劉崇，李建政,，張亞非，張玉鵬，尤立劍，劉冬梅（哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50090；哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 50090；黑龍江大慶市大同區(qū)環(huán)保監(jiān)測(cè)站，黑龍江 大慶 655）

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Blautia coccoides GA-1的傳代培養(yǎng)及其同化H2/CO2產(chǎn)乙酸特征

劉崇1，李建政1,2，張亞非1，張玉鵬1，尤立劍3，劉冬梅1
（1哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150090；3黑龍江大慶市大同區(qū)環(huán)保監(jiān)測(cè)站，黑龍江 大慶 163515）

摘要：為了解同型產(chǎn)乙酸菌異養(yǎng)代謝與自養(yǎng)代謝的相互作用與機(jī)制，并為快速獲得具有較強(qiáng)自養(yǎng)代謝能力的菌體細(xì)胞提供培養(yǎng)方法，以H2/CO2和（或）葡萄糖為碳源，考察了Blautia coccoides GA-1在連續(xù)傳代培養(yǎng)中的代謝特征。結(jié)果表明，以H2/CO2作為唯一碳源進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，菌株GA-1長(zhǎng)勢(shì)較弱，其子代的自養(yǎng)代謝能力也逐漸下降；在葡萄糖培養(yǎng)基中，菌株GA-1增殖旺盛，但高濃度的葡萄糖對(duì)其自養(yǎng)代謝能力有顯著抑制作用，這種抑制作用可能是自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝對(duì)輔酶A和ATP的競(jìng)爭(zhēng)、酸性環(huán)境造成的代謝抑制以及輔酶I的氧化還原平衡調(diào)節(jié)等綜合作用的結(jié)果。以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，用200 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)菌株GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不僅可獲得穩(wěn)定的子代培養(yǎng)物，而且可以將其利用H2/CO2產(chǎn)乙酸的能力維持在2.16 g乙酸·(g干細(xì)胞)?1的水平。

關(guān)鍵詞：同型產(chǎn)乙酸菌；發(fā)酵；代謝；氫；二氧化碳；乙酸

2015-12-11收到初稿，2016-01-22收到修改稿。

聯(lián)系人：李建政。第一作者：劉崇（1984—），男，碩士研究生。

Received date: 2015-12-11.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (51178136).

引　言

同型產(chǎn)乙酸菌（homoacetogens）是一類(lèi)能夠通過(guò)Wood-Ljungdahl代謝途徑（WLP）將CO2還原為乙酸的專(zhuān)性厭氧微生物，在生命起源、自然生態(tài)的碳循環(huán)、廢水厭氧生物處理等方面均發(fā)揮著重要作用[1-4]。其利用CO2產(chǎn)生乙酸的自養(yǎng)代謝作用，也在節(jié)能減排、氣候變化以及工業(yè)溶劑生成等領(lǐng)域受到高度重視[5-8]。同型產(chǎn)乙酸菌兼具自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝的能力，廣泛分布于自然環(huán)境中[9-10]。由于異樣代謝可以獲得比自養(yǎng)代謝更多的能量，在物質(zhì)組成復(fù)雜的生境中，同型產(chǎn)乙酸菌總是優(yōu)先利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)代謝[11-12]。然而，有關(guān)同型產(chǎn)乙酸菌自養(yǎng)代謝和異樣代謝相互影響的研究卻少見(jiàn)報(bào)道[10]。

在前期研究中，分離獲得了一株同型產(chǎn)乙酸菌Blautia coccoides GA-1[13]。該菌株能夠利用H2/CO2自養(yǎng)生長(zhǎng)并產(chǎn)生乙酸，也能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酸。為獲得足夠的供測(cè)試使用的菌體細(xì)胞，研究中采用葡萄糖培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期異養(yǎng)培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)菌株的自養(yǎng)代謝能力減弱甚至消失。為探討同型產(chǎn)乙酸菌在增殖過(guò)程中的異養(yǎng)代謝和自養(yǎng)代謝的相互作用機(jī)制，本文通過(guò)傳代培養(yǎng)的方式，考察了B. coccoides GA-1異養(yǎng)代謝對(duì)其自養(yǎng)代謝能力的影響，并為獲得具有較強(qiáng)自養(yǎng)代謝能力的菌體提供培養(yǎng)方法。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1菌源

同型產(chǎn)乙酸菌Blautia coccoides GA-1，是從一個(gè)處理制糖廢水的連續(xù)流攪拌槽式反應(yīng)器（CSTR）的活性污泥中分離獲得，嚴(yán)格厭氧，G+，不產(chǎn)芽孢，最適生長(zhǎng)溫度35～40℃，最佳pH 7.5～8.0，以H2/CO2作為唯一碳源的產(chǎn)乙酸速率為8.92 mg·L?1·h?1[13]。

1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 0.53 g，KH2PO40.41 g，NH4Cl 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.11 g，MgCl2·6H2O 0.10 g，NaCl 0.3 g，NaHCO31 g，酵母粉0.5g，半胱氨酸0.5 g，微量元素液10 ml，維生素液10 ml，去離子水1000 ml，pH 7.2～7.5。

葡萄糖培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，按照設(shè)定濃度添加不同劑量的葡萄糖。

微量元素液：ZnSO4·7H2O 0.18 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.01 g，MnSO4·H2O 0.5 g，CoSO4·7H2O 0.18 g，KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g，NiCl2·6H2O 0.03 g，Na2SeO3·5H2O 0.3 mg，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，H3BO30.01 g，去離子水1000 ml。

維生素液：生物素2 mg，煙酸 5 mg，VB610 mg，VB15 mg，VB25 mg，VB120.1 mg，對(duì)氨基苯甲酸 5 mg，硫辛酸 5 mg，葉酸 2 mg，去離子水1000 ml。

1.3接種與培養(yǎng)

以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件[14-15]，用200 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)保存的Blautia coccoides GA-1進(jìn)行培養(yǎng)，以其發(fā)酵混合液為接種物（記為G0），在不同營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)子代培養(yǎng)物進(jìn)行自養(yǎng)能力測(cè)試。所有培養(yǎng)均采用容積為140 ml的血清瓶，每個(gè)培養(yǎng)均設(shè)置3個(gè)平行。

以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，采用不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基對(duì)菌株GA-1母代培養(yǎng)物（G0）的自養(yǎng)代謝能力進(jìn)行測(cè)試。即取G0培養(yǎng)物5 ml，接種于50 ml特定濃度的葡萄糖培養(yǎng)基中，連續(xù)充入H2/CO2混合氣5 min后，膠塞封瓶，37℃、135 r·min?1下恒溫振蕩培養(yǎng)至系統(tǒng)不再有H2消耗現(xiàn)象為止。

以葡萄糖為唯一碳源對(duì)菌株GA-1進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，接種和培養(yǎng)方法與G0培養(yǎng)物自養(yǎng)代謝能力測(cè)試相同，但氣相條件為純氮。由G0連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物依次記為G1、G2、G3等。在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，以H2/CO2混合氣為氣相條件，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)各子代培養(yǎng)物進(jìn)行自養(yǎng)能力測(cè)試。自養(yǎng)代謝培養(yǎng)以H2不再消耗為發(fā)酵終點(diǎn)；異養(yǎng)代謝培養(yǎng)以葡萄糖完全降解為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.4分析項(xiàng)目及檢測(cè)方法

培養(yǎng)液的葡萄糖濃度采用DNS法測(cè)定[16]，pH和菌體干重均依照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定[17]。其中，pH 用DELTA-320型pH計(jì)（梅特勒-托利多）測(cè)定，菌體干重采用恒重法確定。

發(fā)酵液中的有機(jī)揮發(fā)酸濃度，采用SP-6890型氣相色譜儀（FID檢測(cè)器）（山東魯南瑞虹）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)酵系統(tǒng)氣相中的H2體積分?jǐn)?shù)采用SP-6800A型氣相色譜儀（TCD檢測(cè)器）（山東魯南瑞虹）測(cè)定[18]。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1葡萄糖濃度對(duì)B. coccoides GA-1自養(yǎng)能力的影響

為研究菌株GA-1異養(yǎng)代謝對(duì)自養(yǎng)代謝的影響，在體積比為4:1的H2/CO2氣相條件下，采用葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)菌株G0培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)試其自養(yǎng)代謝能力。如圖1所示的結(jié)果表明，在無(wú)葡萄糖的情況下，菌株GA-1利用H2/CO2可產(chǎn)生349 mg·L?1的乙酸，耗氫能力為0.47 mol·(g干細(xì)胞)?1。當(dāng)液體培養(yǎng)基加入葡萄糖后，菌體增殖能力顯著增強(qiáng)，培養(yǎng)物的生物量隨著葡萄糖濃度的升高而增加。然而，其利用H2/CO2的自養(yǎng)代謝能力卻受到顯著抑制，并隨著葡萄糖濃度的提升而降低。在葡萄糖濃度≤200 mg·L?1的情況下，菌株GA-1培養(yǎng)物的耗氫能力仍能保持在0.1 mol·(g干細(xì)胞)?1以上，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到400 mg·L?1以上時(shí)，其耗氫能力大幅降低到了0.05 mol·(g干細(xì)胞)?1以下。分析認(rèn)為，高濃度葡萄糖對(duì)菌株GA-1自養(yǎng)代謝的抑制作用，可能與自養(yǎng)代謝途徑和異養(yǎng)代謝途徑對(duì)輔酶A(CoA)的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)[19-20]。

圖1　混合營(yíng)養(yǎng)條件下葡萄糖濃度對(duì)B. coccoides GA-1生長(zhǎng)代謝的影響Fig.1　Effect of glucose on growth and metabolism of B. coccoides GA-1 in mixotrophic cultures

乙酸的產(chǎn)生和積累，導(dǎo)致菌株GA-1培養(yǎng)系統(tǒng)pH的下降。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖濃度分別為0、100、200、400、600、800和1000 mg·L?1的混合營(yíng)養(yǎng)體系（氣相為H2/CO2），其發(fā)酵終點(diǎn)的pH分別為5.9、6.0、6.1、5.5、5.2、4.9和4.8。研究表明，同型產(chǎn)乙酸菌自養(yǎng)代謝所耐受的最低pH為5.5[10,20-21]。因此，異養(yǎng)代謝（葡萄糖發(fā)酵）產(chǎn)生的大量乙酸導(dǎo)致的低pH環(huán)境，可能是菌株GA-1自養(yǎng)代謝受到抑制的另一個(gè)重要原因。

2.2傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定性

在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下對(duì)B. coccoides GA-1進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。如表1所示，在完全自養(yǎng)的條件下，菌株GA-1長(zhǎng)勢(shì)較弱，其生物量隨著傳代的次數(shù)增加而降低，培養(yǎng)到G6后已無(wú)法維續(xù)。在以葡萄糖為底物的異養(yǎng)條件下（氣相為N2），菌株GA-1長(zhǎng)勢(shì)良好，其生物量隨著葡萄糖濃度的升高而明顯增加。在一定葡萄糖濃度下，經(jīng)復(fù)壯的培養(yǎng)物G0，經(jīng)過(guò)5次連續(xù)傳代培養(yǎng)后，其生長(zhǎng)和代謝特征基本穩(wěn)定。菌株GA-1在G6后，在葡萄糖濃度為200 mg·L?1的培養(yǎng)基中可獲得152 mg·L?1左右的干細(xì)胞和114 mg·L?1左右的乙酸產(chǎn)量，而在1000 mg·L?1的葡萄糖培養(yǎng)基中，則分別穩(wěn)定在407 mg·L?1和357 mg·L?1左右。

研究表明，同型產(chǎn)乙酸菌利用H2/CO2合成乙酸的自養(yǎng)代謝途徑，ATP產(chǎn)量很少，且主要用于CO2的同化，因此細(xì)胞增殖非常緩慢[22]。而一定濃度葡萄糖的存在，則可以為同型產(chǎn)乙酸菌的增殖提供必要的能量，因此可以有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖[1,10,22-23]。可見(jiàn)，ATP的產(chǎn)生與利用在同型產(chǎn)乙酸菌自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝的相互作用中發(fā)揮著重要作用。

表1　B. coccoides GA-1在自養(yǎng)和異養(yǎng)條件下的連續(xù)傳代培養(yǎng)Table 1　Subcultures of B. coccoides GA-1 in autotrophic and heterotrophic cultures

2.3傳代培養(yǎng)物的自養(yǎng)代謝能力

對(duì)表1中3種培養(yǎng)條件下獲得的子代培養(yǎng)物進(jìn)行自養(yǎng)代謝能力測(cè)試。如圖2所示的結(jié)果表明，Blautia coccoides GA-1在完全自養(yǎng)條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)，其G0的耗氫能力為0.59 mol·(g干細(xì)胞)?1。隨著傳代次數(shù)的增加，其耗氫能力迅速下降，在G4僅為0.13 mol·(g干細(xì)胞)?1，其產(chǎn)乙酸量也從G0 的5.35 g·(g干細(xì)胞)?1下降到了G4的1.558 g·(g干細(xì)胞)?1。由于自養(yǎng)代謝能力的下降，菌株GA-1的增殖能力受到了極大限制[10,23]。如圖2所示，G0的生物量為65.23 mg·L?1，在G1即大幅下降為15.9 mg·L?1。生物量的嚴(yán)重不足，導(dǎo)致傳代培養(yǎng)在G4后無(wú)法繼續(xù)。

圖2　B. coccoides GA-1在自養(yǎng)條件下的傳代培養(yǎng)特征Fig.2　Performance of B. coccoides GA-1 in autotrophic culture following subculturing

以1000 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)菌株GA-1進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，各子代的細(xì)胞增殖旺盛（表1），但其自養(yǎng)代謝能力隨著傳代次數(shù)的增加而迅速下降。如圖3所示，G0的耗氫能力為0.068 mol·(g干細(xì)胞)?1，而在G3時(shí)僅有0.03 mol·(g干細(xì)胞)?1，產(chǎn)乙酸能力也從G0的0.80 g·(g干細(xì)胞)?1迅速下降至G3的0.30 g·(g干細(xì)胞)?1，至G7時(shí)其自養(yǎng)代謝能力幾乎消失?？梢?jiàn)，以有機(jī)碳源作為底物對(duì)菌株GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，雖然能夠保證細(xì)胞的快速增殖，但其自養(yǎng)代謝能力卻受到嚴(yán)重抑制。

圖3　B. coccoides GA-1在1000 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)物的自養(yǎng)代謝能力Fig.3　Autotrophic metabolism of subcultures of B. coccoides GA-1 obtained in heterotrophic culture with 1000 mg·L?1glucose

以200 mg·L?1葡萄糖為底物，對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌Blautia coccoides GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)其各子代自養(yǎng)代謝能力進(jìn)行測(cè)試。如圖4所示，在11次的傳代培養(yǎng)中，菌株GA-1各子代培養(yǎng)物的生物量均能夠維持在96.85 mg·L?1左右，其子代培養(yǎng)物的耗氫能力也基本維持在0.35 mol·(g干細(xì)胞)?1左右。其產(chǎn)乙酸能力雖然在前4代逐漸下降，但在G4代以后，基本穩(wěn)定在了2.16 g·(g干細(xì)胞)?1左右。以上結(jié)果表明，以200 mg·L?1葡萄糖對(duì)菌株GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不僅可以使菌體保持良好的增殖能力，也能將其自養(yǎng)代謝能力維持在較好水平。

圖4　B. coccoides GA-1在200 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)物的自養(yǎng)代謝能力Fig.4　Autotrophic metabolism of subcultures of B. coccoides GA-1 obtained in heterotrophic culture with 200 mg·L?1glucose

由表1、圖2、圖3和圖4所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次表明，高濃度的葡萄糖對(duì)菌株GA-1的自養(yǎng)代謝能力具有嚴(yán)重的抑制作用，這一抑制效應(yīng)可能是CoA競(jìng)爭(zhēng)、低pH抑制和ATP供應(yīng)不足共同作用的結(jié)果[10,19-23]。

2.4自養(yǎng)代謝與異樣代謝相互作用機(jī)制分析

同型產(chǎn)乙酸菌既能夠通過(guò)自養(yǎng)代謝將H2/CO2同化為乙酸，又能進(jìn)行異養(yǎng)代謝降解葡萄糖為乙酸[10]。如果不考慮細(xì)胞合成，1 mol葡萄糖可生產(chǎn)3 mol乙酸，其反應(yīng)式為[1,20,22]

總反應(yīng)

如圖5所示，在無(wú)外源H2的情況下，葡萄糖經(jīng)糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑生成丙酮酸，在丙酮酸脫羧酶的催化下生成乙酰輔酶A(AcCoA)，同時(shí)釋放2 mol CO2和8 mol [H]。在葡萄糖發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2和[H]則進(jìn)入WLP通路合成乙酸[6,23]?？梢?jiàn)，同型產(chǎn)乙酸菌對(duì)葡萄糖的降解和轉(zhuǎn)化，耦合了異養(yǎng)代謝通路和自養(yǎng)代謝通路，而AcCoA是這兩個(gè)代謝通路的共同中間產(chǎn)物。

圖5　同型產(chǎn)乙酸菌的代謝途徑（內(nèi)源CO2和[H]為葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生）Fig.5　Metabolic pathway of homoacetogens (endogenic CO2and [H]are generated from glycolysis)1—formate dehydrogenase; 2—formyltetrahydrofolate synthetase; 3—formyltetrahydrofolate cyclohydolase; 4—methylenetetrahydofolate dehydrogenase; 5—methylenetetrahydofolate reductase; 6—methyltransferase; 7—CO dehydrogenase/acetyl-CoA synthase (CODH/ACS); 8—pyruvate dehydrogenase; 9—phosphotransacetylase; 10—acetate kinase; 11—[FeFe]-hydrogenase

如圖1所示，在混合營(yíng)養(yǎng)條件下，同型產(chǎn)乙酸菌B. coccoides GA-1的增殖能力隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高而增強(qiáng)，但其自養(yǎng)代謝能力則隨著葡萄糖濃度的增加而降低。以1000 mg·L?1葡萄糖對(duì)菌株GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)（表1），其子代的自養(yǎng)代謝能力隨著傳代次數(shù)的增加而迅速下降，至G7時(shí)，其同化H2/CO2的能力幾近消失（圖3）。以上結(jié)果均證明，異養(yǎng)代謝對(duì)自養(yǎng)代謝具有一定的抑制作用。分析認(rèn)為，這種抑制現(xiàn)象的發(fā)生可能與以下方面有關(guān)：①在混合營(yíng)養(yǎng)條件下，CoA在自養(yǎng)代謝通路與異養(yǎng)代謝通路耦合中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它不僅催化異養(yǎng)代謝通路中丙酮酸脫羧生成乙酸的反應(yīng)，同時(shí)也催化自養(yǎng)代謝通路中的AcCoA的合成[19-20]。由于同型產(chǎn)乙酸菌可以發(fā)酵葡萄糖迅速增殖，細(xì)胞產(chǎn)生的絕大部分CoA被用于異養(yǎng)代謝途徑的AcCoA合成，而自養(yǎng)代謝途徑獲得的AcCoA則相應(yīng)減少，自養(yǎng)代謝能力因此受到一定程度的抑制[22-24]。②經(jīng)EMP途徑生成乙酸的過(guò)程中，1 mol葡萄糖可凈產(chǎn)2 mol ATP。而H2/CO2經(jīng)WLP途徑生成乙酸的過(guò)程中，無(wú)ATP的凈產(chǎn)出[1, 22-23]。理論上，在混合營(yíng)養(yǎng)條件下，葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生的ATP應(yīng)該可以強(qiáng)化WLP代謝通量[1,22]。但如圖1所示的結(jié)果表明，葡萄糖的增加強(qiáng)化了菌株GA-1的細(xì)胞合成，其對(duì)ATP的快速消耗，使自養(yǎng)代謝作用因能量不足而難以為繼。③如2.1節(jié)所述，在葡萄糖濃度低于400 mg·L?1時(shí)，菌株GA-1發(fā)酵體系的終點(diǎn)pH可維持在5.5以上，而大于400 mg·L?1時(shí)，系統(tǒng)的pH則會(huì)降低到5.5以下。已有研究證明，低于pH 5.5的酸性環(huán)境對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌的代謝將產(chǎn)生顯著抑制作用[10,20-21]。這可能是菌株GA-1在較高葡萄糖濃度下受到抑制的又一原因。（4）研究表明，在較低的pH環(huán)境條件下（pH＜6.5），細(xì)菌為維持胞內(nèi)的輔酶I的氧化還原平衡（NADH/NAD+平衡），胞內(nèi)過(guò)多的H+會(huì)在膜結(jié)合氫化酶（membrane-bound hydrogenase）的催化下與NADH反應(yīng)并以H2的形式釋放到胞外[25-27]。這一生理代謝自我調(diào)節(jié)機(jī)制，無(wú)疑會(huì)抑制同型產(chǎn)乙酸菌在低pH下對(duì)外源H2的吸收和轉(zhuǎn)化。因此，異養(yǎng)代謝產(chǎn)生的乙酸導(dǎo)致的低pH，還可能通過(guò)影響胞內(nèi)NADH/NAD+平衡而對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌的自養(yǎng)代謝作用產(chǎn)生抑制。

如表1所示，菌株GA-1在完全自養(yǎng)的條件下長(zhǎng)勢(shì)很弱，生物量隨著傳代的次數(shù)增加而降低。而在以葡萄糖為碳源的異養(yǎng)條件下，菌株GA-1可旺盛生長(zhǎng)，在傳代過(guò)程中也可獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)物。但過(guò)高的葡萄糖濃度（1000 mg·L?1）會(huì)對(duì)菌株GA-1的自養(yǎng)代謝能力產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制甚至消失（圖3）。將葡萄糖濃度控制為200 mg·L?1時(shí)，不僅可以獲得穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)物，其子代也能保持一定的自養(yǎng)能力（圖4）。這一結(jié)果表明，低濃度的葡萄糖，在有效刺激細(xì)菌生長(zhǎng)的同時(shí)，能夠保證CoA和ATP在自養(yǎng)代謝通路和異養(yǎng)代謝通路中的“合理”分配（圖5），使自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝處于某種“平衡狀態(tài)”，從而保持了菌株GA-1的自養(yǎng)代謝能力。

3　結(jié)　論

（1）B. coccoides GA-1的自養(yǎng)生長(zhǎng)能力較弱，以H2/CO2作為唯一碳源進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，因生物量逐代減少而最終無(wú)法持續(xù)。

（2）B. coccoides GA-1可發(fā)酵葡萄糖快速增殖，但高濃度的葡萄糖對(duì)其自養(yǎng)代謝能力有顯著的抑制作用，經(jīng)連續(xù)傳代獲得的培養(yǎng)物，其自養(yǎng)代謝能力逐漸下降，乃至消失。

（3）以體積比為4:1的H2/CO2混合氣為氣相條件，用200 mg·L?1葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)B. coccoides GA-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，不僅可獲得穩(wěn)定的子代培養(yǎng)物，也能使其自養(yǎng)代謝能力保持在一定水平。

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雕塑作品語(yǔ)言由純“手勢(shì)”和“母材”的觸性而抒寫(xiě)完成 ，主題是在探索歷史時(shí)間長(zhǎng)河中 :藝術(shù)的市俗化和藝術(shù)本質(zhì)之間的糾纏，而思考一種能動(dòng)的經(jīng)典，在社會(huì)生活意識(shí)發(fā)展過(guò)程中的存在值或消亡感。同時(shí)，認(rèn)知為生活必需所建立之物而具有真正的藝術(shù)審視觀所可具有的觀念價(jià)值和發(fā)展力。

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Sub-culturing of novel Blautia coccoides GA-1 and acetate synthesis from H2/CO2in subcultures

LIU Chong1, LI Jianzheng1,2, ZHANG Yafei1, ZHANG Yupeng1, YOU Lijian3, LIU Dongmei1
(1School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, Heilongjiang, China;
2State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, Heilongjiang, China;3Environmental Monitoring Station of Datong District, Daqing 163515, Heilongjiang, China)

Abstract:Though homoacetogens have been defined as autotrophic anaerobes using acetyl-CoA Wood-Ljungdahl carbon fixation pathway (WLP) for energy conservation, acetate production and biomass formation from CO2, these anaerobes can also utilize organic compounds heterotrophically to produce acetate and form biomass by Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) glycolysis. A better understanding of the interrelationship between autotrophy and heterotrophy in homoacetogens will be helpful for acetate biosynthesis from exhaust rich in CO2. However, interaction of the two metabolisms has not been well understood though both of which have been extensively investigated respectively. Blautia coccoides GA-1, a novel homoacetogen strain obtained in a previous study, was introduced to the present research and the interrelationship between autotrophy and heterotrophy in the strain was investigated by sub-culturing with glucose and (or) H2/CO2(vol, 4:1) as carbon source (s). The results showed that the cell production of strain GA-1 in H2/CO2cultures was too low to be sub-cultured after the 5th generation due to the energy produced was very limited in WLP. On the contrary, the strain could grow very well in glucose cultures and could be sub-cultured steadily. However, the autotrophic capability of the subcultures decreased bygenerations, even lost since the 7th generation in 1000 mg·L?1glucose cultures. This may be resulted in: (1) the competition for Coenzyme A (CoA) between the autotrophic WLP and the heterotrophic EMP glycolysis, (2) ATP produced in the strain used up for biosynthesis rather for acetate synthesis from H2/CO2, (3) inhibition of lower pH less than 5.5 to the activity of hydrogenase, (4) negative effect of the lower pH on intracellular balance of NADH/NAD+. In mixotrophic cultures with H2/CO2and 200 mg·L?1glucose as co-carbon sources, strain GA-1 could not only be sub-cultured steadily but also keep autotrophic activity well in the generations with a specific acetate production of about 2.16 g·(g dry cell)?1from H2/CO2.

Key words:homoacetogens; fermentation; metabolism; hydrogen; carbon dioxide; acetate

中圖分類(lèi)號(hào)：X 172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）06—2591—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151884

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51178136）。

Corresponding author:Prof. LI Jianzheng, jianzhengli@hit.edu.cn