霍雨霞　薩玉龍

（呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

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培養(yǎng)基對(duì)酵母生長(zhǎng)及藍(lán)莓酒質(zhì)量的影響

霍雨霞薩玉龍

（呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

摘要：為探討培養(yǎng)基對(duì)活性干酵母生長(zhǎng)及釀造果酒質(zhì)量的影響，以酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養(yǎng)基為對(duì)照，選取藍(lán)莓果漿、麥芽汁等成分改良活化培養(yǎng)基。結(jié)果表明：葡萄糖和酵母粉含量對(duì)酵母活化影響顯著，添加藍(lán)莓果漿、麥芽汁以及葡萄糖等成分優(yōu)化的培養(yǎng)基活化效果優(yōu)于對(duì)照（YEPD）。該系列培養(yǎng)基上酵母能夠快速生長(zhǎng)增值，死細(xì)胞率低；與對(duì)照相比，釀造的藍(lán)莓酒殘?zhí)呛透呒?jí)醇含量降低，酯類(lèi)物質(zhì)含量最高提升12.1%，酒香濃郁。當(dāng)培養(yǎng)基麥芽汁濃度超過(guò)3%，活化效果不會(huì)隨著麥芽汁濃度升高而顯著增加。改良后的培養(yǎng)基在提供酵母菌所需營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)提高酵母對(duì)藍(lán)莓果漿中糖類(lèi)和氨基酸等物質(zhì)的利用率，使酒口感和香氣物質(zhì)更加平衡。

關(guān)鍵詞：活性干酵母；活化培養(yǎng)基；篩選；藍(lán)莓酒；質(zhì)量

活性干酵母廣泛用于果酒工業(yè)，能有效控制酒精發(fā)酵進(jìn)程，生產(chǎn)出質(zhì)量均一的酒。使用前需要進(jìn)行活化處理，使酵母膜透性和細(xì)胞功能完全復(fù)原。正確的復(fù)水方法可以充分發(fā)揮活性干酵母的性能，獲得理想的發(fā)酵產(chǎn)品?；罨囊话悴襟E為37°C下蒸餾水中復(fù)水溶解30min左右后，接種擴(kuò)大發(fā)酵，但此方法酵母生長(zhǎng)容易受到抑制，接種到發(fā)酵液后難以快速啟動(dòng)發(fā)酵，因此如何快速有效地使干酵母復(fù)水活化對(duì)果酒生產(chǎn)尤為重要。

果酒用活性干酵母應(yīng)用研究已有近50年的歷史[1]，Kraus等通過(guò)比較選取了9種商用干酵母，比較其在不同溫度的葡萄汁和純水中的酵母復(fù)水活化效果，發(fā)現(xiàn)在最適溫度范圍內(nèi)兩種培養(yǎng)基成分下活化效果存在差異[2]。復(fù)水的主要問(wèn)題是粘結(jié)或者營(yíng)養(yǎng)不良造成酵母生長(zhǎng)遲緩，活化培養(yǎng)基中添加一定碳氮元素、金屬離子及抗氧化物質(zhì)能夠影響酵母細(xì)胞膜透性，進(jìn)而對(duì)其核苷酸、細(xì)胞內(nèi)的水溶物含量產(chǎn)生影響，有利于酵母生長(zhǎng)繁殖[3]。常用細(xì)胞計(jì)數(shù)、CO2產(chǎn)率等作為指標(biāo)以確定酵母活化和接種的最佳條件和時(shí)間[4]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于酵母復(fù)水活化溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)狀態(tài)和果酒質(zhì)量的影響研究較多，但是對(duì)干酵母復(fù)水過(guò)程中生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)消耗以及接種后對(duì)果酒質(zhì)量的持續(xù)影響問(wèn)題關(guān)注不夠，至今尚無(wú)特定某種果酒干酵母活化培養(yǎng)基優(yōu)化配制方面的報(bào)道。本文通過(guò)研究活化培養(yǎng)基成分對(duì)酵母活化狀態(tài)、死細(xì)胞數(shù)、耗糖產(chǎn)酒精能力以及所產(chǎn)藍(lán)莓原酒揮發(fā)性物質(zhì)影響，綜合分析可能的產(chǎn)生機(jī)理，以確定出最優(yōu)化的活化培養(yǎng)基，為發(fā)酵食品生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒活性干酵母CY3079，BDX購(gòu)于加拿大拉曼集團(tuán)羅賽爾公司。ZymafloreRX60，ZymafloreX5購(gòu)于法國(guó)拉佛特公司。藍(lán)莓購(gòu)于海拉爾市場(chǎng)，挑選無(wú)腐爛、無(wú)變質(zhì)的果實(shí)。

培養(yǎng)基配料：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，均為分析純，購(gòu)自于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。麥芽，購(gòu)自于華潤(rùn)（天津）啤酒廠。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；YS100光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司；固相微萃取，配備PDMS/CAR/DVB頭，美國(guó)色譜科公司；MS4000氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀，美國(guó)瓦里安公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1麥芽汁制備

取1kg大麥芽經(jīng)粉碎后，轉(zhuǎn)入4L水的糖化鍋中，60°C不斷攪拌下，糖化、過(guò)濾、煮沸、冷卻，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾或離心后所得上層清液即為制備所得麥芽汁。糖化標(biāo)準(zhǔn)以碘液滴定不變藍(lán)為終點(diǎn)。

1.2.2活化培養(yǎng)基成分確定

以YEPD為對(duì)照培養(yǎng)基，對(duì)其中主要的組分進(jìn)行消減法處理，找出對(duì)酵母活化影響最為顯著的成分進(jìn)行優(yōu)化改良，培養(yǎng)基編號(hào)及成分見(jiàn)表1，每種培養(yǎng)基設(shè)置三個(gè)重復(fù)，分別接種到藍(lán)莓果漿中進(jìn)行發(fā)酵。

表1　培養(yǎng)基成分設(shè)計(jì)Table 1 Design of the culture medium component

1.2.3酵母形態(tài)評(píng)價(jià)及血球計(jì)數(shù)

對(duì)酵母復(fù)水后生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察使用美藍(lán)染液水浸片法，參考沈萍等《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》并做微調(diào)改動(dòng)：滴加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液于載玻片中央，吸取少許酵母培養(yǎng)液置于染液中，混合均勻。然后用鑷子取蓋玻片蓋在培養(yǎng)液上。將制片放置3min后，用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母菌形態(tài)和出芽情況[5]。

酵母菌的計(jì)數(shù)，使用血球計(jì)數(shù)法，透明無(wú)色的為活酵母細(xì)胞，被染成藍(lán)色的為死亡的酵母細(xì)胞。染色30min后再次觀察，觀察死活細(xì)胞比例的變化[6]。

1.2.4藍(lán)莓果酒釀造工藝

主要參考Withy和Lodge的釀造工藝，并稍作改動(dòng)，在得到原酒后進(jìn)行澄清，然后對(duì)其指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)[7]，具體步驟如下：

藍(lán)莓→清洗→榨汁→過(guò)濾分離→果汁→成分調(diào)整→接種發(fā)酵→換罐陳釀→原酒→過(guò)濾→檢測(cè)。

1.2.5酒精度和還原糖含量測(cè)定

酒精含量采用蒸餾法測(cè)定：取上清液，按照Miller等的方法，使用DNS試劑，通過(guò)測(cè)定540nm波長(zhǎng)下的光吸收值來(lái)確定還原糖的含量，并以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)表示[8]。

1.2.6香氣物質(zhì)分析

藍(lán)莓原酒香氣成分的萃取：在15mL裝有微型磁力攪拌子的頂空瓶中加入NaCl（添加量為0.25g/mL）：取5mL待測(cè)藍(lán)莓原酒插入PDMS/CAR/DVB固相微萃取頭（Supelco公司，美國(guó)），于45°C下磁力攪拌吸附45min，GC解吸15min。

氣譜條件參照Howard等方法并稍作改動(dòng)[9]。初始溫度為35°C，保持8min后，以3°C/min升溫至134°C，保留2min。再以20°C/min升至250°C，保持3.5min，整個(gè)過(guò)程持續(xù)50min。載氣為高純度He氣，流速為0.8mL/min。檢測(cè)器和進(jìn)樣口溫度為250°C。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV。電子倍增器電壓1200V，掃描范圍25～400amu。離子源溫度220°C。

識(shí)別的揮發(fā)性物質(zhì)通過(guò)NIST譜庫(kù)進(jìn)行識(shí)別，采用面積歸一法測(cè)出各物質(zhì)比例含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行的平均值。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0中的ANOVA進(jìn)行顯著性方差分析。應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較分析，并通過(guò)相關(guān)性矩陣進(jìn)行不同組分間的相關(guān)性分析。

2　結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基成分對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

2.1.1培養(yǎng)基對(duì)酵母生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

復(fù)水活化前30min，YEPD培養(yǎng)基活化的活性干酵母生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞間形態(tài)差異較大，美藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞數(shù)較多，并且出現(xiàn)了四分體和芽孢態(tài)。在藍(lán)莓果漿的K1培養(yǎng)基上，酵母的生長(zhǎng)情況未能顯著改善，仍處于受抑制狀態(tài)。對(duì)采用消減法配制的一系列培養(yǎng)基（P1，J1及D1）中酵母生長(zhǎng)狀態(tài)觀察：在P1和J1上酵母菌生長(zhǎng)顯著受到抑制，而使用D1培養(yǎng)基的酵母菌活化效果比P1和J1更好。培養(yǎng)基M1至M4的酵母形態(tài)比較均勻，美藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

圖1中，活化1h后對(duì)各組活化培養(yǎng)基上酵母進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)YEPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌落數(shù)和死細(xì)胞率與K1培養(yǎng)基接近，約為45%左右。優(yōu)化改進(jìn)培養(yǎng)基成分，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化葡萄糖和麥芽汁的培養(yǎng)基（P1，M1-M4）相比另外幾種培養(yǎng)基酵母生長(zhǎng)狀態(tài)較好，死細(xì)胞率顯著降低，D1中缺少葡萄糖，死細(xì)胞率最高，約為75.6%，M1培養(yǎng)基上酵母生長(zhǎng)迅速，活化后菌落數(shù)達(dá)到4.72×1010。

圖1　培養(yǎng)基對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of medium on the growth of yeast

酵母菌理想的活化生長(zhǎng)狀態(tài)是分散均一，呈現(xiàn)橢球形、卵形，若遇到不適宜生長(zhǎng)環(huán)境或者營(yíng)養(yǎng)不足則會(huì)出現(xiàn)畸形，如假菌絲、四倍體，甚至出現(xiàn)芽孢和絮凝態(tài)，這是酵母自我保護(hù)機(jī)制作用的結(jié)果，但當(dāng)逆境狀態(tài)持續(xù)一段時(shí)間后就會(huì)形成傷害。逆境態(tài)活化培養(yǎng)的酵母菌擴(kuò)培到發(fā)酵液以后，造成啟發(fā)緩慢，逆境下產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)酒的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。通過(guò)消減法對(duì)幾種培養(yǎng)基上酵母生長(zhǎng)狀態(tài)和死細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)，與蛋白胨相比，葡萄糖和酵母粉對(duì)酵母活化影響顯著，這主要由于加入的葡萄糖，能夠減少細(xì)胞內(nèi)含物的泄漏，對(duì)細(xì)胞膜起穩(wěn)定作用[10]。而在YEPD中添加藍(lán)莓果漿后對(duì)酵母活化效果不夠顯著，說(shuō)明藍(lán)莓果肉較難被酵母菌直接利用。麥芽汁中含有麥芽糖、葡萄糖、果糖等多種糖類(lèi)，擴(kuò)大酵母菌對(duì)麥芽汁利用范圍，并且麥芽汁含有礦質(zhì)元素等，有利于酵母菌維持細(xì)胞形態(tài)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝。

2.1.2培養(yǎng)基對(duì)酵母發(fā)酵效率影響

由圖2可看出，幾種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌在前期對(duì)糖類(lèi)消耗較慢，后期大量消耗糖類(lèi)。從接種第24h開(kāi)始添加麥芽汁的培養(yǎng)基M1至M4還原糖降低速率均顯著高于YEPD培養(yǎng)基。經(jīng)麥芽汁培養(yǎng)基活化，酵母菌能夠快速利用還原糖，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)還原糖的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，于M1-M4培養(yǎng)基復(fù)水活化的活性干酵母對(duì)葡萄糖的利用率顯著高于YEPD（＜0.05）。

圖2　培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓酒中還原糖含量影響Fig.2 The effect of culture medium on the content of reducing sugar in buleberryfruit wine

不同生長(zhǎng)狀態(tài)和階段的酵母菌對(duì)糖的利用率和產(chǎn)物存在差異[11]。由于醇類(lèi)主要由酵母的無(wú)氧呼吸產(chǎn)生，受酵母菌數(shù)目和生長(zhǎng)狀態(tài)影響顯著。酵母適宜活化后能夠快速進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)，對(duì)還原糖消耗主要通過(guò)其呼吸作用進(jìn)行消耗，產(chǎn)率和酵母活細(xì)胞數(shù)直接相關(guān)。復(fù)水活化培養(yǎng)基（M1-M4）中添加的藍(lán)莓果汁和發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)成分部分相似，復(fù)水對(duì)酵母菌有一定的馴化作用，酵母菌快速生長(zhǎng)，縮短了發(fā)酵周期，并且提升了對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力，且能夠有效利用發(fā)酵液中的糖分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，達(dá)到需要的產(chǎn)物[12]。

2.2培養(yǎng)基對(duì)酵母菌產(chǎn)香影響

2.2.1醇類(lèi)化合物

果酒的香氣物質(zhì)主要由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酯類(lèi)和高級(jí)醇綜合作用產(chǎn)生，是一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)，使用添加麥芽汁的培養(yǎng)基有增加不良香氣的風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)[11]。對(duì)使用不同活化培養(yǎng)基酵母發(fā)酵原酒的香氣物質(zhì)使用氣質(zhì)色譜分析發(fā)現(xiàn)，含有麥芽汁的M1至M4培養(yǎng)基相對(duì)于參照的YEPD培養(yǎng)基，產(chǎn)生的高級(jí)醇含量均顯著降低約10%，而處理組M1-M4之間高級(jí)醇含量差異不顯著。

高級(jí)醇含量過(guò)高容易造成酒體香氣過(guò)濃，產(chǎn)生不良味感，是果酒的主要異雜味來(lái)源之一[13]。藍(lán)莓酒中的醇類(lèi)主要來(lái)源于酒精發(fā)酵、氨基酸轉(zhuǎn)化及有機(jī)酸降解物的氧化。當(dāng)缺乏氮或者氨基氮會(huì)促使酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)向利用來(lái)自氨基酸的氮源，從而留下了轉(zhuǎn)氨的高級(jí)醇，處理組的酵母菌對(duì)氮源利用率升高，相當(dāng)于增加了氮源，能夠降低高級(jí)醇的生成量?？赡苁怯捎诮湍咐名溠刻切枰ㄟ^(guò)質(zhì)子輸送系統(tǒng)輸送，限制了麥芽汁的大量利用，因而彼此差異不顯著（＜0.05）[14]。

2.2.2酯類(lèi)化合物

酯類(lèi)物質(zhì)可豐富藍(lán)莓酒香氣，增加風(fēng)味品質(zhì)的感知強(qiáng)度[11]。從圖3可以看出，M2活化的酵母產(chǎn)酯類(lèi)含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到48.2%，顯著高于YEPD組的36.1%，說(shuō)明麥芽汁起到促進(jìn)作用。隨著培養(yǎng)基中麥芽汁濃度升高，M3，M4中酯類(lèi)含量并未顯著高于M1和YEPD的活化組。

圖3　藍(lán)莓酒中主要香氣物質(zhì)Fig.3 The main flavour materials in Buleberryfruit

酯類(lèi)化合物是藍(lán)莓酒中重要的香氣成分物質(zhì)之一，在發(fā)酵過(guò)程中由酵母形成，其途徑有兩條：一條是在酯酶的催化下由氨基酸的碳源骨架產(chǎn)生，另一條是乙酰輔酶A在醇酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下酵解生成[15]。

圖4　酯類(lèi)合成途徑Fig.4 The route of synthesis of acetate esters

由圖4看出，單糖能夠通過(guò)EMP途徑在NAD和酶的作用下生成乙酰輔酶(CH3COSCOA)，進(jìn)一步在酶和醇類(lèi)的參與下反應(yīng)生成乙酸酯類(lèi)等酯類(lèi)。酯類(lèi)合成需要泛酸，當(dāng)藍(lán)莓果漿中氮源含量很低時(shí)，作為酯類(lèi)前體物質(zhì)的氨基酸碳源骨架含量也會(huì)減少，從而使得酯類(lèi)生成量減少。實(shí)驗(yàn)中差異主要產(chǎn)生于發(fā)酵過(guò)程，這主要是由于酵母菌生命活動(dòng)差別所致。

3　結(jié)論

1）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證了酵母活化是果酒釀造過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵步驟，其中培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)影響酵母菌的成活率和生長(zhǎng)狀態(tài)，而酵母菌的生長(zhǎng)代謝狀況會(huì)對(duì)果酒的酒度、殘?zhí)且约皹?gòu)成香氣物質(zhì)的主要成分高級(jí)醇和酯類(lèi)物質(zhì)含量等產(chǎn)生影響。使用麥芽汁和藍(lán)莓果肉優(yōu)化后的活化培養(yǎng)基能夠促進(jìn)藍(lán)莓酒質(zhì)量的提升。

2）活化培養(yǎng)基中麥芽汁濃度的升高能夠在一定程度上促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)和活化，提高對(duì)糖類(lèi)等物質(zhì)的利用率和酯類(lèi)物質(zhì)含量，保持高級(jí)醇處于較低水平，使香氣物質(zhì)更加濃郁。但麥芽汁含量超過(guò)3%時(shí)，促進(jìn)效果不顯著。因此從生產(chǎn)成本和使用效果綜合考慮，在藍(lán)莓果酒生產(chǎn)中，建議使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行酵母活化。此外，對(duì)于其他品質(zhì)如顏色、口感以及香氣物質(zhì)的評(píng)價(jià)還需要進(jìn)一步研究。

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Effect of Medium on Yeast Growth and Quality of Buleberry Wine

HUO Yu-xiaSA Yu-long
(Hulunbeier Vocational Technical College,Neimenggu 021000,China)

Abstract:The blueberry fruit pulp and malt extract were selected to study the effect of medium on the growth of active dry yeast(ADY)and the quality of blueberry fruit wine,comparing to ADY extract peptone dextrose(YEPD)medium.The results indicated that the activation of ADY could significantly influenced by the content of glucose and yeast extract,and the activation improved by adding blueberry fruit pulp,malt extract and glucose reach better result than the control (YEPD).The ADY could quickly grow and propagate,with low dead cell ratio;the blueberry fruit wine reduced residual sugar and high alcohol,whereas raised the content of esters by 12.1%,with full aroma.The activating effect of medium had not heightened with a rise malt extract after the concentration of malt extract higher than 3%.The improved medium could not only supplied ADY with necessary nutrition but also raise the utilization rate of the sugar,amino acid and so on, helping the tasting and aroma of buleberryfruit wine more balance.

Key words:Active dry yeast；activating medium；selection,blueberry fruit wine；quality

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1038(2016)04-0018-05

收稿日期：2015-12-16

基金項(xiàng)目：呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)課題(課題編號(hào)：15-HZY12)

作者簡(jiǎn)介：霍雨霞(1984—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)