楊永棟 俞興 高譽(yù)珊

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丹參酮 IIA 磺酸鈉靜脈注射對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響

楊永棟 俞興 高譽(yù)珊

【摘要】目的 探索丹參酮 IIA 對脊髓挫傷大鼠后肢神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其作用機(jī)制。方法 將45 只 SD 大鼠隨機(jī)分為4組（對照組、模型組、丹參酮IIA組、甲潑尼龍組）：對照組（僅切除椎板，尾靜脈注射生理鹽水 1ml/天，連續(xù) 7 天）。模型組（使用 NYU 脊髓打擊器選擇25mm高度造成T9脊髓節(jié)段挫傷，術(shù)后予尾靜脈注射生理鹽水1ml/天，連續(xù)7天）。丹參酮IIA組（造模成功后即刻予尾靜脈注射丹參酮 IIA 磺酸鈉注射液20mg/kg/天，連續(xù)給藥7天）。甲潑尼龍組（造模成功后即刻予尾靜脈注射甲潑尼龍 30 mg/kg，僅給藥1次）。采用曠場實(shí)驗(yàn) [Basso，Beattie，and Bresnahan（BBB）open field locomotor test]和熱板實(shí)驗(yàn)評價各組大鼠后肢神經(jīng)功能的恢復(fù)。在術(shù)后1、4、8周進(jìn)行心臟灌注固定并取材 T9脊髓，HE染色、尼氏染色觀察挫傷脊髓局部組織結(jié)構(gòu)的變化，同時通過免疫組化法標(biāo)記各組脊髓中的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果（1）術(shù)后3天，丹參酮IIA組（1.91±0.31）和甲潑尼龍組（3.10±0.41）大鼠后肢運(yùn)動功能較模型組（0.89±0.26）都有顯著改善，且甲潑尼龍組改善更明顯（P＜0.05）；至術(shù)后8周，甲潑尼龍組（17.00±0.41）運(yùn)動功能改善仍然較丹參酮IIA組（15.50±0.43）更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）術(shù)后3天，甲潑尼龍組（4.06±0.26）感覺功能恢復(fù)較丹參酮IIA組（4.59±0.71）快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后2周開始，丹參酮IIA組（3.06±0.13）表現(xiàn)出了比甲潑尼龍組（3.14±0.13）更明顯的改善趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（3）術(shù)后1周，除對照組，余各治療組部分巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由分支狀變?yōu)闂U狀或圓狀，其中丹參酮IIA組和甲潑尼龍組形態(tài)改變的細(xì)胞較少，丹參酮IIA組（11.61±2.64）和甲潑尼龍組（11.88±1.47）陽性細(xì)胞累積光密度（integrated optical density，IOD）較模型組（27.22±3.04）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（4）術(shù)后8周，除對照組，余各組巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)大部分轉(zhuǎn)變?yōu)榉种睿渲械⑼狪IA組（2.89±0.12）和甲潑尼龍組（2.93±0.15）大鼠陽性細(xì)胞IOD較模型組（1.58±0.20）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論（1）丹參酮IIA能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動、感覺功能恢復(fù)；（2）丹參酮 IIA 能夠促進(jìn)巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)恢復(fù)的有利影響。

【關(guān)鍵詞】丹參酮；脊髓損傷；神經(jīng)膠質(zhì)；神經(jīng)系統(tǒng)

脊髓損傷的病理機(jī)制包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷僅局限于特定的區(qū)域，主要表現(xiàn)為急性出血和局部缺血。而繼發(fā)性損傷以神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的破壞為特征，導(dǎo)致了病變范圍的明顯擴(kuò)大，進(jìn)而影響到了脊髓的相鄰節(jié)段。然而繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的后果在脊髓損傷后占主導(dǎo)地位。繼發(fā)性損傷包括延遲事件如局部缺血，脂質(zhì)降解，自由基形成，興奮性毒性和蛋白酶釋放，進(jìn)而導(dǎo)致了脫髓鞘，軸突變性，神經(jīng)元死亡，空洞形成，以及初始損傷區(qū)域形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕。

既往的研究表明早期治療可以改善神經(jīng)功能的恢復(fù)[1]。迄今為止，還沒有成熟的治療方法能夠?qū)ι窠?jīng)學(xué)的結(jié)果產(chǎn)生直接的治療作用。近年來很多基礎(chǔ)科學(xué)、實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究都致力于防止繼發(fā)性損傷，促進(jìn)再生[2]。

甲潑尼龍作為一種糖皮質(zhì)激素，是目前臨床上惟一被批準(zhǔn)可用于脊髓損傷治療的藥物，但它并沒有表現(xiàn)出顯著的效果。與此同時，在臨床使用過程中，甲潑尼龍?jiān)诖髣┝浚?0 mg/kg）靜脈給藥后常常會出現(xiàn)明顯的副作用[3-4]，對體液與電解質(zhì)，肌肉骨骼系統(tǒng)，消化道，皮膚等都產(chǎn)生嚴(yán)重影響。2015 年，筆者對就丹參酮 IIA 對脊髓挫傷大鼠后肢神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF級成年雌性 SD（Sprague-Dawley）大鼠45 只，體重220～250g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動物房。3～4只一籠，予12h光照，水和食物無限制按時供應(yīng)。隨機(jī)分為4組（對照組、模型組、丹參酮IIA組、甲潑尼龍組）。對照組（僅切除椎板，尾靜脈注射生理鹽水1ml/天，連續(xù)7天）。模型組（使用NYU脊髓打擊器選擇25mm高度造成 T9脊髓節(jié)段挫傷，術(shù)后予尾靜脈注射生理鹽水 1 ml/天，連續(xù)7天）。丹參酮IIA組（造模成功后即刻予尾靜脈注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液20mg/kg/天，連續(xù)給藥7天）。甲潑尼龍組（造模成功后即刻予尾靜脈注射甲潑尼龍30mg/kg，僅給藥1次）。

二、主要試劑

蘇木素、伊紅染液，焦油紫染液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；兔抗鼠 Iba1 抗體（Wako，日本），即用型免疫組織化學(xué) UltrasensitiveTMSP 試劑盒（福州邁新）。

三、損傷模型制作及取材

10%水合氯醛0.33ml/100g 腹腔注射麻醉，俯臥位固定后背部正中切口顯露 T9～11椎板，咬除椎板后暴露 T9段脊髓，使用NYU脊髓打擊器選擇25mm的高度打擊T9段脊髓背側(cè)，逐層縫合切口。術(shù)后1、4、8周取材，麻醉后采用4%多聚甲醛經(jīng)主動脈灌注固定，找到損傷脊髓節(jié)段后剪取5mm，后固定過夜后石蠟包埋。

四、神經(jīng)功能評價

通過曠場實(shí)驗(yàn) [Basso，Beattie，and Bresnahan（BBB）open field locomotor test]于術(shù)后1、3、7天，2、3、4周共6個時間點(diǎn)，評價大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)情況。采用熱板實(shí)驗(yàn)法于術(shù)后3、7天，2、4周共4個時間點(diǎn)，記錄大鼠后肢對熱痛刺激的反應(yīng)時間。

五、脊髓組織病理學(xué)觀察

制作石蠟切片，以損傷部位為中心上下切取6μm、9μm厚切片各6片。6μm厚切片用于HE染色，9μm切片進(jìn)行尼氏染色。光鏡觀察拍照后使用Image-Pro Plus（IPP）6.0病理分析軟件測量各組大鼠脊髓背側(cè)形成空洞面積，并計(jì)算出空洞面積占正常脊髓組織面積的比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

六、免疫組織化學(xué)檢測脊髓組織中小膠質(zhì)細(xì)胞

切片脫蠟至水，0.01M PBS 沖洗，枸櫞酸熱修復(fù)后0.01M PBS 沖洗，加H2O210min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 M PBS 沖洗后加山羊血清10min后甩去，加一抗（anti-Iba1，1:1000）50μl，放入濕盒后4°冰箱過夜；0.01M PBS 沖洗后加二抗10min，0.01M PBS 洗凈后加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶 10 min，0.01 M PBS 沖洗后加 DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，乙醇逐級脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡觀察并拍照，采用 IPP 6.0病理分析軟件計(jì)數(shù)各組大鼠脊髓組織中陽性細(xì)胞的面積（area）、平均光密度（density）、累積光密度 IOD（integrated optical density），IOD=density（mean）* area，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行對照組和各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、后肢運(yùn)動功能評價結(jié)果

大鼠脊髓損傷后即出現(xiàn)后肢痙攣性癱瘓，隨時間推移，后肢運(yùn)動功能出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。和模型組相比，丹參酮IIA組和甲潑尼龍組大鼠后肢運(yùn)動功能都有顯著改善（P＜0.05），但甲潑尼龍組改善更明顯（P＜0.05）（圖1，表1）。

二、后肢感覺動能評價結(jié)果

脊髓損傷后大鼠足底對熱痛刺激的感覺明顯下降，反應(yīng)時間較對照組顯著增加。損傷后3天，模型組大鼠對熱痛刺激的反應(yīng)時間最長，丹參酮IIA組和甲潑尼龍組反應(yīng)時間較模型組短，即感覺更敏感，且此時甲潑尼龍組較丹參酮 IIA 組更短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。損傷后7天，丹參酮IIA組和甲潑尼龍組對熱痛刺激的反應(yīng)時間越來越接近，在損傷后2～4周，丹參酮IIA組表現(xiàn)出比甲潑尼龍組反應(yīng)時間更短的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，模型組大鼠盡管反應(yīng)時間一直較丹參酮IIA組和甲潑尼龍組長，但在損傷后2周內(nèi)也較之前明顯改善，在損傷后2～4周反應(yīng)時間不斷接近兩個治療組（圖2，表2）。

三、脊髓損傷后4周各組大鼠脊髓組織病理學(xué)改變

圖1　曠場實(shí)驗(yàn)Fig.1 Open feld locomotor test

表1　各組大鼠術(shù)后不同時間 BBB 評分（x- ± s）Tab.1　BBB scores in the sham and experimental groups（x- ± s）

表2　各組大鼠術(shù)后不同時間對熱痛刺激的反應(yīng)時間（x- ± s）Tab.2　Reaction time to heat pain in the sham and experimental groups（x- ± s）

圖2　熱板實(shí)驗(yàn)Fig.2　Hot plate test

1.脊髓損傷后4周大鼠脊髓局部組織結(jié)構(gòu)的變化：脊髓損傷后隨著繼發(fā)性損傷的發(fā)展，背側(cè)損傷區(qū)域脊髓組織壞死和逐漸形成空洞，損傷后4周，模型組大鼠脊髓背側(cè)空洞面積占正常組織面積的0.059±0.006（圖3b），丹參酮 IIA 組為 0.03±0.005（圖3c），甲潑尼龍組0.012±0.001（圖3d），丹參酮IIA組和甲潑尼龍組空洞面積比例較模型組明顯減小（P＜0.05）（圖3）。

2.脊髓損傷后4周各組脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元的變化：對照組前角運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量較多，尼氏體清晰可見，細(xì)胞核明顯（圖4a）；模型組前角運(yùn)動神經(jīng)元較多壞死，尼氏體溶解消失形成小空洞，細(xì)胞核固縮變?。▓D4b）；丹參酮IIA組和甲潑尼龍組神經(jīng)結(jié)構(gòu)較清晰，少量神經(jīng)元壞死，尼氏體溶解后形成空洞較少，細(xì)胞質(zhì)分布均勻（圖4c～d）。

四、丹參酮IIA對脊髓損傷后局部脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞變化的影響

1.脊髓損傷后7天各組脊髓組織中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的變化：對照組脊髓中可見分枝狀的巨噬 /小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5a）。在損傷初期（7天），模型組、丹參酮 IIA組、甲潑尼龍組巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生明顯改變，胞體肥大呈圓形或桿狀，突起回縮，其中模型組細(xì)胞形態(tài)改變的比例最高，活化的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多（圖5b～d）；丹參酮IIA組和甲潑尼龍組活化的吞噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞 IOD較模型組明顯減?。≒＜0.05）。

2.脊髓損傷8周后各組大鼠脊髓組織中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的變化：損傷后期（8 周），各組大鼠巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)大部分轉(zhuǎn)變?yōu)榉种?，仍有小部分呈桿狀或圓狀。丹參酮 IIA 組和甲潑尼龍組巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞IOD較模型組明顯增加（P＜0.05），且其中形態(tài)呈圓狀或桿狀細(xì)胞數(shù)量較多（圖6）。

表3　各組大鼠脊髓損傷-后不同時間脊髓組織中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞累積光密度（IOD）（± s）Tab.3　IOD of macropha-ges/microglia in spinal cord in the sham and experimental group（± s）

表3　各組大鼠脊髓損傷-后不同時間脊髓組織中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞累積光密度（IOD）（± s）Tab.3　IOD of macropha-ges/microglia in spinal cord in the sham and experimental group（± s）

注：a與對照組相比，P＜0.05；b與模型組相比，P＜0.05Notice:aDenotes when compared with that of the sham group； P ＜ 0.05，bDenotes when compared with that of the SCI group

組別　7 天　8 周對照組（Sham）　 7.89±1.68　8.14±0.90模型組（SCI）　27.22±3.04b　1.58±0.20a丹參酮 IIA 組（SCI/TIIA）　11.61±2.64a　2.89±0.12b甲潑尼龍組（SCI/MP）　11.88±1.47a　2.93±0.15a

圖3　術(shù)后4周大鼠脊髓背側(cè)空洞（Bar=200 μm）Fig.3 The cavity formed in the dorsal spinal cord 4 weeks after surgery（Bar=200 μm）

圖4　術(shù)后4周脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元形態(tài)變化（Bar=50μm）Fig.4 Morphological changes of anterior horn motor neurons 4 weeks after surgery（Bar=50μm）

討　　論

近年來，隨著交通工具和城市建設(shè)的迅猛發(fā)展，交通事故和高空墜落成為導(dǎo)致脊髓損傷最主要的原因，呈現(xiàn)出不完全損傷逐年升高的趨勢。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了脊髓挫傷的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，模擬了撞擊及高處墜落時引起脊髓挫傷的病理過程。自 1911 年 Allen 首次報(bào)道了大鼠脊髓挫傷的動物模型以來，經(jīng)過了多次的改良，現(xiàn)在使用最為廣泛的是美國紐約大學(xué)改良后生產(chǎn)的脊髓打擊裝置 NYU Impactor[5]，它將脊髓打擊的過程標(biāo)準(zhǔn)化，并作了一系列的參數(shù)測量，根據(jù)需要損傷的不同程度，可選擇12.5mm、25mm、50mm、75mm等不同的高度，為研究者們根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的損傷程度，并較為客觀的得出評價結(jié)果提供了較好的參考。

評價大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的方法主要包括3個方面，即神經(jīng)電生理、形態(tài)學(xué)和運(yùn)動功能評定。曠場實(shí)驗(yàn)（BBB評分）一直以來是大鼠運(yùn)動功能評定最常用的方法，可操作性強(qiáng)，評價相對客觀，能夠較好的反映損傷后3個階段的功能恢復(fù)程度：早期（≤7分）表現(xiàn)為沒有或者只有輕微的后肢活動，但不能夠負(fù)重；中期（～13分）表現(xiàn)為可以負(fù)重，但不能夠協(xié)調(diào)運(yùn)動；晚期（～21分）表現(xiàn)為可持續(xù)負(fù)重，且運(yùn)動協(xié)調(diào)。熱板實(shí)驗(yàn)常用于鎮(zhèn)痛藥物的實(shí)驗(yàn)研究，在這里用于測量大鼠脊髓損傷后不同時間點(diǎn)足底的疼痛閾值，相對客觀地評價了脊髓損傷大鼠后肢感覺功能的恢復(fù)情況。

新聞的負(fù)面性和一致性價值也可以通過使用其他敘事特征來實(shí)現(xiàn)。薩默斯和吉布森指出，敘事是按照一定的評判標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建的。這些標(biāo)準(zhǔn)能夠?qū)崿F(xiàn)并指導(dǎo)有選擇地采用一系列事件或元素，而這些事件或元素源自構(gòu)成該經(jīng)歷的各種開放的和重復(fù)出現(xiàn)的事件。（轉(zhuǎn)引自Baker 2006：71）因果情節(jié)設(shè)置使我們能夠權(quán)衡和解釋事件，并將一系列命題轉(zhuǎn)變?yōu)榭山庾x的排序，以便使我們從中提煉出觀點(diǎn)。（ibid.：67）

迄今為止，臨床上用于脊髓損傷治療的藥物只有甲潑尼龍，但甲潑尼龍的大劑量使用有諸多副作用，丹參酮IIA磺酸鈉作為丹參酮IIA的水溶性衍生物，有著類似的生物活性和藥物代謝過程，臨床上已用于治療心梗和冠脈疾病多年，相對來說副作用少，安全性強(qiáng)。

1. 脊髓損傷的病理過程：Zhou等[6]根據(jù)之前的研究，把脊髓損傷分為了4個具體的過程：（1）原發(fā)性機(jī)械損傷：以直接打擊造成血管痙攣和細(xì)胞死亡為特征；（2）損傷蔓延：以血管損傷而導(dǎo)致急性出血和局部缺血為特征；（3）免疫/炎癥反應(yīng)：以細(xì)胞凋亡、存活的軸突脫髓鞘以及免疫介導(dǎo)的細(xì)胞死亡為特征；（4）穩(wěn)定化：以中央空洞和膠質(zhì)瘢痕形成為特征。

圖5　術(shù)后7天a：正常脊髓中處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞；b：損傷后巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞由分枝狀轉(zhuǎn)化為阿米巴樣；c：丹參酮IIA組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量IOD較模型組明減小；d：甲潑尼龍組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞IOD較模型組明減小（Bar = 50 μm）Fig.5 Seven days after surgery a： Microglia in the resting state in normal spinal cord； b： Macrophages/microglia contract their processes and transformed from a ramifed to an ameboid morphology after injury； c： IOD of macrophage/microglia in TIIA group was reduced signifcantly compared with SCI group（P ＜ 0.05）； d： IOD macrophage/microglia in MP group was reduced dramatically compared with SCI group（P ＜ 0.05）（Bar = 50 μm）

圖6　術(shù)后8周a：各實(shí)驗(yàn)組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由阿米巴樣轉(zhuǎn)變回分枝狀；b：模型組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞 IOD 較對照組減??；c：丹參酮 IIA 組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞 IOD 較模型組增多；d：甲潑尼龍組脊髓中巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞 IOD 較模型組增加（Bar=50μm）Fig.6 Eight weeks after surgery a： Microglia transformed from an ameboid to a ramifed morphology in experimental groups； b： The IOD of macrophage/microglia in SCI group was reduced signifcantly compared with sham group； c： IOD of macrophage/microglia increased in TIIA group compared with SCI group（P＜0.05）； d： IOD of macrophage/microglia increased remarkably in MP group compared with SCI group（P＜0.05）（Bar=50 μm）

炎癥反應(yīng)是所有繼發(fā)性損傷的機(jī)制中最為重要的，它能夠直接或間接的影響脊髓損傷的結(jié)果。炎癥反應(yīng)可以分為以下幾個階段[7]：（1）在損傷后 0～2 天內(nèi)中性粒細(xì)胞快速浸潤且固有的小膠質(zhì)細(xì)胞活化；（2）損傷后3～7天時血源性的單核細(xì)胞向損傷部位聚集；（3）損傷后第7天開始巨噬細(xì)胞分解瘢痕并且軸突再生。

脊髓損傷通過激活固有的免疫反應(yīng)，促進(jìn)繼發(fā)性損傷而引起炎癥反應(yīng)。脊髓損傷中心內(nèi)巨噬細(xì)胞的累積，是神經(jīng)元退變和再生相關(guān)的重要機(jī)制[8]。

2. 脊髓損傷后巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的活化：20世紀(jì)初，del Rio-Hortega 第一次描述了小膠質(zhì)細(xì)胞，它占據(jù)了成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總量的 10%～20%[9]。有學(xué)者認(rèn)為在發(fā)育過程中，這些細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，并可能在整個生命過程中不斷的遷入，尤其是在受到損傷或疾病侵犯時[10]。脊髓損傷后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫細(xì)胞迅速做出反應(yīng)，不僅是小膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元和其它膠質(zhì)細(xì)胞也迅速表達(dá)促炎性因子，使來自外周血源性的免疫細(xì)胞聚集在損傷部位并活化。

Yang 等[11]研究表明，是固有的小膠質(zhì)細(xì)胞而非浸潤的外周巨噬細(xì)胞，成為急性脊髓損傷后促炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的主要來源。此外，在損傷后14天和28天，有一些損傷部位頭尾部的區(qū)域血脊髓屏障通透性增加與OX-42+小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)相關(guān)[12]。

巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞一起構(gòu)成了損傷脊髓的單核細(xì)胞反應(yīng)。來自外周的巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞于脊髓損傷后12～24h，出現(xiàn)在脊髓中，在損傷后4～8天浸潤最多[13]。目前的研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在脊髓損傷60天出現(xiàn)第2個峰值，在脊髓損傷180天時仍持續(xù)上升[14]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞證明，基因表達(dá)譜反應(yīng)出吞噬功能、抗原呈遞能力提升以及促炎性因子、ROS和RNS分泌的增加[15]。這與本實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果一致：模型組巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的 IOD 在損傷后7 天較對照組顯著的增加，且在損傷后60天時仍存在活化的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞。

在脊髓損傷后早期的炎癥環(huán)境下，大部分巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1型，只有少量極化為M2型。M1型巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞有助于促炎性因子的再分泌，從而加劇神經(jīng)毒性作用[18]。在脊髓損傷后期，局部的微環(huán)境有利于巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，從而釋放大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子（IGF，BDNF，NGF等）以及抗炎性因子（IL-4，IL-10，TGF-β 等），促進(jìn)軸突再生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，脊髓損傷后7天，丹參酮IIA組和甲潑尼龍組巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞IOD明顯較對照組減少，可能為藥物干預(yù)影響了炎癥環(huán)境，進(jìn)而減少了巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。而在這個時期，從巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞兩種亞型所占比例來說，M1型＞M2型，因此減少了總量就更多地減少了M1型的數(shù)量，從而有利于發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。在損傷后60天，丹參酮IIA組和甲潑尼龍組巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞IOD較模型組增多，形態(tài)較模型組更接近活化狀態(tài)，表明藥物的干預(yù)在此時促進(jìn)了巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而此時從兩種亞型所占比例來說，是否是M2＞M1型，還不明確。

已經(jīng)有研究證明M2型巨噬細(xì)胞對治療非感染性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥有利。選擇性的活化M2型巨噬細(xì)胞，抑制M1表型，是促進(jìn)脊髓損傷的功能恢復(fù)的有效方法[19]。但在脊髓損傷后，巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的功能不能被簡單地認(rèn)為是好或者壞，M1型或M2型，應(yīng)考慮到更為復(fù)雜的微環(huán)境。為了應(yīng)對這個問題，甚至有學(xué)者提出另一種巨噬細(xì)胞表型分類法，即根據(jù)作用的不同分為6個亞型：炎癥型，吞噬型，血管重塑型，基質(zhì)重建型，促進(jìn)再生型和免疫調(diào)節(jié)型[20]。

綜上所述，巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織損傷必不可少的反應(yīng)，它的雙重作用以及不同的極化方向已經(jīng)明確，有鑒于此，未來的研究需要進(jìn)一步闡明信號通路和機(jī)制，使小膠質(zhì)細(xì)胞可以被引導(dǎo)趨利避害，促進(jìn)功能恢復(fù)。

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（本文編輯：李貴存）

. 脊柱脊髓損傷 Spinal and spinal cord injuries .

DOI：10.3969/j.issn.2095-252X.2016.06.003中圖分類號：R683.2

基金項(xiàng)目：教育部 2012 年度“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（NCEF12-0805）

作者單位：100700 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院（楊永棟、俞興）；100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)（高譽(yù)珊）

通信作者：俞興，Email: yuxing34@sina.com

收稿日期：（2016-02-14）

Effects of intravenously injected tanshinone IIA on neurological function recovery of adult rat after spinal cord injury

YANG Yong-dong， YU Xing， GAO Yu-shan.

Department of Orthopedics， Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing， 100700， PRC
Corresponding author： YU Xing， Email： yuxing34@sina.com

【Abstract】Objective To determine the impact of tanshinone IIA（TIIA）on the recovery of hindlimb neurological disorders and to explore the possible mechanisms. Methods Adult female Sprague-Dawley rats（n=45）were randomly divided into 4 groups： Sham group（laminectomy only）， SCI group（T9spinal cord contusive injury），SCI/TIIA group（SCI with intravenous injection of TIIA [20 mg/kg] from 1 to 7 days post-injury at the same time），SCI/MP group（SCI with intravenous injection of methylprednisolone [30 mg/kg] once post-injury）. SCI was generated by using NYU injury device with a 10-g weight dropped from a height of 25 mm. Sham group and SCI group were treated with intravenous injection of 1 ml normal saline from 1 to 7 days post-injury at the same time.（1）Spontaneous locomotion and sensory function of all animals were assessed by the Basso， Beattie， and Bresnahan（BBB）open feld locomotor test and hot plate test. Transcardiac perfusion fxation were done at 1， 4 and 8 weekspost-SCI. Sections of T9spinal cord were collected. Then the T9spinal cord tissue stained with Cresyl Violet for Nissl staining and stained with hematoxylin and eosin for HE staining. Microglia in the injured spinal cord were marked by immunohistochemistry at 7 days and 8 weeks post-SCI. Results（1）Hindlimb motor function of TIIA group（1.91±0.31）and MP group（3.10±0.41）was signifcantly improved 3 days post-surgery， but MP group was more effective（P＜0.05）；at 8 weeks post-surgery， hindlimb motor function of MP group（17.00±0.41）was still more effective than in TIIA group（15.50±0.43）（P＜0.05）.（2）Sensory function of MP group（4.06± 0.26）recovered faster than TIIA group（4.59±0.71）3 days post-surgery， and the difference was statistically signifcant（P＜0.05）. But TIIA group（3.06±0.13）showed a trend that sensory function recovers faster than MP group（3.14±0.13）at 2 weeks post-surgery， almost reached statistical signifcance（P＞0.05）.（3）In each group， except sham group，microglia contract their processes and transformed from a ramifed to an ameboid morphology at 7 days post-surgery. Changes of morphology in TIIA group and MP group were relatively smaller， but the integrated optical density（IOD）of macrophage/microglia in TIIA group（11.61±2.64）and MP group（11.88±1.47）was reduced signifcantly compared with SCI group（27.22±3.04）， and the difference was statistically signifcant（P＜0.05）.（4）In each group， except sham group， microglia transformed from an ameboid to a ramifed morphology at 8 weeks post-surgery. The IOD of macrophage/microglia increased in TIIA group（2.89±0.12）and MP group（2.93±0.15）compared with SCI group（1.58±0.20）， and the difference was statistically signifcant（P＜0.05）. Conclusions（1）TIIA possibly promotes the recovery of motor and sensory function of hindlimb in rats after SCI.（2）TIIA plays a positive role in the recovery of neurological disorder by infuencing the macrophage/microglia.

【Key words】Tanshinone； Spinal cord injuries； Neuroglia； Nervous system