夏炳杰　陳思羽　黃會(huì)云　陳玉　張濤#（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院　廣西桂林5400；廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院　南寧5300）

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LTB4、TRPV1及CGRP在急性膽源性胰腺炎中的表達(dá)意義

夏炳杰1陳思羽2黃會(huì)云2陳玉2張濤2#
（1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院廣西桂林54100；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院南寧530011）

摘要：目的：通過(guò)檢測(cè)LTB4、TRPV1及CGRP等指標(biāo)的變化，分析LTB4-TRPV1信號(hào)活化在急性膽源性胰腺炎中的作用。方法：取清潔級(jí)SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、模型組和TRPV1拮抗劑組。采用膽胰管開(kāi)口十二指腸結(jié)扎法制備重癥胰腺炎模型，術(shù)后3 h，除正常組外，其余兩組開(kāi)始分組給藥，術(shù)后12 h，處死全部大鼠，腹主動(dòng)脈取血并收集胰腺組織備測(cè)。用光鏡檢測(cè)胰腺組織超微結(jié)構(gòu)變化，用ELISA技術(shù)檢測(cè)LTB4變化，用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)TRPV1、CGRP變化。結(jié)果：正常組胰腺呈淺粉紅色；模型組見(jiàn)胰腺壞死、出血，部分可見(jiàn)腹水，腹水含血，光鏡下見(jiàn)胰腺腺體結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間隔明顯增大，腺體實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大片凝固性壞死并伴有出血，壞死灶及周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；TRPV1拮抗劑組胰腺組織充血水腫較模型組減輕，未見(jiàn)腹水，光鏡下胰腺實(shí)質(zhì)可見(jiàn)少許壞死、出血及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其組織病理學(xué)評(píng)分較模型組下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。模型組見(jiàn)血淀粉酶、LTB4表達(dá)明顯上升；TRPV1拮抗劑組血淀粉酶、LTB4表達(dá)亦增高但低于模型組，較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；模型組胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)上升；TRPV1拮抗劑組TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)亦增高但低于模型組，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。結(jié)論：內(nèi)源性LTB4活化TRPV1信號(hào)在膽道梗阻性胰腺炎中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用，阻斷TRPV1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將為急性胰腺炎的治療提供新的思路。

關(guān)鍵詞：急性膽源性胰腺炎；白三烯B4；瞬時(shí)電位香草酸亞型受體1；降鈣素基因相關(guān)肽；表達(dá)

急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）是一種以胰酶激活和胰腺自身組織消化為主要特征的化學(xué)性炎癥，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病[1]。臨床可分為輕癥、中度重癥及重癥三大類，其中重癥死亡率為10%～30%。共同通道學(xué)說(shuō)、酒精、暴飲暴食、高血脂、藥物及特異性因素被看作是AP的可能致病因素[2]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，胰腺初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的激活能導(dǎo)致炎性神經(jīng)肽的釋放，一方面可加強(qiáng)疼痛信號(hào)傳遞，另一方面又可引起胰腺內(nèi)血漿外滲和中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，胰腺初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中瞬時(shí)電位香草酸亞型受體1（Transient Receptor Potential Vanilloid Channel-1，TRPV1）通道的活化在重癥胰腺炎中的作用不容忽視[3～4]。我們課題組基于上述研究進(jìn)展，結(jié)合前期工作基礎(chǔ)，在共同通道學(xué)說(shuō)的指導(dǎo)下，采用膽胰管結(jié)扎法制備AP模型，觀察白三烯B4（Leukotriene B4，LTB4）-TRPV1通路中相關(guān)指標(biāo)的變化，探討LTB4、TRPV1、降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）在AP中的地位和作用?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重（300±20）g，許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004，動(dòng)物合格證號(hào)：HNASLKJ20102130，購(gòu)自湖南斯萊爾克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分為正常組、模型組、TRPV1拮抗劑組，每組20只。

1.2試劑及儀器

1.2.1試劑Capsazepine（貨號(hào)C-191）購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，10%福爾馬林、氫氧化鈉、甲醛、無(wú)水乙醇購(gòu)自博仁生物科技有限公司，液氮由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院氧氣中心站提供，二甲苯、Harris蘇木精液、伊紅染色液、1%鹽酸酒精PBS、0.9%生理鹽水、10%水合氯醛、手術(shù)器械、研缽、直灌胃針、金屬夾、石蠟油、一次性注射器（1 ml、5 ml、10 ml)、Eppendorf管（0.5 ml、1.5 ml）購(gòu)自南寧天地?fù)P生物試劑公司，ELISA試劑盒、LTB4購(gòu)自博仁生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）及TRPV1、CGRP引物均由廣州吉坤生物工程技術(shù)有限公司提供，F(xiàn)S Universal SYBR Grenn Mas由廣州聚研生物公司提供。

1.2.2儀器Axiovert200倒置相差顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）、SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）、TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、RM2135型Leica切片機(jī)、HI1210型Leica攤片機(jī)、HI1220型Leica烘片機(jī)、EG1160Leica自動(dòng)包埋機(jī)、PTC-220多通道PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ公司）、Power/Pac300電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、Gel doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）、LXJ-IIB低速大容量離心機(jī)（上海安亭儀器廠）、5810R高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf Centrifuge公司）、ABI3900臺(tái)式高通量DNA合成儀、垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

2　方法

2.1模型制備及分組干預(yù)參照文獻(xiàn)報(bào)道[5]，所有雄性SD大鼠60只，在恒溫（23±2）℃、恒濕（50± 10）%、晝夜循環(huán)（12 h：12 h）條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。除正常組外，模型組采用膽胰管結(jié)扎術(shù)，即在膽胰管開(kāi)口十二指腸壁縫合結(jié)扎；TRPV1拮抗劑組術(shù)前0.5 h先予TRPV1拮抗劑100 μmol/kg腹腔注射預(yù)處理，繼而采用膽胰管結(jié)扎術(shù)，即在膽胰管開(kāi)口十二指腸壁縫合結(jié)扎。術(shù)后3 h，正常組同步飼養(yǎng)；模型組予以等劑量生理鹽水腹腔注射；TRPV1拮抗劑組予以Capsazepine 100 μmol/kg腹腔注射3次，間隔2 h。12 h后，處死全部大鼠，腹主動(dòng)脈取血，拮取胰腺分別置于液氮、中性甲醛、電鏡固定液中備用。

2.2指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1大鼠的胰腺組織病理學(xué)取病變處胰腺組織，常規(guī)固定、石蠟切片、HE染色，普通光鏡下觀察胰腺的病理組織學(xué)改變情況并攝片。

2.2.2大鼠的血淀粉酶、LTB4表達(dá)應(yīng)用干化學(xué)法檢測(cè)血清淀粉酶的變化，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)大鼠的血LTB4表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

2.2.3大鼠的胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（Real-time PCR）檢測(cè)胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)。具體步驟：組織總RNA提取-Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄cDNA-Real time PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)水平的計(jì)算分析。見(jiàn)表1。

表1　大鼠TRPV1、CGRP及GAPDH引物序列

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，符合正態(tài)分布的資料采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1大鼠的胰腺組織病理學(xué)變化參照Rongione胰腺組織病理學(xué)評(píng)分，正常組胰腺見(jiàn)胰腺呈淺粉紅色；模型組大鼠見(jiàn)胰腺壞死、出血，部分可見(jiàn)腹水，腹水含血，光鏡下見(jiàn)胰腺腺體結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間隔明顯增大，腺體實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大片凝固性壞死并伴有出血，壞死灶及周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；TRPV1拮抗劑組大鼠胰腺組織充血水腫較模型組減輕，未見(jiàn)腹水，光鏡見(jiàn)胰腺腺體結(jié)構(gòu)紊亂，實(shí)質(zhì)可見(jiàn)少許壞死、出血及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其組織病理學(xué)評(píng)分較模型組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

3.2大鼠的血清淀粉酶及LTB4表達(dá)變化模型組見(jiàn)血清淀粉酶、LTB4表達(dá)明顯上升，TRPV1拮抗劑組見(jiàn)血清淀粉酶、LTB4表達(dá)較模型組低，差異均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見(jiàn)表2。

表2　大鼠血清淀粉酶、LTB4表達(dá)變化（±s）

表2　大鼠血清淀粉酶、LTB4表達(dá)變化（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別　n　淀粉酶（IU）　LTB4（ng/ml）正常組模型組TRPV1拮抗劑組20 20 20 23.12±8.93*5 672.65±189.54 2 134.54±121.69*11.76±6.54*489.32±22.76 231.25±16.78*

3.3大鼠的胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)變化模型組胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)增高，TRPV1拮抗劑組胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)增高但低于模型組，經(jīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見(jiàn)表3。

表3　大鼠的胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)（±s）

表3　大鼠的胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá)（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別　n　TRPV1　CGRP正常組模型組TRPV1拮抗劑組20 20 20 0.42±0.13*2.78±0.41 1.24±0.21*0.36±0.08*2.17±0.33 1.19±0.11*

3.4TRPV1、CGRP熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　TRPV1、CGRP熒光定量PCR溶解曲線及擴(kuò)增曲線

4　討論

正常情況下，合成的胰酶絕大部分是無(wú)活性的酶原，當(dāng)胰液進(jìn)入十二指腸后，在腸激酶的作用下，首先激活胰蛋白酶原，形成胰蛋白酶，從而激活其他各種胰消化酶原轉(zhuǎn)化為有生物活性的消化酶，對(duì)食物進(jìn)行消化；病理情況下，各種病因?qū)е孪倥輧?nèi)胰酶原激活，引起胰腺自身消化而并發(fā)一系列嚴(yán)重連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致AP發(fā)生[6]。AP發(fā)病過(guò)程中，產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)如白三烯、氧自由基、血管活性物質(zhì)并釋放，引起胰腺微循環(huán)障礙，胰腺缺血壞死，緩激肽、TRPV1等使炎癥持續(xù)[7]，即所謂“胰酶激活-胰腺自行消化-炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)-二次打擊-胰腺缺血壞死-全身炎癥反應(yīng)綜合征”。

脂氧合酶作為一種強(qiáng)烈炎性介質(zhì)，在膽源性胰腺炎發(fā)生、全身炎癥反應(yīng)綜合征中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)LTB4及其受體與胰腺炎關(guān)系密切，兩種LTB4受體亞型在胰腺炎發(fā)病時(shí)其表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，LTB4受體拮抗劑腹腔注射預(yù)處理，具有明確緩解小鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺炎的效應(yīng)[8～9]。本研究結(jié)果亦提示，急性胰腺炎大鼠的白三烯B4、TRPV1及CGRP表達(dá)呈上升趨勢(shì)，與胰腺炎病理學(xué)改變呈正相關(guān)；而予以TRPV1拮抗劑處理后大鼠白三烯B4、TRPV1 及CGRP表達(dá)較模型組明顯下降，胰腺組織病理積分亦呈下降趨勢(shì)，這表明TRPV1介導(dǎo)AP的地位不容忽視。TRPV1作為配體門控非選擇性陽(yáng)離子通道，是一種多型信號(hào)探測(cè)器及多種疼痛刺激的整合器，其編碼基因位于17p13染色體，編碼一種由838個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，主要表達(dá)在胰腺、結(jié)腸上皮及皮膚組織的初級(jí)神經(jīng)元，存在于細(xì)胞膜或胞內(nèi)細(xì)胞器膜上，可以被辣椒素、熱刺激、H+離子、脂氧合酶產(chǎn)物激活[10]。TRPV1去極化初級(jí)神經(jīng)元可導(dǎo)致中樞及靶器官外周神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加，這些神經(jīng)遞質(zhì)具有促炎性介質(zhì)的效用，包括速激肽、SP，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與胰腺炎的發(fā)病[11]。研究指出，TRPV1基因敲除的大鼠對(duì)于傷害性熱刺激的反應(yīng)明顯減低，炎癥反應(yīng)減弱，痛覺(jué)行為消失，并

阻斷促分泌素，干擾胰腺炎的發(fā)生[12]。近來(lái)研究提示，新生乳鼠予以辣椒刺激，破壞辣素受體表達(dá)初級(jí)神經(jīng)元后，無(wú)論是促分泌素-誘導(dǎo)胰腺炎，還是膽道梗阻胰腺炎都得到明顯改善；采用TRPV1抑制劑預(yù)處理后，亦可降低急性胰腺炎的傷害性刺激即改善胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展[13～14]。

由此，我們推測(cè)胰膽管梗阻后導(dǎo)致LTB4分泌增加，LTB4導(dǎo)致胰腺內(nèi)源性初級(jí)神經(jīng)元TRPV1膜表達(dá)增加，TRPV1去極化神經(jīng)元級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，導(dǎo)致傷害性刺激傳遞至脊髓，引起疼痛，繼而CGRP等肽類物質(zhì)釋放增加，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征?？傊?，內(nèi)源性LTB4活化TRPV1信號(hào)可能在膽道梗阻性胰腺炎中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，阻斷TRPV1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將為急性胰腺炎的治療提供新的思路。

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●臨床研究●

Expression and Significance of LTB4, TRPV1 and CGRP in Acute Biliary Pancreatitis

XIA Bing-jie1, CHEN Si-yu2, HUANG Hui-yun2, CHEN Yu2, ZHANG Tao2#
(1The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin, Guangxi54100; 2The Affiliated Ruikang Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning530011)

Abstract:Objective: Through the detection of the changes of leukotriene B4 (LTB4), transient receptor potential vanilloid channel-1 (TRPV1) and calcitonin gene related peptide (CGRP) to analyze the role of LTB4-TRPV1 signal activation in acute biliary pancreatitis. Methods: 60 SD rats were randomly divided into normal group, model group, and TRPV1 antagonist group. The acute pancreatitis model was established by biliary and pancreatic duct with the duodenum ligation. 3 hours after the surgery, the model group and TRPV1 antagonist group were given different drugs, except the normal group. 12 hours after the surgery, all rats were killed, took blood from the abdominal aorta and collected pancreatic tissue for measure. The changes of pancreatic tissue ultra structure were detected by light microscope, the changes of LTB4 were detected by ELISA technique, and the changes of TRPV1 and CGRP were detected by PCR Real-time technique. Results: The pancreas appears light pink in normal group, the pancreas in blank group appears necrosis and hemorrhage, ascites containing with blood. There are pancreatic gland disorders, increased interlobular septa, gland parenchyma necrosis and hemorrhage, inflammatory cell infiltrating in pancreatic tissue under light microscope. Detected by light microscope, the TRPV1 antagonist group rats appear little pancreatic parenchyma necrosis and hemorrhage and little inflammatory cell infiltrating in pancreatic tissue. Compared with blank group, the pancreatic tissue hyperemia and edema was relieved, no ascites. The histopathology score is decreased than those in blank group, P＜0.05. The serum amylase and LTB4 expression of the model group increased significantly, while the blood amylase and LTB4 expression of the TRPV1 antagonist group decreased, compared with the model group have statistical significance, P＜0.05. The pancreatic tissue’s TRPV1 and CGRP mRNA expression in model group increased, while the TRPV1 antagonist group’s decreased, the difference was statistically significant, P＜0.05. Conclusion: The endogenous LTB4 activation TRPV1 signal may play a crucial role in biliary obstructive pancreatitis, so blocking TRPV1 signal transduction will provide new ideas for treating acute pancreatitis.

Key words:Acute biliary pancreatitis; Leukotriene B4; Transient receptor potential vanilloid channel-1; Calcitonin gene related peptide; Expression

#通訊作者：張濤，E-mail：zhangxuan271@aliyun.com

中圖分類號(hào)：R657.51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.02.001

收稿日期：（2016-11-16）