蔣仕強(qiáng)　李楊　周?chē)?guó)英　劉君昂　萬(wàn)智　蔣越西　李河

摘 要 對(duì)分離自海南4個(gè)地區(qū)13種寄主植物上暹羅炭疽菌的ITS-CAL-GAPDH 3基因序列進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。95條暹羅炭疽菌多基因序列可定義為16個(gè)單倍型，其中，單倍型H5為主要單倍型，分布于所有寄主植物。AMOVA分析顯示，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)；病菌未經(jīng)歷過(guò)大規(guī)模的種群擴(kuò)張過(guò)程。研究結(jié)果表明，暹羅炭疽菌種群具有豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞 暹羅炭疽菌；寄主植物；多基因序列；群體遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào) S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

炭疽菌屬（Colletotrichum Corda）真菌是一類(lèi)全球性分布的植物病原菌，尤其是在熱帶、亞熱帶地區(qū)，可侵染油茶（Camellia oleifera）、辣椒（Capsicum annuum）、蘋(píng)果（Malus domestica）、山茶（Camellia sinensis）、檀香（Santalum albumL.）等多種植物[1-3]，導(dǎo)致植物落葉、落果，甚至枯死，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。暹羅炭疽菌（C. Siamense）是膠孢炭疽菌（C. Gloeosporioides）復(fù)合種之一，最早在泰國(guó)咖啡上被發(fā)現(xiàn)可引起咖啡炭疽病[4]；韓永超等[5]發(fā)現(xiàn)C. siamense可引起武漢地區(qū)草莓炭疽?。焕詈拥萚3]從湖南、廣西等地區(qū)油茶樹(shù)上采集炭疽病樣品，通過(guò)病菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)C. siamense為油茶炭疽病病原之一。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)Colletotrichum siamense的研究?jī)H限于種的鑒定，而對(duì)其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可為弄清該病菌進(jìn)化歷程提供理論依據(jù)。由于海南島獨(dú)特的熱帶季風(fēng)氣候，非常適合炭疽病菌的生長(zhǎng)繁殖，近年來(lái)油茶在海南地區(qū)大面積種植，油茶林中雜草、灌木等植物種類(lèi)較多，炭疽病害越來(lái)越嚴(yán)重。本研究從海南4個(gè)地區(qū)油茶林中采集油茶及其他寄主植物炭疽病樣品，并利用ITS-CAL-GAPDH 3基因序列對(duì)不同寄主來(lái)源的暹羅炭疽菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期從分子水平弄清海南地區(qū)不同寄主上暹羅炭疽菌種群的遺傳變化規(guī)律，這對(duì)于闡明該病害流行機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來(lái)源：樣品采自海南省五指山市南圣鎮(zhèn)、通什鎮(zhèn)、屯昌縣楓木林場(chǎng)和澄邁林場(chǎng)4個(gè)樣地，寄主植物包括油茶（Camellia oleifera）、桃花心木（Khaya senegalensis）、羊蹄甲（Bauhinia purpurea）、石楠（Photinia serrulata）、山麻桿（Alchornea davidii）、香樟（Cinnamomum camphora）、黃蘭（Michelia champaca）、檵木（Loropetalum chinensis）、鯽魚(yú)膽（Maesa perlarius）、山礬（Symplocos caudata）、茶樹(shù)（Camellia sinensis）、檀香（Santalum album）和葛根（Pueraria lobata）共13種植物。病原菌分離方法參考方中達(dá)[6]的組織分離法，從病健交界處組織進(jìn)行分離，于PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)回接實(shí)驗(yàn)、形態(tài)觀察和多基因分子鑒定，確定了95株暹羅炭疽菌。本實(shí)驗(yàn)寄主來(lái)源及菌株數(shù)量等信息見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 用滅菌牙簽刮取0.5 g菌絲，使用DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取方法參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，-20 ℃保存。

1.2.2 基因選擇、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 基因選擇及目的片段擴(kuò)增與測(cè)序參照Weir等[7]的方法、反應(yīng)體系及條件。對(duì)所有分離篩選獲得的菌株，選擇核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）、鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin，CAL）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）進(jìn)行擴(kuò)增。相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物和退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

DNA序列采用BioEdit軟件[8]進(jìn)行編輯加工并輔以手工調(diào)整。使用MEGA6.0軟件對(duì)核苷酸組成、變異位點(diǎn)等信息進(jìn)行分析。不同寄主炭疽病菌群體的ITS-CAL-GAPDH單倍型分析利用軟件GenALEx6完成，同時(shí)對(duì)不同群體的單倍型多樣性進(jìn)行分析。運(yùn)用DnaSP5.0軟件[9]計(jì)算暹羅炭疽菌3個(gè)基因拼接序列的核苷酸多樣性（nucleotide diversity，Pi）、不同寄主群體間遺傳分化指數(shù)（fixation index，F(xiàn)ST）及對(duì)所有病菌群體序列的單倍型錯(cuò)配進(jìn)行分析；使用TCS1.21軟件[10]構(gòu)建暹羅炭疽菌單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：將依據(jù)ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因推導(dǎo)出的單倍型序列與GenBank中炭疽屬真菌菌株的ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，構(gòu)建近鄰歸群（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用自展法（Bootstrap，1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的置信度[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 暹羅炭疽菌單倍型分布及其多樣性

ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因拼接序列共1 385個(gè)堿基，核苷酸組成分析表明：A+T含量46.0%略低于C+G含量54.0%；共發(fā)現(xiàn)28個(gè)變異位點(diǎn)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)25個(gè)，單突變位點(diǎn)3個(gè)；95條暹羅炭疽菌ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因序列定義了16種單倍型，各單倍型在不同種群中的分布見(jiàn)表2。在所有單倍型中，單倍型H5為主要單倍型，分布于所有寄主植物，占總序列數(shù)量的66.3%，結(jié)果表明種群間存在基因交流。此外，油茶上含有單倍型最多，含有6種單倍型，而檀香與檵木含有單倍型的數(shù)量最少，僅有1種單倍型。多種寄主均含有自己獨(dú)特的單倍型，如鯽魚(yú)膽含有H11，山麻桿含有H6，油茶含有H15等，這表明每個(gè)群體內(nèi)存在獨(dú)立進(jìn)化，群體間存在一定程度的遺傳分化。

暹羅炭疽菌不同種群的單倍型多樣性見(jiàn)表2，除檀香及檵木病菌樣品只有1種單倍型，單倍型多樣性為0外，其他種群的單倍型多樣性在0.245～0.667之間，其中黃蘭及香樟病菌樣品的單倍型多樣性最高，均為0.667；山麻桿病菌樣品的單倍型多樣性最低，為0.245。暹羅炭疽菌的ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因拼接后核苷酸多樣性（Pi）也處于較高水平（表2），除檀香及檵木種群的Pi為0外，其他11個(gè)種群的Pi在0.000 21～0.001 25之間。結(jié)果表明，暹羅炭疽菌在海南多種寄主上具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析及種群擴(kuò)張分析

由病菌ITS-CAL-GAPDH 3個(gè)基因拼接序列單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖1）可知，暹羅炭疽菌各單倍型并未依寄主植物形成各自的分支，而是以單倍型H5為輻射中心，呈現(xiàn)出一個(gè)非典型星狀發(fā)散圖，H5可能為原始單倍型。從圖中還可以看出大部分單倍型通過(guò)一次或數(shù)次突變與原始單倍型H5相連。此外，由暹羅炭疽菌不同種群3基因拼接序列的核苷酸不配對(duì)分布圖（圖2）可知，分布曲線呈單峰曲線，說(shuō)明海南地區(qū)不同寄主上暹羅炭疽菌可能經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張或“瓶頸效應(yīng)”。

2.3 不同寄主種群暹羅炭疽菌的AMOVA分析

由表3可知暹羅炭疽菌種群變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，占總變異的90%，而種群間的變異僅占10%，這說(shuō)明病菌不同寄主群體間基因交流頻繁。暹羅炭疽菌不同寄主種群間和種群內(nèi)的變異差異顯著大于0，表明暹羅炭疽菌不同寄主種群內(nèi)的遺傳變異顯著（p<0.05）。

2.4 暹羅炭疽菌不同寄主種群間遺傳分化分析

Wright[12]提出遺傳分化指數(shù)（Fst）小于0.05，群體間遺傳分化很弱；Fst值介于0.05～0.15之間，群體間存在中等程度遺傳分化；Fst值介于0.15～0.25之間，群體間遺傳分化較大；Fst值大于0.25，表明群體間遺傳分化極大。本研究中海南4個(gè)地區(qū)暹羅炭疽菌不同寄主種群間遺傳分化值見(jiàn)表4，羊蹄甲與其余12個(gè)種群的Fst值大于0.25，群體間遺傳分化極大；黃蘭與葛根、檀香、山礬、檵木、香樟、山麻桿及石楠之間的Fst值介于0.15～0.25之間，群體間遺傳分化較大；石楠、香樟分別與葛根、檀香、山礬、鯽魚(yú)膽及檵木之間的Fst值介于0.05～0.15之間，心木與石楠、山麻桿、香樟、黃蘭、檵木、山礬、茶樹(shù)及檀香之間的Fst值介于0.05～0.15之間，油茶與葛根、黃蘭、香樟、石楠和茶樹(shù)與黃蘭之間的Fst值也介于0.05～0.15之間，表明這些群體間存在中等程度遺傳分化；其余種群間Fst值小于0.05，表明這些種群間遺傳分化很弱，基因交流十分頻繁。

2.5 基于ITS-CAL-GAPDH 3基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

暹羅炭疽菌ITS-CAL-GAPDH 3基因序列單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3，所有種群?jiǎn)伪缎蜕y地分布在系統(tǒng)樹(shù)中，同一種群的單倍型序列并未聚在一起，不同種群的獨(dú)特單倍型并未完全形成自己特有的進(jìn)化枝。此外，16種單倍型與GenBank中的模式菌株C. siamense（ICMP18578*、ICMP18642*）以很高的支持率聚為一支，也驗(yàn)證了從13種寄主植物上分離到的95個(gè)菌株均為暹羅炭疽菌。

3 討論

炭疽病是由炭疽病菌引起的一種重要植物病害，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。暹羅炭疽菌為植物炭疽病病原之一，其地理分布較廣，寄主植物較多，對(duì)經(jīng)濟(jì)樹(shù)種、農(nóng)作物等植物造成很大的危害[3-5]。遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，一個(gè)物種的多樣性越高，其在復(fù)雜的自然環(huán)境中生存的幾率越高，對(duì)不同生存環(huán)境的適應(yīng)力也越強(qiáng)[13]。研究病菌遺傳結(jié)構(gòu)可為弄清病菌對(duì)不同環(huán)境、寄主的適應(yīng)能力提供理論基礎(chǔ)。劉詩(shī)胤等[14]對(duì)浙江地區(qū)不同寄主來(lái)源的炭疽菌ITS序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同寄主來(lái)源的菌株聚在一起，親緣關(guān)系較近，且不同菌株ITS序列具有豐富的多態(tài)性。

植物炭疽病菌為了適應(yīng)不同地理、寄主環(huán)境的變化，表現(xiàn)出了較為豐富的遺傳變異。易克賢等[15]對(duì)43株中國(guó)柱花草炭疽菌株進(jìn)行基因組DNA分析，并和國(guó)外菌株進(jìn)行綜合聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)或同一寄主的菌株聚成一類(lèi)，表明炭疽菌在遺傳上存在寄主專(zhuān)化性，在地理距離上具有各自獨(dú)立的進(jìn)化歷程。但在本研究的暹羅炭疽菌單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌同一種群的單倍型并未聚在一起，而是散亂的分布在系統(tǒng)樹(shù)中；同時(shí)發(fā)現(xiàn)種群間存在一定程度的遺傳分化，這可能是病菌受寄主選擇等因素所致。李利霞等[16]采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)不同地區(qū)葡萄膠孢炭疽菌進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)葡萄膠孢炭疽菌群體遺傳多樣性豐富，但各菌株間存在遺傳差異。這與本研究得到的暹羅炭疽菌群體遺傳多樣性豐富，不同寄主的病菌之間遺傳分化較大的結(jié)論相同。

很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，植物病原菌在進(jìn)化過(guò)程中存在基因流，同時(shí)種群間存在遺傳變異。朱丹雪等[17-18]對(duì)我國(guó)不同油茶產(chǎn)區(qū)油茶炭疽病菌進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病菌種群變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，病菌種群間基因交流頻繁。本研究發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌種群變異也主要發(fā)生在種群內(nèi)，種群間變異僅占10%，且病菌可在不同寄主間傳遞基因流。王玲等[19]對(duì)水稻紋枯病菌5個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)單倍型H5分布于每一個(gè)種群中；Pascual等[20]也發(fā)現(xiàn)在不同玉米紋枯病菌種群間存在相同單倍型。本研究中，發(fā)現(xiàn)主要單倍型H5存在于所有寄主植物上，這表明單倍型H5能夠適應(yīng)生存環(huán)境的變化；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同寄主種群間存在其他相同單倍型，例如茶樹(shù)、山礬、香樟和油茶均存在單倍型H16。這說(shuō)明暹羅炭疽菌種群間的基因流未受寄主差異的影響，其優(yōu)勢(shì)單倍型可在不同寄主間進(jìn)行傳播，導(dǎo)致毒性較強(qiáng)的基因型在種群內(nèi)維持下去，因而增加了對(duì)該病害的防治難度。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)鯽魚(yú)膽、黃蘭、山麻桿、羊蹄甲、心木及油茶等6個(gè)寄主上均含有至少一個(gè)獨(dú)特的單倍型。在長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)化過(guò)程中，病菌為了適應(yīng)環(huán)境變化或寄主選擇，形成了自己獨(dú)特的單倍型，增加了種群的遺傳多樣性。而目前很多地區(qū)大量使用單一殺菌劑來(lái)防治植物炭疽病，導(dǎo)致某些耐藥性的單倍型菌株仍會(huì)存活下去[21-22]，進(jìn)而繁殖、傳播其優(yōu)勢(shì)單倍型，導(dǎo)致植物炭疽病在全世界廣泛發(fā)生并難以有效控制。本研究所分析樣品序列來(lái)自海南4個(gè)地區(qū)13種寄主植物，不同種群樣品序列數(shù)存在一定差異，但本研究的結(jié)果已能夠清晰的顯示海南4個(gè)地區(qū)不同寄主植物暹羅炭疽菌具有豐富的遺傳多樣性，揭示了該病害在海南乃至全國(guó)廣泛發(fā)生和危害嚴(yán)重的理論基礎(chǔ)。為了更加全面了解暹羅炭疽菌在不同寄主植物上的進(jìn)化關(guān)系，從分子水平為有效控制植物炭疽病提供理論依據(jù)。下一步將擴(kuò)大采樣范圍，增加更多地區(qū)、寄主來(lái)源病菌，同時(shí)應(yīng)用其他分子標(biāo)記，以獲取暹羅炭疽菌更多的遺傳信息，為闡明該病害流行機(jī)制提供理論依據(jù)。

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