甘向東， 黃　銳， 李　飛， 王嘉璽， 刁愛坡*， 龍民慧*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

?

重組綠豆LBBI的制備及其對(duì)小鼠的輻射防護(hù)作用

甘向東1， 黃銳1， 李飛2， 王嘉璽2， 刁愛坡1*， 龍民慧1*

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

摘要：在證實(shí)了綠豆胰蛋白酶抑制重組綠豆LBBI活性為689 U/mg的基礎(chǔ)上，研究了重組綠豆LBBI蛋白對(duì)小鼠輻射損傷的防護(hù)作用.該研究把60只BALB/c小鼠分為3組(n=20)，即生理鹽水組、重組LBBI注射組和安多霖灌胃組，60 Coγ射線源，對(duì)小鼠進(jìn)行一次性照射劑量為6.5 Gy全身照射，0.5 h后，對(duì)各組小鼠分別注射生理鹽水、LBBI(50.0 mg·kg-1·d-1)和灌胃給藥安多霖(3 g·kg-1·d-1)，每隔24 h給藥1次，連續(xù)給藥1周，觀察小鼠成活率及外周血象恢復(fù)的情況.結(jié)果顯示：與生理鹽水組小鼠相比，重組LBBI組和安多霖組小鼠的30 d存活率明顯增高(P<0.01)，平均生存時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.01)，小鼠外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)目明顯增加(P<0.05).說(shuō)明重組LBBI蛋白具有治療輻射損傷的作用.

關(guān)鍵詞：重組LBBI； 表達(dá)； 純化； 存活率； 抗輻射

輻射已成為繼水、大氣、噪音污染之后的第四大污染[1]，預(yù)防和減輕輻射損傷的藥物研發(fā)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[2-4].近年來(lái)，抗輻射藥物研究已取得顯著成績(jī)，如氨硫基類、蛋白類、激素類和中草藥類等防護(hù)劑[5-7]，但在臨床的應(yīng)用中存在許多不足，如含硫類防護(hù)藥效雖高但毒性大，雌激素類防護(hù)藥在使用的過程中出現(xiàn)副作用.蛋白類防護(hù)藥物因其來(lái)源廣泛、無(wú)毒、代謝產(chǎn)物是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、無(wú)蓄積作用等，受到廣泛關(guān)注[8].植物類胰蛋白酶抑制劑多數(shù)為多肽或蛋白質(zhì)，它對(duì)胰蛋白酶、溶酶體酶、纖溶酶等蛋白酶均有抑制作用.綠豆胰蛋白酶抑制劑屬于Bowman-Birk類胰蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk inhibitor, 簡(jiǎn)稱BBI)[9].BBI可以防護(hù)正常纖維細(xì)胞輻射損傷造成的放射性纖維化[10]，顯示BBI可能具有抗輻射的保護(hù)作用.我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，綠豆BBI在大腸桿菌中可溶性表達(dá)(結(jié)果待發(fā)表).本研究擬通過基因工程的方法獲得重組綠豆LBBI蛋白，通過與安多霖處理進(jìn)行比較，得到其對(duì)小鼠經(jīng)60 Coγ輻射損傷具有治療效果和輻射保護(hù)作用，為臨床抗輻射損傷藥物研究提供新思路.

1材料與方法

1.1材料

菌株：由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存重組LBBI表達(dá)菌株 pet32a-LBBI；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)BALB/c小鼠60只，雄性，6～8周，體質(zhì)量18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；大豆BBI、苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺(簡(jiǎn)稱BAPNA)、氨芐青霉素購(gòu)自sigma公司；所用純化儀器為AKTA FPLC蛋白純化系統(tǒng)；分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司(DU640型):電泳儀與垂直電泳槽購(gòu)自天能公司(600PJ型)；His·Bind Resin Ni-charged購(gòu)自Novagen.

1.2方法

1.2.1重組LBBI蛋白的表達(dá)及分離純化將含有重組質(zhì)粒pET32a-LBBI的大腸桿菌BL21(DE3)活化，并按1∶50接種于1 L LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.4左右，加入0.5 mmol/L IPTG 震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6 h，4 ℃ 8 000 r/min 10 min離心收集菌體.加入50 mL 0.01 mol/L PBS重懸，冰上超聲破碎(開5 s,關(guān)15 s)5 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，將上清保留.根據(jù)His·Bind Resin Ni-charged說(shuō)明書純化目的蛋白.(1)取1 mL鎳瓊脂糖凝膠預(yù)裝柱，加4倍柱體積的ddH2O洗柱；(2)6倍柱體積的1×Charge Buffer洗柱；(3)4倍柱體積的1×Bind Buffer(含8 M 尿素)平衡柱子；(4)取上述上清液以0.5 mL/min上樣，反復(fù)上樣；(5)9倍柱體積的1×Bind Buffer(含8 mol/L尿素)洗去未吸附的樣品，流速0.5 mL/min，2 mL管收集；(6)6倍柱體積的1×Wash Buffer(含8 mol/L 尿素)洗去雜質(zhì)，流速0.5 mL/min；(7)4倍柱體積的1×Elution Buffer(分別含20、50、100、250、500 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)梯度洗脫目的蛋白，流速0.5 mL/min，2 mL管收集；(8)收集的蛋白用12.5%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純化蛋白的濃度.最后將柱子存于20%乙醇中4 ℃保存.

1.2.2重組LBBI蛋白的活性測(cè)定[11]BBI抑制劑對(duì)胰蛋白酶的抑制活性通過底物BAPNA的水解速率測(cè)定.在3.5 mL活性測(cè)定體系中(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0，含10 nmol/L CaCl2)，一定量的抑制劑(sigma)和100 mmol/L胰蛋白酶(sigma)于37 ℃溫育10 min.加入20 μL 250 mmol/L BAPNA，溫浴10 min后加入200 μL 33%的HAc溶液停止反應(yīng).分光光度計(jì)在410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定體系中底物水解產(chǎn)物產(chǎn)生的吸光值.抑制活力單位定義為在上述條件下，反應(yīng)體系加入抑制劑樣品后，410 nm處吸光度每降低0.1為1個(gè)胰蛋白酶抑制活力單位(U).

取0.9 mg大豆BBI溶于 2 mL雙蒸水中，稀釋100倍即為胰蛋白酶抑制劑稀釋液；同樣方法配制純化后的重組綠豆LBBI稀釋液.分別取上述2種稀釋液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL稀釋至1.0 mL.按上述方法測(cè)定溶液吸光度，并以胰蛋白酶抑制劑(Sigma)為標(biāo)準(zhǔn)品作胰蛋白酶抑制劑的量與吸光度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算重組LBBI活力單位.

1.2.3輻射損傷模型的建立及輻射后的治療作用將60只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，即生理鹽水對(duì)照組、LBBI治療組和陽(yáng)性對(duì)照(安多霖)組，每組動(dòng)物20只.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院60 Coγ射線源照射，照射距離為4 m，照射劑量率為240.26 cGy/min；一次全身照射劑量6.5 Gy[12].在照射后0.5 h各組分別給藥，其中LBBI(50.0 mg·kg-1·d-1)組尾靜脈給藥，生理鹽水對(duì)照組尾靜脈注射同劑量生理鹽水，安多霖(3 g·kg-1·d-1)組經(jīng)灌胃給藥，每隔24 h給藥1次，連續(xù)給藥1周.每隔3 d取小鼠尾靜脈血10 μL送至北京中同藍(lán)博臨床檢驗(yàn)所檢測(cè)白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板指標(biāo)，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察30 d，并統(tǒng)計(jì)小鼠的存活率.

1.3數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，外周血象數(shù)據(jù)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用ANOVA一元方差分析方法[13]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2結(jié)果與分析

2.1重組綠豆LBBI蛋白的表達(dá)純化

重組LBBI蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)His·Bind Resin Ni-charged親和層析柱純化，用12% SDS-PAGE檢測(cè)，證實(shí)在2.8×104有1條目的條帶(圖1)，將純化后蛋白樣品保存于-20 ℃.通過薄層掃描分析(TLC Scanner 3)表明其純度在87%以上.

1、4:蛋白marker；2:空載體；3:重組LBBI蛋白；5、6:純化蛋白.空心箭頭表示目的蛋白條帶.

圖1重組綠豆LBBI蛋白的表達(dá)純化

Figure 1Expression and purification of recombinant mung bean LBBI

2.2重組綠豆蛋白BBI的抑制活性

利用Bowman-Birk 型胰蛋白酶抑制劑(BBI)標(biāo)準(zhǔn)品抑制底物被BAPNA水解速率制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度增高吸光度越小，但吸光度變化值越大，水解酶被抑制率增高，呈現(xiàn)出線性依賴關(guān)系(表1)，繪制抑制劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合后大豆胰蛋白酶抑制劑的回歸方程：y=-0.388 1x+0.382 4，R2=0.991 8；曲線相關(guān)性良好，即作為綠豆LBBI活性的分析依據(jù).根據(jù)計(jì)算，大豆BBI標(biāo)準(zhǔn)品活性為956 U/mg.同樣的方法對(duì)綠豆胰蛋白酶抑制劑重組LBBI的活性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，重組綠豆蛋白LBBI抑制劑的回歸方程：y=0.380 4-0.374 5x，R2=0.991 5.計(jì)算綠豆胰蛋白酶抑制劑重組LBBI活性為：689 U/mg.

表1　胰蛋白酶抑制劑(BBI)對(duì)被水解酶抑制的影響

2.3照射后小鼠的存活率

生理鹽水處理(對(duì)照組)的小鼠在照射后10 d時(shí)出現(xiàn)大量死亡，存活率約20%；13 d內(nèi)僅存活2只，而安多霖組、重組LBBI組照射后分別存活6只和9只小鼠. 30 d 存活率分別為 10%、30%、45%，各組死亡小鼠平均生存時(shí)間分別為 13.45±1.57、19.75±2.24、24.80±3.09 d(表2).可見，LBBI在照射后早期給藥可以提高被照射小鼠30 d存活率(P<0.01)，明顯延長(zhǎng)死亡動(dòng)物的平均生存時(shí)間(P<0.01)，其中LBBI組活存率最高(45%)，其平均生存時(shí)間也明顯長(zhǎng)于其他2組(P<0.01)(圖2).

Table 2Effect of 60 Co γ-ray on survival rate and average survival time of mice treated with LBBI

處理死亡數(shù)生存時(shí)間/d30d存活率/%對(duì)照13.45±1.5710安多霖19.75±2.24*30LBBI24.80±3.09*45

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01.

圖2　LBBI對(duì) 60 Coγ 照射后小鼠存活率的影響

Figure 2Effect of 60 Co γ-ray on survival rate of mice treated with LBBI

2.4重組LBBI對(duì)60 Coγ 照射小鼠外周血象恢復(fù)的影響

對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)在照射后1 d開始下降，第12 d降至最低值，隨后開始緩慢回升.安多霖組和LBBI組白細(xì)胞的變化規(guī)律基本一致，均在照射后5 d開始逐漸恢復(fù)，且在照射后9和12 d明顯高于對(duì)照組(*P<0.05)(圖3).

對(duì)照組小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)在照射后急劇下降，13 d時(shí)達(dá)最低值，隨后開始逐漸回升，第20天時(shí)紅細(xì)胞數(shù)回復(fù)到照前值的50%.安多霖組和LBBI組紅細(xì)胞的變化規(guī)律基本一致，均在照后12 d后開始逐漸回升，且在照射后12、16 d時(shí)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(圖4).

對(duì)照組動(dòng)物外周血小板數(shù)在照射后下降，第9天達(dá)最低值，隨后開始回升，照射后第20天恢復(fù)至照前值(90%).2個(gè)治療組的血小板變化規(guī)律均與對(duì)照組一致，其中安多霖組、LBBI組最低值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，在照射后9、12和16 d時(shí)明顯高于對(duì)照組(*P<0.05)(圖5).

圖3　LBBI對(duì)60 Coγ照射后小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

Figure 3Effect of 60 Co γ-ray on white blood cells of mice treated with LBBI

圖4　LBBI對(duì)60 Coγ 照射后小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)的影響

Figure 4Effect of 60 Co γ-ray on red blood cells of mice treated with LBBI

圖5　LBBI對(duì)60 Coγ 照射后小鼠外周血血小板數(shù)的影響

Figure 5Effect of 60 Co γ-ray on blood platelets of mice treated with LBBI

3討論

目前，動(dòng)物與植物來(lái)源的蛋白酶抑制劑在臨床可用于治療腫瘤、血栓、胰腺炎等疾病[14].有臨床試驗(yàn)證據(jù)顯示該類蛋白酶抑制劑在放化療的過程中能夠降低輻射引發(fā)的機(jī)體損傷[15].天然的綠豆胰蛋白酶抑制劑是蛋白酶抑制劑的一種，它的成熟肽由72個(gè)氨基酸組成，并含有7對(duì)二硫鍵[16]，二硫鍵在機(jī)體內(nèi)可被硫氫還原蛋白還原酶降解形成-SH基，-SH基能夠有效地清除多種自由基，而輻射損傷會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生自由基.綠豆胰蛋白酶抑制劑有可能成為抗輻射的候選藥物.其在植物種子中含量低，制備繁瑣.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠經(jīng)濟(jì)高效制備外源蛋白，利用該系統(tǒng)是生物制藥的重要手段.本文制備了具有生物活性的重組綠豆LBBI.

存活率是反映抗輻射損傷作用最基本、最客觀的綜合性指標(biāo)[17]，重組綠豆LBBI是否具有抗輻射的作用可用存活率來(lái)評(píng)價(jià).本研究運(yùn)用致死劑量對(duì)小鼠進(jìn)行照射.與對(duì)照組相比，輻射損傷小鼠在劑量為50.0 mg/(kg·d)的重組LBBI治療后小鼠的存活率顯著性提高，平均生存時(shí)間也明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；同時(shí)，證實(shí)了綠豆LBBI與安多霖相比在治療輻射損傷中沒有顯著性差異(P>0.05).造血干細(xì)胞具有很高的輻射敏感性，受照射后其數(shù)量急劇減少，導(dǎo)致外周血中成熟血細(xì)胞來(lái)源匾乏[18].因此，外周血的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞的數(shù)量會(huì)出現(xiàn)不同程度的降低.筆者的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小鼠經(jīng)60 Coγ照射后它們的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞數(shù)量均明顯下降(P<0.05)；但與對(duì)照組相比，綠豆LBBI不僅能顯著抑制小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)量的減少(P<0.05)，而且還能明顯提高血相的恢復(fù).提示LBBI對(duì)受60 Coγ照射小鼠的血液系統(tǒng)具有保護(hù)作用.總之，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)LBBI具有較好的防輻射功效，可開發(fā)成相關(guān)的抗輻射新藥，同時(shí)也為防輻射藥物研發(fā)提供新思路.

參考文獻(xiàn)：

[1]汪磊，朱波，王國(guó)澤，等．肽和蛋白抗輻射損傷作用研究進(jìn)展[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(18)：233．

WANG L，ZHU B，WANG G Z，et al．The research in the anti-radiation damage effects of peptide and protein[J]．Guangdong Agricultural Sciences，2012(18)：233．

[2]METREVELI N O，JARIASHVILI K K，NAMICHEISHVILI L O，et al．UV-vis and FT-IR spectra of ultraviolet irradiated collagen in the presence of antioxidant ascorbic acid[J]．Ecotoxicology and Environmental Safety，2010，73(3)：448-455．

[3]ALMEIDA I F，PINTO A S，MONTEIRO C，et al．Protective effect ofC.sativaleaf extract against UV mediated-DNA damage in a human keratinocyte cell line[J]．The Journal of Photochemistry and Photobiology B，2015，144：28-34．

[5]KOUVARIS J R， KOULOULIAS V E，VLAHOS L J．Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector[J]．Oncologist，2007，12(6)：738-47．

[6]文鏡，趙建，畢欣，等．金屬硫蛋白抗輻射的實(shí)驗(yàn)研究[J]． 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，23(1)：44-46．

WEN J, ZHAO J, BI X, et al. The experimental study on anti-radiation effect of metallothionein[J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2001，23(1)：44-46．

[7]STICKNEY D R，DOWDING C，AUTHIER S，et al．5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]．International Immunopharmacology，2007，7(4)：503．

[8]ATAMAN O U，SAMBROOK S J，WILKS C，et al．The clinical development of molecularly targeted agents in combination with radiation therapy: a pharmaceuticalperspective[J]．International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics，2012，84(4)：e447-e454．

[9]HOUT R V D, POUW M, GRUPPEN H, et al．Inactivation kinetics study of the kunitz soybean trypsin inhibitor and the bowman-birk inhibitor[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(1)：282．

[10]DITTMANN K，L?FFLER H，BAMBERG M，et al．Bowman-Birk proteinase inhibitor (BBI) modulates radiosensitivity and radiation-induced differentiation of humanfibroblasts in culture[J]．Radiotherapy and Oncology，1995，34(2)：137-143．

[11]COSTA H M，F(xiàn)REITAS JUNIOR A C，AMARAL I P，et al．Metal-sensitive and thermostable trypsin from the crevalle jack (Caranxhippos) pyloric caeca: purification and characterization[J]．Chemistry Central Journal，2013，7：6．

[12]LI Q，SUN H，XIAO F，et al．Protection against radiation-induced hematopoietic damage in bone marrow by hepatocyte growth factor gene transfer[J]．International Journal of Radiation Biology，2014，90(1)：37．

[13]ASSAAD H I， ZHOU L， CARROLL R J，et al．Rapid publication-ready MS-Word tables for one-way ANOVA[J]．Springerplus， 2014，3(1)：1-8．

[14]SCOTT C J，TAGGART C C．Biologic protease inhibitors as novel therapeutic agents[J]．Biochimie，2010，92(11)：1681-1688．

[15]RENGAN R，MICK R，PRYMA D，et al．A phase I trial of the HIV protease inhibitor nelfinavir with concurrent chemoradiotherapy (CT-RT) for unresectable stage IIIA/IIIB non-small cell lung cancer: a report of toxicities and clinical response[J]．Journal of Thoracic Oncology，2012，7(4)：709-715．

[16]QI R F，SONG Z W，CHI C W．Structural features and molecular evolution of Bowman-Birk protease inhibitors and their potential application[J]．Acta Biochimicaet Biophysica Sinica，2005，37(5)：283-292．

[17]HU Z Q，XING Y L，QIAN Y Y，et al．Anti-radiation damage effect of polyethylenimine as a toll-like receptor 5 targeted agonist[J]．Journal of Radiation Research，2013，54(2)：247．

[18]TANORI M， PASQUALI E，LEONARDI S， et al．Developmental and oncogenic radiation effects on neural stem cells and their differentiating progeny in mouse cerebellum[J]．Stem Cells，2013，31(11)：2507．

【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Preparation of the Recombinant Mung Bean LBBI and Defense of Anti-Radiation in Mice

GAN Xiangdong1, HUANG Rui1, LI Fei2, WANG Jiaxi2, DIAO Aipo1*, LONG Minhui1*

(1. College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Laboratory of Genomic Engineering, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Abstract：On the basis of the confirmed inhibitory activity of the recombinant mung bean LBBI (689 U/mg), the therapeutical effect of recombinant mung bean LBBI protein on radiation injury of mice was investigated. The 60 BALB/c mice were randomly divided into normal saline control, recombinant LBBI and anduolin groups, all of which were irradiated with 60 Coγ at 6.5 Gy for whole body. Half an hour latter, the mice in every group received intravenous injection with normal saline and LBBI (50.0 mg·kg-1·d-1), and intragastric administration with anduolin (3 g·kg-1·d-1) for first time. The treatments were carried out every 24 h for one week. Then, the survival rate and peripheral hemogram recovery of mice were observed. The results indicated that compared to the normal saline group, the 30 days survival rate of group mice injected with LBBI protein was increased significantly (P<0.01), and its average survival time was prolonged (P<0.01). It was confirmed that the number of red blood cell, white blood cells and platelets in LBBI treated group mice were increased significantly than that of normal saline group (P<0.05). This work indicates that the recombinant LBBI can prevent mice from radiation injury.

Key words：recombinant mung bean LBBI; expression; purification; survival rate; anti-radiation

收稿日期：2015-06-19《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271476)

*通訊作者:龍民慧，副研究員，Email:longminhui2006@126.com；刁愛坡，研究員，Email:Diaoaipo@tust.edu.cn.

中圖分類號(hào)：R963

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1000-5463(2016)01-0079-05