穆簫吟，劉莉

(1.貴州省醫(yī)藥(集團)有限責任公司 科技部，貴州 貴陽 550000；2.貴州省第三人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550000)

一測多評法同時測定舒血寧注射液中4種內(nèi)酯含量

穆簫吟1Δ，劉莉2

(1.貴州省醫(yī)藥(集團)有限責任公司 科技部，貴州 貴陽 550000；2.貴州省第三人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550000)

目的 采用“一測多評”法同時測定舒血寧注射液中4種內(nèi)酯成分(白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C)的含量，并考察其方法學。方法 以白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立舒血寧注射液中白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C間的相對校正因子；采用外標法測定舒血寧注射液中白果內(nèi)酯的含量，通過相對校正因子計算舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A、B、C的含量，并將用“一測多評”法測定的5批舒血寧注射液含量的結(jié)果與用外標法測定的結(jié)果進行t檢驗。結(jié)果 在一定的線性范圍內(nèi)，白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C的相對校正因子分別為：2.280、1.659、1.429，且在不同的實驗條件下重現(xiàn)性良好；5批舒血寧注射液的“一測多評”法計算值與外標法測定值經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義；實驗所得的校正因子可信。結(jié)論 本實驗所建立的校正因子重復性良好，可用于舒血寧注射液中多個成分的定量分析與質(zhì)量評價。

一測多評；舒血寧注射液；相對校正因子；內(nèi)酯；內(nèi)參物；外標法

舒血寧注射液是由銀杏葉提取物制備的滅菌水溶液，其有效成分主要為黃酮苷類、萜類內(nèi)酯活性物質(zhì)，包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯等。現(xiàn)代研究表明其具有擴張心腦血管，改善微循環(huán)、提高機體缺氧耐受力、保護神經(jīng)細胞、拮抗血小板活化因子、降低血液黏度、抗血栓、抗氧化、抗病毒等藥理作用。臨床上被廣泛應用于心腦血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等疾病的治療，具有較好的療效[1]。關(guān)于舒血寧注射液含量測定方面的研究已有文獻報道[2]，但由于中藥對照品昂貴、不易得等原因限制了含量測定方法的推廣使用。本實驗以舒血寧注射液中的白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立白果內(nèi)酯與銀杏內(nèi)酯A、B、C間的相對校正因子，實現(xiàn)用“一測多評”法同步測定舒血寧注射液中4種成分的含量。

一測多評法是指利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定一個成分實現(xiàn)多個成分的同步測定[3]，該方法是通過建立成分之間的相對校正因子來對多個成分進行定量檢測，因而校正因子在不同儀器、不同實驗條件下的重現(xiàn)性如何是“一測多評”法定量是否準確的關(guān)鍵?！耙粶y多評”法的另一個關(guān)鍵因素是成分色譜峰的定位方法，常用的色譜峰定位方法有“相對保留時間定位法”和“保留時間差定位法”。

本實驗考察了所建立的相對校正因子在不同儀器及不同實驗條件下的重現(xiàn)性，并采用“相對保留時間定位法”對各待測成分的色譜峰進行了定位；最后，將用“一測多評”法測定的5批舒血寧注射液含量的結(jié)果與用HPLC外標法測定的結(jié)果進行了t檢驗，對將“一測多評”法應用于舒血寧注射液多組分的含量測定進行了較為全面的考察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：舒血寧注射液(通化谷紅制藥有限公司，國藥準字Z22026296，規(guī)格：5 mL/支，批號：141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2)；白果內(nèi)酯對照品(批號：110865 - 200303)、銀杏內(nèi)酯A、B、C對照品(批號：110862-200305、110863-200204、110864 - 200203)均購自中國藥品生物制品檢定研究院。甲醇、四氫呋喃為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器：Aglient1100高效液相色譜系統(tǒng)(蒸發(fā)光散射檢測器)，色譜柱分別為：Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Luna C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。AB135S型電子天平(梅特勒-托利多)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制：①混合對照品溶液：精密稱取銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯對照品適量，加丙酮制成每1 mL分別含銀杏內(nèi)酯A、B、C 和白果內(nèi)酯0.1、0.05、0.1、0.25 mg的對照品混合溶液，即得。

② 供試品溶液：取舒血寧注射液10支(5 mL/支)，混勻，精取25 mL，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，然后用乙酸乙酯提取4次(80、40、40、40 mL)，合并乙酸乙酯液，用5%的醋酸鈉溶液80 mL洗滌，分離出乙酸乙酯層，醋酸鈉溶液再用乙酸乙酯40 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗滌液，用水洗滌2次，每次80 mL，分離乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加丙酮適量溶解，并轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

1.2.2 色譜條件[2]：色譜柱：Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：四氫呋喃-甲醇-水(10:20:75)；流速：1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器；以空氣為載氣，流速3 L/min；漂移管溫度：105 ℃；柱溫：40 ℃。

在上述色譜條件下，取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，記錄色譜圖。

1.2.3 一測多評方法學考察：

① 線性關(guān)系的考察：精密量取1.2.1項下銀杏內(nèi)酯混合對照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，按1.2.2項下的色譜條件進樣分析，以對照品進樣量(X， μg)為橫坐標，相應的峰面積值(Y)為縱坐標，進行線性回歸。

② 校正因子的計算：以白果內(nèi)酯為內(nèi)參物，在2個不同的實驗室間分別對銀杏內(nèi)酯A、B、C的校正因子進行復核計算，公式如下[4]。

fk/m= fk/ fm=(Wk×Am)/ (Wm×Ak)

Ak:內(nèi)參物峰面積，Wk:內(nèi)參物濃度；Am:其他組分m峰面積，Wm:其他組分m濃度。

③ 精密度試驗：分別精取1.2.1項下①的銀杏內(nèi)酯對照品溶液，按1.2.2項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，記錄各成分的色譜峰面積。

④ 穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一舒血寧注射液供試品溶液10 μL，室溫放置，按1.2.2項下色譜條件，分別在0、2、4、6、 8、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，考察其溶液穩(wěn)定性。

⑤ 重復性試驗：精密吸取同一舒血寧注射液供試品溶液6份，每份10 μL，按1.2.2項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。

⑥ 加樣回收試驗：取已知含量的舒血寧注射液樣品(141107/1)9份，3份為1組，分別加入約相當于樣品含量50 %、100 %、150 %的銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯對照品，照1.2.1銀杏內(nèi)酯項下處理方法制備供試溶液，精密吸取該供試溶液10 μL，按上述色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。

1.2.4 校正因子重現(xiàn)性的考察及各組分色譜峰的定位

① 不同儀器及色譜柱對相對校正因子的影響：本實驗考察了不同儀器和不同色譜柱對相對校對因子的影響，方法按上述色譜條件進樣分析。

② 不同柱溫對相對校正因子的影響：實驗在不同的實驗室進行，采用島津LC20A高效液相色譜系統(tǒng)、Dikxna Cl8色譜柱分別考察了不同柱溫對相對校正因子的影響。

③ 不同流速對相對校正因子的影響：實驗在同一實驗室進行，采用島津LC20A高效液相色譜系統(tǒng)、Dikxna C18色譜柱分別考察了不同的流速對相對校正因子的影響。

1.2.5 待測組分色譜峰的定位：由相關(guān)文獻[4-6]可知，在色譜峰的定位方法選擇上，相對保留時間定位法優(yōu)于保留時間差定位法，相對保留時間定位法在一測多評中使用更為廣泛。本實驗分別考察了采用不同的色譜儀及色譜柱時，銀杏內(nèi)酯A、B、C色譜峰與白果內(nèi)酯色譜峰的相對保留時間。

1.2.6 一測多評法與外標法測定結(jié)果的比較：實驗采用一測多評法和外標法對5批舒血寧注射液的含量進行了檢測，取舒血寧注射液5批(通化谷紅制藥有限公司，規(guī)格：5 mL/支，批號：141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2)，照“1.2.1”項下方法處理，“1.2.2”項下色譜條件進樣，分別采用外標法和“一測多評法”計算舒血寧注射液中各組分的含量，并對測定結(jié)果進行t檢驗，證明2種方法差異無統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一測多評方法學考察結(jié)果

2.1.1 回歸方程及線性范圍：各組分的色譜圖見圖1、圖2；回歸方程及線性范圍見表1。

圖1 總內(nèi)酯混合對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of total lactones mixed reference substances

圖2 供試品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample

2.1.2 校正因子的計算結(jié)果：2個實驗室間的差異較小(RSD<1.0%)，見表2。

表2 不同實驗室測得的相對校正因子(銀杏總內(nèi)酯)

2.1.3 精密度試驗結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.3 %、0.2 %、0.5 %及0.6 %, 表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0. 9 %、0.7 %、1.2 %及1.5 %，表明舒血寧注射液供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 重復性試驗結(jié)果：銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0. 3 %、0.5 %、0.2 %及0.3 %，表明該方法重復性較好。

2.1.6 加樣回收試驗：加樣回收試驗結(jié)果見表3。

表3 4種銀杏總內(nèi)酯類成分的加樣回收率結(jié)果(n=9)

2.2 校正因子重現(xiàn)性的考察及各組分色譜峰的定位

2.2.1 不同儀器及色譜柱對校正因子的影響：結(jié)果表明不同儀器和不同色譜柱所得的相對校正因子差異性較小(RSD<0.5 %)，見表4。

表4 不同儀器及色譜柱RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.2.2 不同柱溫對相對校正因子的影響：結(jié)果表明柱溫對相對校正因子的影響不顯著(RSD<0.5 %)，見表5。

表5 不同柱溫RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.2.3 不同流速對相對校正因子的影響：結(jié)果表明不同的流速對相對校正因子的影響RSD<0.5 %，見表6。

表6 不同流速RCF耐用性考察(銀杏總內(nèi)酯)

2.3 待測組分色譜峰的定位 結(jié)果表明，不同色譜儀及色譜柱所測得的各成分相對保留時間差異無顯著性意義(RSD<0.5 %)，見表7。

表7 不同色譜儀及色譜柱相對保留時間(銀杏總內(nèi)酯)

2.4 一測多評法與外標法測定結(jié)果的比較：結(jié)果表明2種方法差異無統(tǒng)計學意義，見表8。

表8 不同批次樣品的含量測定(n=5)

3 討論

3.1 一測多評法的色譜峰的定位 中藥的化學成分非常復雜，在不同的色譜系統(tǒng)中會有不同的色譜峰，在同一色譜系統(tǒng)中，其色譜峰的數(shù)量、出峰時間及峰形等也受到色譜柱、儀器、溶劑、柱溫等諸多因素的影響，因此，待測成分色譜峰的定位至關(guān)重要。對于在一定的色譜條件下，色譜峰相對較少的中藥，可根據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》[7]推薦的相對保留時間對各組分的色譜峰進行定位。本實驗采取該方法定位，相對保留時間在不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱條件下重現(xiàn)性較好(RSD<0.5 %)。

3.2 “一測多評”法內(nèi)參物的選擇 實驗選擇白果內(nèi)酯作為內(nèi)參物，因為該成分在舒血寧注射液中含量較高，且性質(zhì)穩(wěn)定[8]。

3.3 檢測方法的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻資料，銀杏萜類內(nèi)酯含量測定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、示差檢測法、ELSD法等。由于萜類內(nèi)酯在紫外區(qū)吸收較弱，極少量的黃酮雜質(zhì)將會嚴重干擾檢測，使用紫外檢測器檢測較為困難，而示差檢測器靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性相對較差。本文參考有相關(guān)文獻[2]，選擇蒸發(fā)光散射檢測器對舒血寧注射液中的4種萜類內(nèi)酯成分進行檢測，靈敏度高，穩(wěn)定性好，方法專屬性強。

[1] 胡書佑.舒血寧注射液的臨床應用與安全用藥[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2012，32(11)：78-81.

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(編校：王冬梅)

《中國生化藥物雜志》參考文獻標準

綜述類文章參考文獻一般不少于25條，其他論文一般不少于15條；采用順序編碼制著錄，依照其在文中出現(xiàn)的先后順序用阿拉伯數(shù)字加方括號標出；參考文獻請作者盡量選擇近3年發(fā)表的文獻。參考文獻需引用本刊1～2篇文獻；參考文獻的作者，1～3名全部列出，3名以上者只列前3名，后加“等”或“et al”。英文文獻中的作者姓名寫法為：完整姓氏在前，名字采用縮寫字母在后。外文期刊縮寫以美國國立醫(yī)學圖書館編輯的《Index Medicus》格式為準；中文期刊用全名。

舉例：

期刊：[序號]作者.文題[J].刊名，年，卷(期)：起頁-止頁.

書籍：[序號]作者.書名[M].版次.出版地：出版者，出版年：起頁-止頁.

Simultaneous determination of four lactones ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker

MU Xiao-yin1Δ, LIU Li2

(1.Department of Science and Technology, Guizhou Pharmaceutical (Group) Limited Liability Company, Guiyang 550000, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Guizhou, Giyang 550000, China)

ObjectiveTo simultaneous determine four lactones(bilobalide and ginkgolides A, B and C) ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS),and evaluation the methodological.MethodsWith Ginkgo esters as the indexes,the relative correction factor(RCFs) between bilobalide and ginkgolides A, B, C were established. The content of bilobalide in Shuxuening injection were determined by external standard method, the content of ginkgolides A, B, C in Shuxuening injection was calculated by the relative correction factor. The results of the content of 5 batches of Shuxuening injection determined by QAMS and tested by external standard method were carried out by t test. ResultsThe RCFs of ginkgolides A, B, C with reference to bilobalide were 2.280,1.659 and 1.429.And the repeatability was good under different experimental conditions. There was no significant differences between the calculated value and estimated value on QAMS and external standard method of the 5 batches of Shuxuening injection, the results showed that the RCF was authentic.ConclusionThe established correction factor is good repeatability,and could be used for quantitative analysis and quality evaluation of multiple components in Shuxuening injection.

multi-components by single marker(QAMS); Shuxuening injection; relative correction factor(RCFs); total lactones; indexes; external standard method

穆簫吟，通信作者，女，本科，主管藥師，研究方向：藥物質(zhì)量分析，E-mail：2484014252@qq.com。

R284.1

A

1005-1678(2016)01-0169-05