錢飚，魯宏峰，孫龍

(寧波市第二醫(yī)院 乳腺外科，浙江 寧波 315000)

Ki-67的改變與Ⅱ-Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者化療療效之間的關(guān)系

錢飚Δ，魯宏峰，孫龍

(寧波市第二醫(yī)院 乳腺外科，浙江 寧波 315000)

目的 探討增殖細胞核抗原(Ki-67)與Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者新輔助化療療效的關(guān)系。方法 選取寧波市第二醫(yī)院乳腺外科收治的89例初治Ⅱ-Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者作為研究對象，新輔助化療前通過穿刺取癌組織進行免疫組化染色，3 w新輔助化療完成后進行乳腺癌根治性手術(shù)治療，取手術(shù)后癌組織行免疫組化染色，對比不同Ki-67的表達水平與患者化療近期效果的關(guān)系，并分析化療效果與患者的臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 化療前，Ki-67高表達患者52例，低表達37例，高表達患者的緩解率63.46%顯著的高于低表達組患者的35.13%(P<0.05)；化療后Ki-67的高表達率38.20%顯著低于化療前的58.43%(P<0.05)；采用Logistic模型分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期、MP分級3+4級、Ki-67低表達降低緩解率(P<0.05)。結(jié)論 Ki-67與Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者新輔助化療療效關(guān)系密切，可以作為臨床上術(shù)前輔助化療效果評估的參考指標。

Ki-67；浸潤性乳腺癌；新輔助化療

乳腺癌(breast carcinoma)是臨床常見的惡性腫瘤類型，絕大多數(shù)患者為女性，其發(fā)病高峰年齡為45～55歲，以圍絕經(jīng)期女性較多見。盡管隨著環(huán)境的惡化和生活方式的改變，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但其死亡率卻較之前有所下降，這一現(xiàn)狀得益于近年來臨床對乳腺癌診療過程的規(guī)范化和治療水平的提高[1]。在接受根治性手術(shù)治療聯(lián)合化療后，多數(shù)乳腺癌患者可獲得良好的預后。

Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌已屬于中晚期，此時行根治性手術(shù)治療的效果略差，手術(shù)難度較大。新輔助化療是乳腺癌治療的重要組成部分，Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌術(shù)前接受新輔助化療有助于手術(shù)的順利實施，其治療效果已得到臨床公認[2]。隨著對乳腺癌研究的不斷深入，對腫瘤生物學標志物的研究已成為近年來臨床研究的熱點。Ki67是一種核抗原，與細胞增殖密切相關(guān)，是目前臨床用于評價腫瘤細胞增殖能力的常用標志物[3]。研究探討了Ki-67與Ⅱ-Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者新輔助化療療效的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取寧波市第二醫(yī)院乳腺外科收治的89例初治Ⅱ-Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者作為研究對象，年齡34～65歲，平均年齡(47.6±9.8)歲，臨床分期：Ⅱ期45例、Ⅲ期44例，組織學分型：浸潤性導管癌84例、浸潤性小葉癌5例，絕經(jīng)34例，雌激素受體陽性35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，病理組織學(Miler Payne, MP)分級：1級21例、2級23例、3級28例、4級17例。

納入標準：入選病例化療前穿刺取活組織檢查診斷為浸潤性乳腺癌，臨床分期Ⅱ～Ⅲ期；患者可進行手術(shù)治療和輔助性化療；入組時經(jīng)過彩超、CT、MRI等檢查證實未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移；與患者簽訂知情同意書。

排除標準：合并嚴重的肝腎功能障礙，不適宜進行新輔助化療的患者；具有手術(shù)禁忌癥的患者；非初治的患者。

1.2 方法

1.2.1 新輔助化療方法:新輔助化療為TEC方案：靜脈注射多西他賽(T)(國藥準字H20064301，江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司)劑量為75 mg/m2，第1、5天；鹽酸多柔比星(EPI)(國藥準字H20041318，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)劑量為70 mg/m2，第1～3天；環(huán)磷酰胺(CTX)(國藥準字H14023686，山西普德藥業(yè)股份有限公司)劑量為600 mg/m2，第1～3天。每21 d為1個化療周期。

1.2.2 乳腺癌根治手術(shù)方法：行靜吸復合全身麻醉，采用環(huán)形切口，將病變?nèi)橄龠B同腫瘤周圍5cm寬的皮膚、周圍脂肪組織、胸大肌、胸小肌、筋膜組織、腋窩、鎖骨下淋巴結(jié)等全部切除。

1.2.3 免疫組化法：標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，用PBS代替一抗作為空白對照，定性切片作為陽性對照。沖洗、脫水，脫水操作依次為80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇2次、無水乙醇2次。二甲苯透明2次。浸蠟、包埋后進行塑型、切片。展片后使切片貼附于載玻片，干燥。將切片置于60 ℃溫箱中烤片1 h，放于二甲苯脫蠟10 min，無水乙醇洗去二甲苯。依次采用95%、90%、80%、70%、50%乙醇、蒸餾水洗滌。

將1 500 mL已稀釋成工作液的檸檬酸鹽緩沖液放于壓力鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫染色架進行高溫高壓組織抗原修復。流水沖至壓力鍋冷卻，取出耐高溫染色架自然冷卻后采用蒸餾水、PBS沖洗。采用甩法除去PBS，5%正常羊血清封閉液室溫下孵育30 min。濕盒中除去5%正常羊血清封閉液，滴加1:100稀釋的第一抗體，4 ℃冰箱過夜，室溫中放置20 min，PBS沖洗3次。除去PBS液，切片滴加適量即用型二抗，室溫下孵育20 min。PBS沖洗3次，除去PBS液，切片滴加適量鏈霉素，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，除去PBS液，切片上滴加1滴新鮮配制的DAB顯色試劑，室溫下顯色3～5 min。

切片放入蒸餾水中以中止顯色，自來水流水沖洗，蘇木素淺染。0.2%鹽酸酒精分化，在40 ℃溫水中返藍。從低濃度到高濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明2次。滴加少量樹膠，蓋玻片固封。進行常規(guī)病理觀察。所用一抗、二抗均購自廣州市凱秀貿(mào)易有限公司。

1.2.4 免疫組化結(jié)果及化療效果評價:參照實體瘤的療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)實體瘤療效評價標準分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進展(PD)，緩解率=(CR+PR)/本組樣本量×100%。

免疫組化結(jié)果判定：Ki-67陽性著色定位于細胞核，呈黃色、棕色、褐色，在400倍顯微鏡下進行觀察，計數(shù)每1 000個細胞中陽性細胞所占比例，陽性指數(shù)(PI)=(陽性細胞數(shù)/1 000)×100%，陽性細胞比例≥14%定義為高表達，<14%為低表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)在SAS9.3軟件包中處理，計數(shù)資料采用%表示，組間比較采用χ2檢驗；多因素分析分析采用Logistic回歸模型；P<0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同Ki-67表達與療效的關(guān)系 化療前，Ki-67高表達患者52例，低表達37例，高表達患者的緩解率63.46%顯著的高于低表達組患者的35.13%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.946，P<0.05)。見表1。

表1 不同Ki-67表達與療效的關(guān)系

2.2 化療前后Ki-67表達的變化 化療前，Ki-67高表達患者52例，低表達37例，化療后高表達34例、低表達54例，化療后Ki-67的高表達率38.20%顯著低于化療前的58.43%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.289，P<0.05)。見表2，圖1。

表2 化療前后Ki-67表達的變化[n(%)]

圖1 Ki-67在乳腺癌組織中的表達(SP×400)Fig.1 Expression of Ki-67 in breast cancer (SP×400)

2.3 化療效果與患者的臨床病理特征關(guān)系分析 Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者術(shù)前新輔助化療緩解率與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、MP組織學分級具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 化療效果與患者的臨床病理特征關(guān)系分析[n(%)]

2.4 化療效果與患者的臨床病理特征關(guān)系的多因素分析 將患者化療結(jié)果是否緩解作為因變量，2.2中單因素具有統(tǒng)計學意義的因素和Ki-67表達情況作為自變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期、MP分級3+4級、Ki-67低表達降低緩解率。見表4。

表4 化療效果與患者的臨床病理特征關(guān)系的多因素分析[n(%)]

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，99%的患者為女性。由于乳腺組織并不是維持人體生命活動的重要器官，因此原位乳腺癌并不致命。但癌細胞一旦發(fā)生脫落，可隨血液或淋巴液播散至全身，在重要器官形成轉(zhuǎn)移后而危及患者生命。早期乳腺癌并不具備典型的癥狀和體征，一般通過體檢或乳腺癌篩查發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期手術(shù)是改善患者預后的關(guān)鍵[4]。當乳腺癌進展至Ⅱ～Ⅲ期往往已經(jīng)錯過了最佳的手術(shù)時機。但近年來隨著對惡性腫瘤認識程度的深化，發(fā)現(xiàn)新輔助化療(又稱術(shù)前化療)在緩解腫瘤病情的進展、爭取手術(shù)機會方面具有重要的作用[5]。對惡性腫瘤的治療手段采用全身與局部治療相結(jié)合的綜合治療效果明顯優(yōu)于單一的局部治療。在對乳腺癌的治療中，也從單純的乳腺癌根治性手術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槭中g(shù)與化療、放療、內(nèi)分泌治療等全身治療相結(jié)合[6]。其中化療占據(jù)乳腺癌治療的重要地位，對手術(shù)效果也產(chǎn)生一定的影響[7]。

乳腺癌新輔助化療的概念在20世紀70年代首次提出，對不可手術(shù)的局部進展期乳腺癌進行誘導化療，使患者滿足手術(shù)要求[8]。乳腺癌的新輔助化療不僅有助于消滅全身微小轉(zhuǎn)移灶、降低癌癥分期，還可縮小手術(shù)范圍，增加保乳手術(shù)機會，進而改善患者的預后[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌患者在接受新輔助化療后獲得病理完全緩解，無瘤生存期和總生存期均得以延長[10]。

病理組織學檢查是判斷腫瘤臨床分期的手段，但標本的取得需要進行穿刺或手術(shù)，屬于有創(chuàng)性操作。病理組織學檢查操作繁瑣，其結(jié)果的得出往往具有一定的滯后性。因此尋找一種腫瘤生物學指標對評估腫瘤分期具有重要的現(xiàn)實意義。Ki67是一種增殖細胞核抗原，與細胞的有絲分裂周期密切相關(guān)。Ki67僅在增殖細胞的細胞核內(nèi)發(fā)生反應，在DNA合成中發(fā)揮著重要作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ki67與惡性腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)，但其確切的生物學功能目前尚未確定。Ki67在不同的細胞周期表達不同，G0期、G1早期不被標記，G1后期開始表達，S 期、G2期表達增加，M期達到高峰狀態(tài)[12]。由于Ki67表達具有時間特異性，可將其作為細胞增殖狀態(tài)的標記物，直觀反映增殖細胞的數(shù)量，用以評估腫瘤細胞的增殖能力非常適合。將Ki67和臨床療效的表現(xiàn)相結(jié)合，有助于從細胞學水平反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，對判斷腫瘤惡性程度、化療效果、預后具有深遠的意義。

研究根據(jù)化療前患者Ki-67表達水平將患者分成高表達組和低表達組，高表達患者多于低表達患者，其中高表達患者的緩解率顯著高于低表達組(P<0.05)，這一結(jié)果提示，Ⅱ～Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者多數(shù)為Ki-67高表達，高表達患者化療效果比低表達患者差?；熀驥i-67的高表達率顯著低于化療前(P<0.05)。這一結(jié)果提示，化療后，患者的Ki-67表達水平下降。采用Logistic模型分析，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期、MP組織學分級(3～4級)、Ki-67低表達降低緩解率(P<0.05)，因此在今后的臨床工作中可將Ki67表達水平作為判斷臨床分期、組織學分級、化療效果的生物學指標。

研究結(jié)果表明：Ki-67與Ⅱ-Ⅲ期浸潤性乳腺癌患者新輔助化療療效關(guān)系密切，可以作為臨床上術(shù)前輔助化療效果評估的參考指標。

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(編校：王儼儼)

Relationship between Ki-67 and the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer

QIAN BiaoΔ, LU Hong-feng, SUN Long

(Department of Breast Surgery, Second Hospital of Ningbo, Ningbo 315000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between Ki-67 and the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer.Methods89 cases phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer patients enrolled into our hospital were collected through biopsy and immunohistochemically stained.After 3 weeks’ neoadjuvant chemotherapy, cancer tissue were taken by surgery.The expression of Ki-67 before and after chemotherapy were compared.ResultsBefore chemotherapy, 52 patients with Ki-67 high expression had 63.64% response rate, which were higher than 35.13% in 37 cases with Ki-67 low expression (P<0.05).After chemotherapy, high Ki-67 expression decreased from 58.43% to 38.20% (P<0.05).Logistic model analysis showed:lymphatic metastasis, phase Ⅲ, MP histological grade (grade 3-4) would decrease the remission rate (P<0.05).ConclusionKi-67 is closely related with the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer, which can be a clinical reference for preoperative adjuvant chemotherapy.

Ki-67; invasive breast cancer; neoadjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.56

錢飚，通信作者，男，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤、乳腺，E-mail：moneybiao@yeah.net。

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