陳俊杰　湯佳　陳輝　鄭國華　鄭鈺銦　劉國敏

摘 要 以油茶優(yōu)良無性系‘閩43和‘閩60所產(chǎn)果實(shí)為試材，研究油茶果實(shí)生長發(fā)育過程中油脂積累規(guī)律。結(jié)果表明，‘閩43和‘閩60種子中乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）和磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性均在9月至果實(shí)成熟期間快速上升，基本上與種子內(nèi)油脂合成的高峰期相吻合，ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量均呈顯著正相關(guān)，表明油茶種子內(nèi)ACCase和PPase活性促進(jìn)了油脂合成。兩無性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)，與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)?？梢娪椭姆e累伴隨著蛋白質(zhì)與糖類的代謝、分解與轉(zhuǎn)化，推測一部分的蛋白質(zhì)和糖類可被代謝轉(zhuǎn)化形成油脂。

關(guān)鍵詞 油茶；果實(shí)生長發(fā)育；油脂積累；油脂合成相關(guān)酶

中圖分類號(hào) S606.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

油茶（Camellia oleifera Abel.）屬山茶科山茶屬常綠小喬木或灌木，廣義上油茶泛指山茶屬中油脂含量較高并具有一定栽培面積的物種，與油棕、油橄欖、椰子并稱為“世界四大木本食用油料植物”[1-2]。油茶極具利用價(jià)值，其果實(shí)中的茶籽榨取的茶油色清而味香。茶油中亞油酸和亞麻酸的含量比例為4 ∶ 1，是營養(yǎng)學(xué)界里最佳配比的“腦黃金”。茶油的脂肪酸結(jié)構(gòu)和比例與橄欖油極其相似，有“東方橄欖油”的美稱[3]。

油脂是木本食用油料植物果實(shí)的主要成分，因此含油量成為評(píng)價(jià)油料植物果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。Mahmood等對112個(gè)芥菜型油菜DH系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)油脂含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)[4]。目前，對于油茶果實(shí)的研究大多集中在與果實(shí)含油量相關(guān)的影響因子[5-6]、成熟果實(shí)脂肪酸組成分析[7-9]、果實(shí)病蟲害防治[10-12]、油茶果實(shí)表型性狀的變異[13-16]以及采后生理[17-19]等幾個(gè)方面，對油茶果實(shí)采前生理即生長發(fā)育過程的系統(tǒng)研究較少。本文以福建省油茶主栽無性系‘閩43和‘閩60為材料，研究油茶果實(shí)生長過程中油脂積累的變化規(guī)律，旨在揭示油茶果實(shí)生長發(fā)育及油脂轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，為栽培實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為福建省2個(gè)普通油茶優(yōu)良無性系‘閩43和‘閩60所產(chǎn)的果實(shí)，這2個(gè)無性系種植于福建省閩侯縣桐口國有林場油茶種質(zhì)資源圃，和其它無性系一起采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，每個(gè)無性系10株為一小區(qū)，共3個(gè)區(qū)組。該林場地處E 119°17'、N 26°05'，氣候溫和，雨量充沛，海拔高度約為100 m，適宜油茶生長。課題組前期已對這兩個(gè)無性系的果實(shí)形態(tài)性狀進(jìn)行了測定[20]。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集方法 2014年4月1日至11月9日，對各無性系果實(shí)進(jìn)行觀察和取樣測定。選取樹體特征與生長條件基本一致的無病蟲害植株，在晴朗或陰天的上午10 ： 00左右定期連續(xù)采樣，共采樣12次。7月10日之前每隔30 d采1次，7月10日之后油脂合成逐漸增多，適當(dāng)縮短取樣時(shí)間，每隔15 d采集1次，直至果實(shí)完全成熟。在油茶種質(zhì)資源圃中每個(gè)區(qū)組隨機(jī)采集3個(gè)植株的果實(shí)，每個(gè)植株從東南西北4個(gè)方向采收生長發(fā)育期接近、無病蟲害的果實(shí)各10個(gè)。采摘的油茶果實(shí)用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，立即敲碎分離果皮和種子，待種皮硬化后剝離，將種子用液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 粗脂肪及果實(shí)營養(yǎng)成分的測定 粗脂肪的測定采用索氏抽提法，參照陳永忠等[21]的方法。可溶性糖、蔗糖的測定參考張志良等[22]的方法?？扇苄缘鞍?、還原糖的測定參照王學(xué)奎[23]的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》，其中可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；可溶性淀粉的測定參照宗學(xué)鳳等[24]的蒽酮比色法。

1.2.3 乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）活性的測定

參照楊若琳等[25]的方法稍作改進(jìn)。稱3 g鮮樣，切碎于研缽中，加入少量石英砂后再加入5 mL預(yù)冷的提取Buffer快速研磨，轉(zhuǎn)入50 mL離心管，于研缽中再加入5 mL預(yù)冷的提取Buffer將殘余的樣品全部轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4 ℃條件下靜置2 h。將靜置后的勻漿液離心30 min（4 000 r/min，4 ℃），留清液棄沉淀。將上清液繼續(xù)離心30 min（10 000 r/min，4 ℃），棄去沉淀，保留上清液，即為待測液，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管內(nèi)備用。應(yīng)用植物乙酰輔酶A羧化酶（ACC）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒的說明方法對ACCase的活性進(jìn)行測定。

1.2.4 磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性的測定

參照西北農(nóng)業(yè)大學(xué)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)測定[26]，酶活性以每小時(shí)每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生的P的毫克數(shù)，單位為mg/（g·h）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理繪圖。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析、多重比較和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗脂肪含量變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)粗脂肪含量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示，果皮和種子中粗脂肪含量變化差異大，果皮中粗脂肪含量整體水平較低?！}43果皮中粗脂肪含量在8月9日前甚微，8月9日后緩慢增多，9月10日達(dá)到最大值2.94%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在6月10前含量同樣甚微，幾乎無測出，7月10日后開始緩慢增加，9月26日后粗脂肪含量開始急劇上升，在果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值45.05%?！}60果皮中粗脂肪含量在7月26日前幾乎無測出，在8月9日達(dá)到最大值1.90%，此后逐漸下降；種子中粗脂肪含量在9月10日前均處于較低水平，9月10日后幾乎呈線性上升直至果實(shí)成熟，成熟時(shí)果實(shí)粗脂肪含量為43.48%?？傮w上，可以看出油茶果實(shí)中脂肪的積累主要在種子中，且油茶種子中粗脂肪的積累主要在生長的中后期，這與大多數(shù)的油料植物種子中脂肪的積累規(guī)律相近。

2.2 乙酰輔酶A羧化酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)內(nèi)ACCase活性的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示，兩無性系果皮中ACCase活性變化幅度較小，維持在較低水平波動(dòng)?！}43種子中ACCase活性在7月26日前與果皮基本一致，處在較低水平，7月26日之后酶活性開始緩慢上升，9月26日后開始急劇上升，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值2 929.19 U/L。而‘閩60種子中ACCase活性在9月10日前與果皮基本一致，處于較低水平波動(dòng)變化，9月10日之后酶活性開始呈近似線性快速上升，直至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值2 157.68 U/L。

2.3 磷脂酸磷酸酯酶活性變化

油茶‘閩43與‘閩60果實(shí)內(nèi)PPase活性的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示，兩無性系果皮中PPase活性變化幅度較小，維持在較低水平，總體上呈下降趨勢?！}43種子中PPase活性在7月26日前處在較低水平，且呈緩慢下降趨勢，7月26日之后酶活性開始急劇上升，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值60.30 mg/（g·h）。而‘閩60種子中PPase活性在8月9日前與果皮基本一致，穩(wěn)定在較低水平，8月9日之后酶活性開始呈近似線性快速上升，直至果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最大值83.96 mg/（g·h）。

2.4 油茶果實(shí)生長發(fā)育期間脂類合成酶與粗脂肪的相關(guān)性分析

‘閩43和‘閩60果皮和種子中ACCase活性和PPase活性與粗脂肪的相關(guān)性分析如表1所示。由表1可見，兩無性系果皮中ACCase活性均與粗脂肪含量呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)不大；而兩無性系果皮中PPase活性均與粗脂肪含量呈負(fù)相關(guān)，其中‘閩43果皮中PPase活性與粗脂肪含量呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05）。兩無性系種子中ACCase活性均與粗脂肪含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）；PPase活性也均與粗脂肪含量達(dá)到極顯著正相關(guān)（p<0.01）。表明油茶種子中高活性的ACCase和PPase極大促進(jìn)粗脂肪的合成。

2.5 油茶果實(shí)生長發(fā)育期間粗脂肪與其它果實(shí)性狀的相關(guān)性分析

為了探討油茶果實(shí)中油脂積累與其它果實(shí)性狀的相關(guān)關(guān)系，在‘閩43和‘閩60果實(shí)粗脂肪含量迅速增加到峰值期間，對果形、可溶性糖、蔗糖、還原糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化與種子中粗脂肪含量進(jìn)行了相關(guān)分析。由表2可以看出，兩無性系種子的粗脂肪含量均與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。其中，‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，兩無性系均表現(xiàn)為果皮粗脂肪含量遠(yuǎn)低于種子中粗脂肪含量，表明油茶果實(shí)中種子含油量占極大份額?！}43果實(shí)比‘閩60更早開始油脂的合成，但兩無性系油脂合成的高峰期均主要集中在9月10日至果實(shí)成熟期間。

油脂的合成起始于ACCase催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，ACCase是催化脂肪合成的限速酶。三酰甘油是通過二酰甘油轉(zhuǎn)化生成的，而二酰甘油的形成得益于PPase的催化作用[27]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘閩43和‘閩60果皮中ACCase和PPase活性均穩(wěn)定于低水平范圍，而種子中ACCase和PPase活性均在9月至果實(shí)成熟期間快速上升，基本上與種子內(nèi)油脂合成的高峰期相吻合，此期間ACCase和PPase活性與種子中粗脂肪含量的正相關(guān)都達(dá)到極顯著水平，表明油茶種子內(nèi)ACCase和PPase是參與油脂合成代謝的調(diào)節(jié)酶，在果實(shí)生長發(fā)育過程中，其活性的大小可以促使粗脂肪含量發(fā)生變化。同時(shí)，在此期間兩無性系種子的粗脂肪含量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與還原糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），與可溶性淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。油脂的積累伴隨著蛋白質(zhì)與糖類的代謝、分解與轉(zhuǎn)化，推測一部分的蛋白質(zhì)和糖類在油脂轉(zhuǎn)化過程中形成油脂，這與張凌云等[28]的研究結(jié)果相吻合。而‘閩60種子中粗脂肪含量與果形指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.01），表明果形指數(shù)可作為此品種果實(shí)采集的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

通過比較可以發(fā)現(xiàn)，在油脂合成高峰期，‘閩43種子內(nèi)ACCase活性水平（1 339.19 ～2 929.19 U/L）顯著大于‘閩60（1 161.66～2 157.68 U/L），這大概也是引起兩油茶無性系種子粗脂肪含量差異的主要原因之一。油脂的生物合成是由數(shù)十種酶共同參與，除了ACCase和PPase外，還有許多其他酶對油脂的合成過程具有調(diào)節(jié)作用，如植物脂肪酸合酶系統(tǒng)（FAS）和植物脂酞ACP脫飽和酶等，本文僅初步探索了油茶果實(shí)中ACCase和PPase活性的變化，而油脂轉(zhuǎn)化和積累過程中相關(guān)的其他酶及其作用還需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 馬小煥. 油茶油的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景[J]. 綠色科技， 2013， （12）： 116-117.

[2] 莊瑞林. 中國油茶（第2版）[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2008.

[3] 柏云愛， 宋大海， 張富強(qiáng)， 等. 油茶籽油與橄欖油營養(yǎng)價(jià)值的比較[J]. 中國油脂， 2008， 33（3）： 39-41.

[4] Mahmood T， Rahman M H， Stringam G R， et al. Identification of quantitative trait loci（QTL）for oil and protein conents and their relationships with other seed quality traits in Brassica juncea[J]. Theor Appl Genet， 2006， 113： 1 211-1 220.

[5] 陳永忠， 王湘南， 彭邵鋒， 等. 植物生長調(diào)節(jié)劑對油茶果實(shí)含油率的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2007， 27（1）： 25-29.

[6] 劉 偉， 陳世品， 陳 輝， 等. 土壤養(yǎng)分與油茶產(chǎn)量與種仁含油率的相關(guān)性研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 35（3）： 59-63.

[7] 靳高中， 姚小華， 任華東， 等. 騰沖紅花油茶產(chǎn)量及脂肪酸組成變異研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 34（3）： 492-498.

[8] 王小藝， 曹一博， 張凌云， 等. 油茶生長發(fā)育過程中脂肪酸成分的測定分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（13）： 76-80.

[9] 王湘南， 陳永忠， 伍利奇， 等. 油茶種子含油率和脂肪酸組成研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 28（3）： 11-17.

[10]何立紅， 李志文， 劉勁軍， 等. 油茶象危害與小果油茶果實(shí)特征的相關(guān)性[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2014， 50（12）： 151-155.

[11] 董傳媛. 油茶炭疽病的發(fā)生與植株內(nèi)含物和酶活性關(guān)系的研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[12] 董傳媛， 曹志華， 束慶龍， 等. 油茶果皮內(nèi)含物以及緩沖容量與炭疽病的關(guān)系研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 40（5）： 146-149.

[13] 劉子雷， 姚小華， 楊水平， 等. 浙江紅花油茶果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀變異的研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2007， 29（4）： 83-88.

[14] 杜洋文， 鄧先珍， 周偉國， 等. 油茶長林品種引進(jìn)及綜合評(píng)價(jià)[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2014， 28（3）： 96-100.

[15] 丁曉綱， 張應(yīng)中， 陳清鳳， 等. 廣寧紅花油茶果實(shí)性狀的遺傳變異規(guī)律[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 2012， 30（2）： 23-27.

[16] 周志美， 任華東， 俞新水， 等. 騰沖紅花油茶果實(shí)形態(tài)劃分及經(jīng)濟(jì)性狀差異[J]. 林業(yè)科技開發(fā)， 2013， 27（5）： 67-69.

[17] 季志平. 漚置后油茶果實(shí)內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和積累[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究， 1991， 9（2）： 53-56.

[18] 黃佳聰， 闞 歡， 萬曉軍， 等. 騰沖紅花油茶果實(shí)成熟度及堆漚處理對油產(chǎn)量及其品質(zhì)的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2012， 25（5）： 612-615.

[19] 梁文斌， 譚益民， 佘祥威， 等.催裂劑對油茶果采后生理效應(yīng)與品質(zhì)的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 30（8）： 72-77.

[20] 湯 佳， 馮金玲， 楊志堅(jiān)， 等. 油茶果實(shí)內(nèi)源激素變化與果實(shí)發(fā)育的關(guān)系[J]. 森林與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2015， 35（4）： 331-336.

[21] 陳永忠， 肖志紅， 彭邵鋒， 等. 油茶果實(shí)生長特性和油脂含量變化的研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2006， 19（1）： 9-14.

[22] 張志良， 瞿偉菁. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2005.

[23] 王學(xué)奎. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)（第2版）[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006.

[24] 宗學(xué)鳳， 王三根. 植物生理研究技術(shù)[M]. 重慶： 西南師范大學(xué)出版社， 2011.

[25] 楊若琳， 楊 敏， 張 芬， 等. 油莎豆葉片發(fā)育過程中乙酰輔酶A羧化酶活性與脂肪酸含量的變化及其相關(guān)性分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 50（10）： 1 902-1 907.

[26] 西北農(nóng)業(yè)大學(xué). 基礎(chǔ)生物化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 西安： 陜西科學(xué)技術(shù)出版社， 1986.

[27] 劉 泉. 引進(jìn)油橄欖果肉油脂積累規(guī)律及相關(guān)合成酶活性的研究[D]. 成都： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2012.

[28] 張凌云， 王小藝， 曹一博. 油茶果實(shí)糖含量及代謝相關(guān)酶活性與油脂積累關(guān)系分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 35（4）： 55-60.