彭璐，金鑫，李志群，連一江，張丹，夏智波

(1.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102；2.廈門市手性藥物重點實驗室，福建 廈門 361102； 3.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，福建 廈門 361003)

紅杜仲不同乙醇濃度提取物對HaCaT細胞抗氧化作用的比較及其抗氧化機制的研究

彭璐1,2，金鑫1,2，李志群1,2，連一江1,2，張丹1,3，夏智波1Δ

(1.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361102；2.廈門市手性藥物重點實驗室，福建 廈門 361102； 3.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，福建 廈門 361003)

目的 本研究對紅杜仲不同乙醇濃度提取物抑制H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷作用進行篩選。方法 以不同濃度乙醇進行回流提取分別獲得了30%、50%、70%及95%乙醇提取的四種紅杜仲醇提取物(Parabarium micranthum ethanol extract，PEE)，利用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)法測定其體外清除自由基的能力。以人永生化表皮細胞HaCaT為研究對象，通過不同濃度H2O2處理細胞并篩選以200 μmol/L作為建立H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型的最適濃度。設(shè)立對照組、H2O2損傷組和紅杜仲-H2O2組。通過微板法和比色法測定內(nèi)源性抗氧化酶活力及細胞存活率，2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針檢測細胞內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定Nrf2 mRNA表達量。結(jié)果 不同乙醇濃度提取的PEE在體外均具有清除DPPH自由基的作用，效果最強的70% 乙醇提取的PEE的IC50為7.6 mg/L；在細胞水平上，H2O2誘導(dǎo)使得HaCaT細胞內(nèi)抗氧化酶SOD及CAT活力降低，50%、70%及95%乙醇提取的PEE能夠顯著提高細胞內(nèi)抗氧化酶活力。其中70%乙醇提取的PEE的作用最為顯著，抗氧化酶活力的提高表現(xiàn)出劑量依賴性，并且能顯著提高細胞存活率、降低細胞內(nèi)ROS的水平(與氧化應(yīng)激組比，P<0.05或P<0.01)。同時，70%乙醇提取的PEE能夠顯著誘導(dǎo)抗氧化相關(guān)信號通路基因Nrf2 mRNA的表達。結(jié)論 70%乙醇提取的PEE可能通過激活Nrf2抗氧化信號通路，提高抗氧化酶活性，降低ROS水平，從而具有保護HaCaT細胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷作用。

紅杜仲；抗氧化機制；HaCaT細胞

紅杜仲為夾竹桃科杜仲藤屬植物杜仲藤(Parabariummicranthum(A.DC.)Pierre)、紅杜仲藤(P.chunnianumTsiang)、毛杜仲藤(P.huaitingiiChunetTsiang)及花皮膠藤屬花皮膠藤(EcdysantherautilisHay.etKaw.)的老莖皮和根皮的通稱[1]。紅杜仲味苦、微辛，具有祛風(fēng)濕、強筋骨的功能[2]，是我國華南地區(qū)民間常用的草藥之一。研究表明，紅杜仲含有黃酮類、酚類、生物堿等有效成分[3-5]，這使得其在抗氧化、降血脂等方面具有潛在的應(yīng)用前景。但是到目前為止，關(guān)于紅杜仲在細胞水平上的抗氧化活性缺乏深入的研究：一方面是對不同乙醇濃度回流提取工藝下的抗氧化能力差異缺乏有效的比較；另一方面是對紅杜仲的抗氧化機制沒有深入的研究。本研究將在HaCaT細胞中對紅杜仲不同乙醇提取物的抗氧化能力進行篩選，并探討其抗氧化機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 提取物制備：紅杜仲購自廈門鷺燕醫(yī)藥有限公司。取紅杜仲30 g，晾干后，加入480 mL95%乙醇浸泡40 min，85 ℃水浴回流提取2 h，過濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙醇后得到粗浸膏，將粗浸膏置于零下80 ℃結(jié)冰后用冷凍干燥機進行干燥，備用。用同樣的方法制備30%乙醇提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物。

1.1.2 試劑：MTS購自Promega公司；DCFH-DA和過氧化氫(3%)均購自Sigma-Aldrich公司；SOD和CAT試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；BCA試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；PIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；Nrf2和GAPDH引物購自Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2X)購自Fermentas公司。

1.1.3 儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；多功能酶標儀 SpectraMax M2(美國Molecular Devices)；多功能粉碎機(永康市小寶電器有限公司)；冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；Ti-S型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)；Bio-Rad電泳系統(tǒng)(美國Rio-Rad)；PCR儀(德國biometre)。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT細胞的培養(yǎng)及氧化損傷模型的建立：HaCaT細胞購自美國菌種保藏中心。采用含10%FBS，1%青、鏈霉素的MEN培養(yǎng)液，于37 ℃，含5%CO2，飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞為單層貼壁生長，根據(jù)細胞生長情況換液，以0.25%胰酶消化傳代。

取對數(shù)生長期細胞接種96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入含不同濃度PEE的培養(yǎng)液，對照組只加培養(yǎng)液，之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTS法測定各孔吸光值(A)，并按照如下公式計算細胞的存活率，以細胞存活率≥90%作為標準確定紅杜仲對細胞的安全濃度。

細胞存活率=A處理/A對照×100%。

取對數(shù)生長期細胞接種96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入含不同濃度的H2O2(0, 10, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 μmol/L)，對照組只加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTS法測定各孔的吸光值，計算細胞存活率以篩選H2O2作用于細胞的損傷濃度，建立氧化損傷模型。

1.2.2 DPPH自由基清除活性的檢測：DPPH自由基清除活性的檢測根據(jù)Brand-Williams的方法[6]。不同濃度的PEE與DPPH醇溶液1:1混合，室溫暗處孵育30 min后測定樣品在517 nm處的吸光值(A)。按如下公式計算。

DPPH清除率=[A對照-(A樣品-A調(diào)零)]/A對照×100%。

其中A調(diào)零為樣品與不含DPPH的醇溶液的測定值，每份樣品測定4個復(fù)孔并取平均值。為了計算樣品的IC50，PEE至少選定5個不同濃度進行測定，通過線性擬合進行計算分析。該實驗獨立重復(fù)測定3次。

1.2.3 細胞內(nèi)SOD、CAT活力及蛋白含量的測定：取對數(shù)期細胞接種6孔板，接種密度為2× 105/孔。分組：對照組、H2O2損傷組、紅杜仲-H2O2組。24 h后紅杜仲-H2O2組給予不同濃度的PEE(2.5、5、10 mL)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，H2O2損傷組、紅杜仲-H2O2組加入1.2.1選出的H2O2損傷濃度，對照組加入新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS洗3次，用細胞刮刀刮下細胞，用RIPA裂解液冰上裂解30 min后，12000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。按照試劑盒說明分別測定SOD、CAT酶活力。該實驗獨立重復(fù)測定3次，結(jié)果以相對于對照組的百分比表示，計算公式：酶活力=A處理/A對照×100%。

1.2.4 MTS法檢測細胞存活率：取對數(shù)生長期細胞接種96孔板，分組及處理方法同1.2.3，所選擇的PEE及其濃度由1.2.2及1.2.3確定。MTS法測定各孔吸光值，計算細胞存活率。該實驗獨立重復(fù)測定3次，結(jié)果以相對于對照組的百分比表示。

1.2.5 細胞內(nèi)ROS水平的檢測：前處理同2.3，培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗3次，加入25 μmol/L的DCFH-DA孵育30 min后用PBS洗3次。其中一組在熒光顯微鏡下進行拍照觀察；另外一組用細胞刮刀將細胞刮入1% Triton X-100后，BCA法測定蛋白含量，測定樣品在488 nm激發(fā)光、520 nm發(fā)射光下的吸光值，熒光強度表示為吸光值相對于蛋白含量的比值。該實驗獨立重復(fù)測定3次，結(jié)果以相對于對照組的百分比表示，英光強度=A各組/蛋白濃度。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測HaCaT細胞Nrf2 mRNA表達：前處理同2.3，Trizol提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，目的基因Nrf2序列為F：5’-AACCAGTGGATCTGCCAAC-3’;R：5’-GACCGGG-AATATCAGGAACA-3’。內(nèi)參基因GAPDH序列為F：5’-GGCATG-GCCTTCCGTGTCCC-3’;R：5’-TGCCAGCCCCAGCGTCAAAG-3’。PCR條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s(共33個循環(huán)),72 ℃ 10 min，4 ℃暫停。取PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。用ImageJ軟件對條帶亮度進行分析，取目的基因灰度值與內(nèi)參基因灰度值的比值。該實驗獨立重復(fù)測定3次，結(jié)果以相對于對照組的百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 不同乙醇濃度提取的PEE的安全濃度范圍及H2O2損傷濃度的確定 在0 mg/L～10 mg/L濃度范圍內(nèi)，30%、50%、70%及95%乙醇提取的PEE作用于HaCaT細胞的存活率≥90%。因此，在該濃度范圍內(nèi)PEE對細胞安全(圖1)。HaCaT細胞存活率與H2O2作用濃度呈負相關(guān)，當H2O2濃度為200 μmol/L時，細胞存活率降至最低，以此濃度建立氧化損傷模型。

圖1 不同乙醇濃度提取的PEE(A)和不同濃度過氧化氫(B)對HaCaT細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different ethanol extracts of PEE (A) and different

2.2 不同乙醇濃度提取的PEE的DPPH自由基清除活性 紅杜仲30%、50%、70%及95%醇提物的DPPH自由基清除的IC50分別為8.2 mg/L、11.5 mg/L、7.6 mg/L及8.1 mg/L，其中70%醇提取的DPPH清除力最強。該實驗獨立重復(fù)測定3次。

2.3 不同乙醇濃度提取的PEE對細胞內(nèi)抗氧化酶SOD及CAT活性的影響 結(jié)果表明(圖2)：與對照組相比，H2O2損傷組的細胞內(nèi)SOD酶活力及CAT酶活力均極顯著下降(P<0.01)；與H2O2損傷組相比，50%、70%及95%乙醇提取的PEE的加入能夠顯著提高細胞內(nèi)SOD酶活力，而紅杜仲70%及95%乙醇提取的PPE的加入能夠顯著提高細胞內(nèi)CAT酶活力，其中70%乙醇提取的PEE效果最為明顯，在2.5 mg/L～10 mg/L范圍內(nèi)均能夠極顯著提高細胞內(nèi)SOD酶活力(P<0.01)，而在5 mg/L～10 mg/L范圍內(nèi)也能夠極顯著提高細胞內(nèi)CAT酶活力(P<0.01)，結(jié)果均表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。由以上結(jié)果可知，70%乙醇提取的PEE具有最好的抗氧化效果。

圖2 不同乙醇濃度提取的PEE對HaCaT細胞內(nèi)SOD及CAT活力的影響1：對照組；2：H2O2損傷組；3：2.5 mg/L紅杜仲-H2O2組；4：5 mg/L/紅杜仲-H2O2組； 5：10 mg/L紅杜仲-H2O2組*P<0.01，與對照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與H2O2損傷組比較Fig.2 Effect of different ethanol extracts of PEE on the SOD and CAT activities in 1: control group; 2:H2O2 injury group; 3:2.5 mg/L PEE-H2O2 group; 4:5 mg/L PEE-H2O2 group; 5:10 mg/L PEE-H2O2 group*P<0.01，compared with control group post-treatment；#P<0.05，##P<0.01，compared with H2O2 damage group

2.4 紅杜仲70%醇提物對細胞存活率的影響 200 μmol/LH2O2處理細胞24 h后引起細胞存活率的極顯著下降(P<0.01)。紅杜仲70%醇提物可有效防止H2O2對細胞的損傷，與H2O2損傷組相比，2.5、5和10 mg/L的醇提物均能提高細胞的存活率(P<0.05或P<0.01)，并且呈濃度依賴的趨勢。見表1。

表1 70%乙醇提取的不同濃度的PEE對氧化應(yīng)激狀態(tài)下HaCaT細胞的影響

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，##P<0.01，與H2O2損傷組比較，compared with H2O2injured group

2.5 紅杜仲70%醇提物對細胞內(nèi)ROS水平的影響 200 μmol/L H2O2處理細胞24 h后引起細胞內(nèi)熒光強度的極顯著提高(P<0.01)，說明造模引起HaCaT細胞內(nèi)的ROS水平的升高。紅杜仲70%醇提物可顯著降低受損HaCaT細胞內(nèi)的ROS水平(P<0.01)，且呈濃度依賴的趨勢(見表1)。熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果與上述結(jié)果一致。見圖3。

圖3 DCFH-DA熒光染色后HaCaT細胞內(nèi)ROS的變化(×200)Fig.3 Comparison of ROS in HaCaT cells with DCFH-DA fluorescence staining (×200)

2.6 紅杜仲70%醇提物對Nrf2 mRNA表達量的影響 由逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果可看出(圖4)，H2O2的誘導(dǎo)使得細胞內(nèi)Nrf2 mRNA的表達水平相比對照組極顯著下調(diào)(P<0.01)；與H2O2損傷組相比，2.5、5和10 mg/L的醇提物均能顯著提高Nrf2 mRNA的表達量(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。

圖4 70%乙醇提取的PEE對氧化應(yīng)激HaCaT細胞的Nrf2 mRNA表達的影響1：對照組；2：H2O2損傷組；3：2.5 mg/L紅杜仲-H2O2組；4：5 mg/L/紅杜仲-H2O2組；5：10 mg/L紅杜仲-H2O2組**P<0.01，與對照組比較；#P<0.05，##P<0.01，與H2O2損傷組比較Fig.4 Effect of different concentrations of PEEextract by 70% ethanolon Nrf2 mRNA expression of HaCaT cells under oxidative ±s，n=3)1: control group; 2:H2O2 injury group; 3:2.5 mg/L PEE-H2O2 group; 4: 5 mg/L PEE-H2O2 group; 5:10 mg/L PEE-H2O2 group**P<0.01，compared with control grouppost-treatment；#P<0.05，##P<0.01，compared with H2O2 damage group

3 討論

氧自由基對生命而言必不可少，其在諸如抵抗病原體、調(diào)節(jié)信號過程及壞死等生理活動中發(fā)揮著重要的作用[7]。一旦體內(nèi)氧自由基的平衡被打破，所造成的氧化損傷會對人體造成極大的危害[8]。皮膚作為連接人體與外界環(huán)境的媒介，極易暴露于污染物、紫外等理化損傷中，導(dǎo)致有害的氧自由基的積累并引起氧化損傷[9]。因此利用人表皮細胞作為研究對象進行抗氧化研究對藥物抗氧化效果的篩選及機制研究具有重要的參考價值。

為了清除或者降低氧自由基所造成的損傷，細胞進化出了一系列復(fù)雜的抗氧化機制，其中就包括了抗氧化酶系統(tǒng)，比如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)。本實驗結(jié)果表明H2O2導(dǎo)致HaCaT細胞內(nèi)SOD及CAT酶活力顯著降低(P<0.01)，提示H2O2導(dǎo)致HaCaT細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。而紅杜仲不同乙醇濃度提取物對H2O2所致的保護能力存在差異，其中70%乙醇提取物的效果最為明顯，不僅SOD及CAT的酶活力得到提高，細胞的存活率也獲得顯著的提升(同H2O2損傷組比，P<0.05或P<0.01)，能夠使細胞的氧化應(yīng)激損傷趨于正常。

在氧化應(yīng)激損傷下，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致細胞內(nèi)的氧自由基積累過多[10]。因此，ROS的生成量可以直接反應(yīng)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷程度。從本實驗檢測的ROS熒光讀值及熒光照片均可看出，H2O2可以使細胞內(nèi)ROS水平極顯著升高(P<0.01)，而紅杜仲70%乙醇提取物的保護則可使其降低至正常水平(與H2O2損傷組比，P<0.01)，進一步表明紅杜仲70%乙醇提取物對HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。

Nrf2-Keap1-ARE信號通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要信號途徑之一。Nrf2是亮氨酸拉鏈家族的調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，幾乎在所有組織中均有表達，Keap1是其特異性受體[11]。在正常狀態(tài)下Nrf2與Keap1結(jié)合，功能受到抑制；在氧化應(yīng)激狀況下，Nrf2與Keap1解離，通過bZIP與小Maf蛋白形成的異二聚體識別ARE上的基因序列并與之結(jié)合從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄[12]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可導(dǎo)致細胞Nrf2 mRNA水平的降低(與對照組比，P<0.01)，而70%乙醇提取的PEE能夠誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)Nrf2 mRNA表達水平的顯著上調(diào)(與H2O2損傷組比，P<0.01)，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。推測70%乙醇提取的PEE可能是通過調(diào)控HaCaT細胞內(nèi)Nrf2相關(guān)的抗氧化通路，上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達與活力以清除細胞內(nèi)的氧自由基，從而防止HaCaT細胞遭受氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，利用70%乙醇回流提取工藝提取的紅杜仲組分具有最好的抗氧化效果，該部分提取物的抗氧化效果可能與Nrf2相關(guān)的抗氧化通路的激活有關(guān)。而該組分的進一步細分、提純以及其的抗氧化調(diào)控機制還有待進一步探索。

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(編校：譚玲)

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Research on the antioxidant capacity ofParabariummicranthumextracted by different ethanol concentrations and its antioxidant mechanism on HaCaT cells

PENG Lu1,2, JIN Xin1,2, LI Zhi-qun1,2, LIAN Yi-jiang1,2, ZHANG Dan1,3, XIA Zhi-bo1Δ

(1.Medical College, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2.Xiamen Municipal Key Laboratory of Chiral Drugs, Xiamen 361102,China; 3. Department of Internal Medicine Cardiology,The First Affiliated Hospital of Xiamen university, Xiamen 361003,China)

ObjectiveThe aim of this research was to screen the antioxidant capacity of Parabarium micranthum extract of various ethanol concentrations against H2O2-induced oxidative stress in HaCaT cells.MethodsParabarium micranthum extracts reflux purified with 30%, 50%, 70% and 95% ethanol (PEE) were objected to screening for their free radical scavenging capacities in vitro by DPPH.Cultured HaCaT human keratinocytes were randomly assigned to control, H2O2and PEE+ H2O2groups.The cultured HaCaT cells were treated with different concentrations of H2O2and 200 μmol/L H2O2was selected to establish H2O2-induced oxidative stress model.For the PEE+ H2O2group, the cells were treated with PEE extracts of various ethanol concentrations before exposure to H2O2.Endogenous antioxidant enzyme activity and cell viability were detected by microplate assay and colorimetric method.Intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by DCFH-DA fluorescent probe.Nrf2 mRNA expression was evaluated by reverse transcription PCR.ResultsAll PEE extracts of various ethanol concentrations showed effective DPPH free radical scavenging capacities of which the 70% ethanol PEE extract exhibited the strongest scavenging activity (IC50=7.6 mg/L).H2O2treatments induced oxidative stress in HaCaT and thus caused a decrease in antioxidant enzyme activities of SOD and CAT.However, the PEE extracts of 50%, 70% and 95% ethanol could observably increase the enzyme activity of SOD and CAT.Among these, the 70% ethanol extracted PEE showed significant effect on enzyme activities in a dose-dependent manner.It could also obviously improve the cell viability and reduce the intracellular ROS level (compared with oxidative stress group,P<0.05 orP<0.01).In addition, 70% ethanol extracted PEE could remarkably enhance the expression of Nrf2 mRNA, a gene that regulates the anti-oxidative signaling pathway.ConclusionThe findings of the present study suggest that 70% ethanol extracted PEE can attenuate H2O2-induced oxidative damage, which functions via the regulation of the Nrf2-related anti-oxidative signaling pathway, enhancement of the antioxidant activity of SOD and CAT, and reduction of ROS level.

Parabarium micranthum; antioxidant mechanism; HaCaT cell

彭璐，女，碩士，助理實驗師，研究方向：心血管藥理，E-mail:penglu@xmu.edu.cn；夏智波，通信作者，男，碩士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥研究，E-mail:xiazhibo@xmu.edu.cn

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1005-1678(2016)01-0023-05