T細(xì)胞，WT1連鎖狀多聚體PE檢測(cè)WT1特異性T細(xì)胞。首先，將0.75 μg連鎖狀多聚體PE和1 μg WT1/MHC加入42 μL IS緩沖液中孵育45 min，取外周血單核細(xì)胞標(biāo)本，獲取細(xì)胞1×107/管，將上述將WT1/MHC準(zhǔn)備液10 μL加入細(xì)胞中，在4℃、避光的條件下孵育45 min。其次，將抗CD3*PerCP抗體、抗CD8*FITC抗體和上述標(biāo)本在4℃、避光的條件下孵育20 min。用PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，所有標(biāo)本至少收集1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，每一個(gè)標(biāo)本都行對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)定義所染細(xì)胞的屬性。為了避免死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，僅對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.4WT1特異性CD8+T細(xì)胞的分選共分為3部分：準(zhǔn)備WT1連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物；標(biāo)記WT1特異性CD8+T細(xì)胞并運(yùn)用MS磁柱將已標(biāo)記的細(xì)胞和未標(biāo)記的非特異性細(xì)胞分離；最后用D-Biotin試劑將連鎖狀多聚體試劑和WT1特異性CD8+T細(xì)胞分離，獲得WT1特異性CD8+T細(xì)胞。

第1部分，將50 μL連鎖狀多聚體磁珠、2 μg WT1/MHC 和90 μL IS緩沖液，在4℃和避光條件下孵育45 min后加入1 mL IS緩沖液。將MS磁柱置于磁場(chǎng)中，用2 mL IS緩沖液沖洗，將上述孵育后的液體注入磁柱分選，未與WT1磁珠結(jié)合的連鎖狀多聚體MHC被洗脫，WT1連鎖狀多聚體MHC-磁珠復(fù)合物滯留于MS磁柱。接著，將MS磁柱移離磁場(chǎng)，加入250 μL IS緩沖液洗脫并收集WT1連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物。將上述WT1連鎖狀多聚體磁珠復(fù)合物與2×107的單核細(xì)胞在4℃和避光條件下外周血孵育45 min，洗滌細(xì)胞，加入1 mL IS緩沖液，準(zhǔn)備分選。

第2部分，將MS磁柱放入磁場(chǎng)，用3 mL IS緩沖液沖洗，將上述細(xì)胞懸液注入磁柱。然后，用1 mL IS緩沖液沖洗3次，未與WT1連鎖狀多聚體磁珠結(jié)合的細(xì)胞可通過磁柱。將磁柱移離磁場(chǎng)，用1 mL IS緩沖液沖洗3次，洗出已經(jīng)標(biāo)記的特異性細(xì)胞，收集備用。

第3部分，將上述與磁珠結(jié)合的細(xì)胞離心、混懸于2 mL IS緩沖液中，加入2 mmol/L D-Biotin在4℃和避光條件下孵育20 min后洗滌。重復(fù)上述步驟1次，之后用5 mL IS緩沖液洗滌4次，收集所得細(xì)胞。

1.5混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)將純化WT1特異性CD8+T細(xì)胞時(shí)收集的陰性細(xì)胞部分照射后，將20 μg WT1肽和2.5 mg/L β2-微球蛋白加入經(jīng)過照射的1 mL含10%AB培養(yǎng)液的陰性細(xì)胞懸液中，在37℃孵育箱中孵化2 h，將WT1特異性CD8+T細(xì)胞與之共培養(yǎng)。于第1天加入2.5 mg/L白細(xì)胞介素（IL）-2和20 μg/L IL-7。第8天，將細(xì)胞取出，取2 mL IS緩沖液洗滌，然后加入200 μL IS緩沖液。如培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，可每周重復(fù)第1天的操作。

1.6細(xì)胞毒性試驗(yàn)WT1特異性CD8+T細(xì)胞特異性殺傷負(fù)載WT1多肽的乳腺癌細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）試驗(yàn)測(cè)定。具體方法是：計(jì)量4T1細(xì)胞，分對(duì)照組（A組）、未加載WT1多肽的試驗(yàn)組（B組）和加載WT1多肽的試驗(yàn)組（C組）3組，C組加入WT1多肽共培養(yǎng)2 h，之后分別加入CFSE，使CFSE終濃度達(dá)到2 μmol/L，37℃染色30 min，PBS洗3次。再與WT1特異性CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，37℃作用4～6 h，E∶T分別為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1。然后，洗滌2次，PI工作液5 μL，避光30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CFSE、PI雙陽(yáng)性的細(xì)胞為被殺傷的靶細(xì)胞，除以靶細(xì)胞總數(shù)，即為殺傷率。

2　結(jié)果

2.1正常外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的含量20例HLA-A2血清陽(yáng)性健康志愿者外周血中均可檢測(cè)到WT1特異性CD8+T細(xì)胞，＞0.5%的有12例，＞1.0%的有4例，見圖1、2。

2.2混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和WT1特異性CD8+T細(xì)胞的純化WT1多肽可以有效地促進(jìn)WT1特異性CD8+T細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞分析了混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后第1、8、14天WT1特異性CD8+T細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，健康志愿者的外周血中經(jīng)過WT1多肽刺激后，WT1特異性CD8+T細(xì)胞的增殖最高可達(dá)10倍左右。同時(shí)，經(jīng)過提純，WT1特異性CD8+T細(xì)胞的純度可從1.61%增至80.18%，最大純度增加近50倍，見圖3。

Fig.1　Frequency of WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of healthy donors圖1　健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的含量

Fig.2　Frequency of WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of 20 samples from HLA-A2 seropositive healthy donors圖2　20例HLA-A2血清陽(yáng)性健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的含量

Fig.3　Purification of WT1-specific CD8+T cells from HLA-A2 seropositive healthy donors圖3　WT1特異性CD8+T細(xì)胞的純化

2.3WT1特異性CD8+T細(xì)胞殺傷乳腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)純化的WT1特異性CD8+T細(xì)胞分別作用于加載WT1多肽的乳腺癌細(xì)胞株4T1和未加載WT1多肽的乳腺癌細(xì)胞株4T1。結(jié)果顯示，WT1特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)WT1多肽加載的乳腺癌細(xì)胞株4T1產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)，而對(duì)WT1多肽未加載的乳腺癌細(xì)胞株4T1的細(xì)胞毒效應(yīng)不明顯，見圖4。

Fig.4　The cytotoxicity analysis of WT1-specific CD8+T cells on breast cancer cells with WT1 peptide圖4　WT1特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)WT1多肽負(fù)載的乳腺癌細(xì)胞株4T1的細(xì)胞毒試驗(yàn)

3　討論

過繼性免疫治療已經(jīng)成為乳腺癌治療的重要方法之一［7-8］，其機(jī)制是移植物抗腫瘤細(xì)胞反應(yīng)。獲得純化的腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞是提高治療效果的關(guān)鍵，同時(shí)可以減少或避免過繼性免疫治療的嚴(yán)重并發(fā)癥即移植物抗宿主反應(yīng)。WT1既是目前非常被重視的靶抗原，又在乳腺癌中高表達(dá)，因此在乳腺癌的免疫治療中有重要價(jià)值［4-5，9］。因此，WT1特異性CD8+T細(xì)胞備受關(guān)注。

直接從外周血中提純抗原特異性CD8+T細(xì)胞的方法簡(jiǎn)單、方便。Gillmore等［10］報(bào)道，通過將遞呈有WT1肽的抗原提呈細(xì)胞在體外刺激由乳腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)分離出的CD8細(xì)胞，能夠檢測(cè)到WT1特異性CD8+T細(xì)胞。Weber等［11］卻從患者和健康志愿者外周血中，經(jīng)過體外WT1肽的刺激、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞克隆得到了WT1特異性CD8+T細(xì)胞。但WT1抗原特異性CD8+T細(xì)胞在外周血中含量很低，其檢測(cè)和純化方法的選擇尤為重要。

本研究結(jié)果顯示，所有健康者外周血中均可檢測(cè)到WT1特異性CD8+T細(xì)胞，12例健康外周血中WT1特異性CD8+T細(xì)胞的含量＞0.5%，其中4例含量＞1%。本研究運(yùn)用了連鎖狀多聚體技術(shù)，其檢測(cè)抗原特異性CD8+T細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）水平［12］，其優(yōu)勢(shì)是不但可以檢測(cè)抗原特異性的T細(xì)胞，而且可將試劑從抗原特異性T細(xì)胞分離，保持了特異性T細(xì)胞原有的功能特性［13］。連鎖狀多聚體技術(shù)純化的WT1特異性CD8+T細(xì)胞的功能狀態(tài)也得到了檢驗(yàn)，其純化的WT1特異性CD8+T細(xì)胞的免疫表型為CD45RA+CCR7-，證實(shí)了其為效應(yīng)T細(xì)胞的功能狀態(tài)［14］，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有潛在的殺傷效應(yīng)。

為了獲得高純度的WT1特異性CD8+T細(xì)胞，本研究進(jìn)行了細(xì)胞增殖培養(yǎng)和純化，結(jié)果顯示，健康志愿者的外周血中經(jīng)過WT1多肽刺激后，WT1特異性CD8+T細(xì)胞的增殖最高可達(dá)10倍左右。同時(shí)，提純后WT1特異性CD8+T細(xì)胞的純度可從1.61%增至80.18%，最大純度增加近50倍，這為腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的免疫治療提供了保障。

WT1特異性CD8+T細(xì)胞的免疫表型證實(shí)了其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有潛在的殺傷效應(yīng)［14］。為了進(jìn)一步檢測(cè)其細(xì)胞毒性，本研究進(jìn)行了CFSE/PI試驗(yàn)，結(jié)果顯示，WT1特異性CD8+T細(xì)胞對(duì)WT1多肽加載的乳腺癌細(xì)胞株4T1產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)，而對(duì)WT1多肽未加載的乳腺癌細(xì)胞株4T1的細(xì)胞毒效應(yīng)不明顯，提示這些殺傷乳腺癌細(xì)胞的毒性效應(yīng)是通過HLA-A2提呈腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性WT1多肽，被T細(xì)胞表面的WT1特異性T細(xì)胞受體特異性識(shí)別來(lái)完成的。

綜上所述，本研究從健康志愿者外周血中檢測(cè)、培養(yǎng)并純化了WT1特異性CD8+T細(xì)胞，通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)探討了其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，這將為乳腺癌過繼性免疫治療提供依據(jù)。當(dāng)然這還需要臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，其安全性也有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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（2015-11-26收稿2016-01-14修回）

（本文編輯陳麗潔）

Experimental study of WT1 specific CD8+T cells in the treatment of breast cancer

WANG Xinchao1，HAO Suhong1，GAO Yingtang2，QIU Lijun1，ZHAO Shuang1，HAN Lu1
1 Department of Breast and Thyroid，the Fourth Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300140，China；2 The Third Central Hospital of Tianjin Corresponding AuthorE-mail:xin-c@hotmail.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of Wilms'tumor gene 1（WT1）-specific CD8+T cells from peripheral blood for the treatment of breast cancer by detecting the killing activity of WT1 specific CD8+T cells on breast cancer cells.MethodsFlow cytometry was used to detect WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of 20 samples from HLA-A2 seropositive healthy donors，which were isolated by WT1/MHC streptamer magnetic beads and cultured.The function of WT1-specific CD8+T cells were analysis by cytotoxicity assay.ResultsTwelve of 20 healthy donors had naive WT1-specific CD8+T-cell frequencies of＞0.5%，and 4 of 20 even＞1.0%of all CD8+T cells.After positive selection by magnetic cell separation，a purity of up to 80%can be achieved.WT1 specific CD8+T cells can specifically kill breast cancer cell line with WT1 polypeptide.ConclusionWT1 specific CD8+T cells can be detected in peripheral blood of healthy volunteers.WT1 specific CD8+T cells have killing effect on breast cancer cells，suggesting the feasibility of adoptive immunotherapy for breast cancer.

Key words：breast neoplasms；immunotherapy，adoptive；CD8-positive T-lymphocytes；Wilms'tumor gene 1；cell immunotherapy

中圖分類號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150353

基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（12KG109）

作者單位：1天津市第四中心醫(yī)院（郵編300140）；2天津市第三中心醫(yī)院

作者簡(jiǎn)介：王新超（1969），男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事甲狀腺、乳腺疾病和腫瘤免疫治療方面的研究

通訊作者E-mail:xin-c@hotmail.com