陳　成，婁尚靈，米志平，曾　燏，廖文波

(西華師范大學a.生命科學學院;b.珍稀動植物研究所, 四川 南充　637009)

斑腿泛樹蛙(Rhacophorus megacephalus)雄性年齡及其睪丸的不對稱

陳成a，婁尚靈b，米志平b，曾燏b，廖文波a

(西華師范大學a.生命科學學院;b.珍稀動植物研究所, 四川 南充637009)

摘要：在脊椎動物中睪丸的大小不對稱是常見現(xiàn)象，這一現(xiàn)象通?？梢杂醚a償假說來解釋。該假說認為兩個睪丸中較小的一個的增大是為了補償較大一個睪丸在功能上的不足，并且方向不對稱的程度與雄性質(zhì)量成正相關(guān)關(guān)系。對重慶市縉云山自然保護區(qū)的斑腿泛樹蛙(Rhacophorus megacephalus)雄性的年齡和睪丸不對稱性進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該種群的雄性成體平均年齡為2.91 ± 0.83 歲，性成熟年齡為2歲，最大壽命為5歲，并且體長和體重都隨年齡的增加而增加。該種群雄性的左右睪丸大小沒有差別，左睪丸減右睪丸的差值服從正態(tài)分布，表明該物種的睪丸大小不對稱性屬于波動不對稱；左右睪丸重與相對睪丸不對稱程度都沒有相關(guān)性，說明左右睪丸均不充當補償角色；絕對睪丸不對稱程度同個體體長、年齡、身體狀況以及精子密度都沒有相關(guān)性；相對睪丸不對稱程度與個體體長、年齡和身體狀況也沒有相關(guān)性，與精子密度顯著負相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在這個斑腿樹蛙自然種群中沒有關(guān)于補償假說的證據(jù)。此外，還發(fā)現(xiàn)擁有相對較大的右睪丸的個體相對于擁有較大左睪丸的個體，其精子密度更大。

關(guān)鍵詞：斑腿泛樹蛙；年齡；睪丸大?。徊G丸不對稱；補償假說；精子密度

1引言

生物體同種器官的形態(tài)在身體左右兩側(cè)的對稱性分為三種類型：方向不對稱(左右兩側(cè)的形態(tài)指標之間的差值偏離原點且差值服從正態(tài)分布)、反向不對稱(左右兩側(cè)的形態(tài)指標之間的差值不服從正態(tài)分布)和波動不對稱(左右兩側(cè)的形態(tài)指標之間的差值不偏離原點且差值服從正態(tài)分布)[1-3]。正如動物很多其它器官的不對稱一樣，睪丸的不對稱性也得到了廣泛的研究[4-7],這些研究中主要包括了方向不對稱[8,9]和波動不對稱[10-12]。對于睪丸的這兩種不對稱形式，目前通常用補償假說來解釋。該假說認為：(1)當較大睪丸功能異常或功能不足時較小睪丸才起補償?shù)淖饔茫簿褪钦f相對睪丸不對稱性與較大睪丸的大小成正相關(guān)關(guān)系；(2)睪丸不對稱程度越大可能反應出雄性在某些特征上的特點越明顯[3,13]。然而，自從該假說提出過后符合補償假說的研究[14-16]和不符合補償假說的研究[17]都有報道。

雄性質(zhì)量可以從多方面得到反映。身體狀況就通常用于評估雄性質(zhì)量[18-24]。對于兩棲類的無尾目，年齡和身體大小有時也可以反應雄性質(zhì)量的好壞[25]。在體外授精的物種中，精子的密度直接反映了該物種在繁殖時雄性的繁殖成功率，而且精子密度往往與雄性質(zhì)量直接相關(guān)[26，27]。

斑腿泛樹蛙(Rhacophorus megacephalus) 在中國是一個廣泛分布的物種。它的繁殖高峰期一般在四月到六月，常棲息于稻田、水邊的灌木叢和草叢中。該物種一般分布在海拔520m到2 200m之間[28]。到目前為止，還沒有關(guān)于斑腿泛樹蛙年齡和睪丸方面的研究報道。在本研究中我們研究了重慶縉云山自然保護區(qū)斑腿泛樹蛙雄性的年齡和睪丸的不對稱情況。我們的研究目的包括三個：(1)研究這個斑腿泛樹蛙自然種群雄性的年齡結(jié)構(gòu)；(2)研究該種群的睪丸不對稱性是否是方向不對稱；(3)驗證M?ller的補償假說是否適用于該斑腿泛樹蛙種群。

2材料和方法

2011年和2013年的7月5日到7月12日期間我們分別從重慶市縉云山自然保護區(qū)(29°50.40′N, 106°22.86′E, 688m)采集了17只雄性和30只雄性斑腿泛樹蛙。所有的個體都是在手電筒的照射下直接用手捕捉，采集于稻田和草叢。通過觀察婚墊來鑒別是否為成體然后將其帶回實驗室。所有用于本研究的蛙均得到西華師范大學的許可。

所有個體帶回實驗室后均用精度為0.01mm的游標卡尺測量每個個體的體長(吻端到泄殖孔)，并且采用精度為0.1mg的電子天平測量每個個體的體重。然后采用雙毀髓法處死每個個體并解剖。完整地取出左右睪丸后，同樣采用精度為0.1mg的電子天平分別測量其重量，并分別記錄每個個體左右睪丸的重量。

我們對2013年采集的30個雄性個體的精子數(shù)量進行了測量。首先稱量一個干凈空的30mL培養(yǎng)皿記為M1，然后將睪丸和5mL蒸餾水倒入此培養(yǎng)皿并用鑷子將其完全搗碎，用蒸餾水將鑷子上的殘留物全部沖入培養(yǎng)皿，然后在同一電子天平稱量并記為M2。將混合液混勻后用250μL的移液管將其注入血細胞計數(shù)板上(XB-K-25)并放置于熒光顯微鏡(OlympusBH-2)下，使用計數(shù)器數(shù)出0.1μL混合液中的精子數(shù)，其數(shù)量計為A。每個個體的精子總數(shù)采用公式：精子數(shù)量=A×(M2-M1)×104來計算。

個體年齡的確定采用骨齡學方法[29]，該方法已經(jīng)被廣泛應用于無尾目中[30-36]。我們首先去掉每個趾骨的皮膚和肌肉組織，并將骨頭浸入5%的生理硝酸溶液中脫鈣，然后用蘇木精對其進行染色。最后再依次脫水、透明、浸蠟、包埋之后，放置于切片機上將其橫切為13μm厚的切片，挑選骨髓腔最小的部位的切片在載玻片上展片后使用顯微鏡確定每個個體的年齡。第一齡的年齡線通過觀察Kastschenko線(KL，骨內(nèi)外膜的分界線，圖 1)來確定[37]。

左右睪丸大小的差別采用配對t檢驗進行檢測，并且采用Shapiro-Wilks檢驗檢測左睪丸與右睪丸的差值是否符合正態(tài)分布。我們將體長作為自變量，體重作為因變量進行線性擬合，用回歸分析的殘差值作為身體狀況指數(shù)。使用個體的精子數(shù)量除以左右睪丸的總重量計算每個個體的精子密度。左右睪丸的不對稱程度采用絕對不對稱(左睪丸-右睪丸)和相對不對稱((左睪丸-右睪丸) /0.5(左睪丸+右睪丸))兩種方式計算。

為了確定該斑腿泛樹蛙種群的睪丸不對稱性是否可以通過補償假說來進行解釋，我們分析了相對睪丸不對稱性和左右睪丸重的Pearson相關(guān)性，并且采用偏相關(guān)分析分別檢測絕對睪丸不對稱和相對睪丸不對稱同體長、年齡、身體狀況以及精子密度之間的相關(guān)性。所有的數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)檢測采用雙尾檢測，顯著水平設(shè)置為α=0.05。

3結(jié)果

在本研究中很少發(fā)現(xiàn)骨內(nèi)膜被吸收，假線和雙重線也很好辨別(圖1)，因此并不影響我們鑒別年齡。雄性的平均體長和平均體重分別是44.20±3.10mm和5.13±0.9g。該種群的成體平均年齡為2.91±0.83 歲，范圍在2歲到5歲之間(圖2)。體重隨年齡的增加而增加(圖3a,r=0.445,n=47,P=0.002)，體長也隨年齡的增加而增加(圖3b,r=0.378,n=47,P=0.009)。

左右睪丸比較發(fā)現(xiàn)該種群個體的左睪丸和右睪丸之間無顯著差別(t=0.677,df=46,P=0.502)。左右睪丸重量的差值為0.7 ± 1.0mg，平均值與零的差異不顯著(P=0.502)且符合正態(tài)分布(圖 4，df=47,偏度= -0.021±0.347，峰度=0.637±0.681，P=0.482)，表明該斑腿泛樹蛙種群的睪丸不對稱屬于波動不對稱。

通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)相對睪丸重和左右睪丸都沒有相關(guān)性(左睪丸：r=0.255,n= 47,P=0.083；右睪丸：r=-0.215,n= 47,P=0.146)。并且通過偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)絕對睪丸不對稱性和體長(r=0.026,df=25,P=0.897)、年齡(r=-0.098,df=25,P=0.627)、身體狀況(r=-0.091,df=25,P=0.652)以及精子密度(r=-0.233,df=25,P=0.243)都沒有相關(guān)性，相對睪丸不對稱性和體長(r=0.089,df=25,P=0.659)、年齡(r=-0.165,df=25,P=0.410)以及身體狀況(r=-0.174,df=25,P=0.386)都沒有相關(guān)性。我們甚至發(fā)現(xiàn)相對睪丸不對稱性和精子密度有顯著的負相關(guān)關(guān)系(r=-0.409,df=25,P=0.034)。因此，我們沒有找到關(guān)于補償假說的相關(guān)證據(jù)。但我們發(fā)現(xiàn)右睪丸較大的個體比左睪丸較大的個體精子密度高(t=2.258,P=0.038)。

表1　睪丸不對稱程度同雄性各特征間的相關(guān)系數(shù)和P值

注：計算某個特征變量與不對稱程度間的相關(guān)系數(shù)和p值時，其他三個特征變量作為協(xié)變量，所有分析的自由度(df)都為25。

4討論

如圖1所示，骨齡學方法非常適合用于確定斑腿泛樹蛙的年齡。在兩棲動物中，成體體長和年齡的關(guān)系在不同種群中是不同的[38-41]。一些種群中個體體長和年齡成正相關(guān)關(guān)系[42,43]，但是一些種群并不表現(xiàn)出這種關(guān)系[44,45]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)該斑腿泛樹蛙種群雄性個體的體長和年齡是顯著正相關(guān)的，說明該種群的雄性個體是終生生長的。

很多研究發(fā)現(xiàn)鳥類[3-6，13]和無尾類[25，46，47]左睪丸大于右睪丸，也有少量的研究發(fā)現(xiàn)了相反的情況(右>左)[48,49]。我們的研究結(jié)果表明，斑腿泛樹蛙的左右睪丸沒有差異，成波動不對稱性。相似的結(jié)果目前在無尾類中僅發(fā)現(xiàn)于峨眉樹蛙(Rhacophorusomeimontis)種群中[12]。對于很多種群來說，波動不對稱的結(jié)構(gòu)是種群對環(huán)境壓力的一種適應特征[50-53]，同時也是個體發(fā)育的不穩(wěn)定性的一種體現(xiàn)[54-57]。有實驗研究已經(jīng)驗證了波動不對稱可以用于監(jiān)測脊椎動物的選擇壓力大小[58,59]。這些不對稱形式通常與同性間的競爭有關(guān)[60]。因為斑腿泛樹蛙的婚配模式是一雌多雄[28,61]，睪丸的波動不對稱可能是雄性之間激烈的競爭壓力的反映。

一些研究發(fā)現(xiàn)睪丸的不對稱程度與體現(xiàn)雄性質(zhì)量的特征參數(shù)正相關(guān)。在一些物種中體重越大睪丸越不對稱[49]，還有一些鳥類的個體年齡越大睪丸越不對稱[8,9],這些符合補償假說的類型可以解釋為維持兩個較大睪丸所付出的代價高于維持一個較大睪丸而將另一個較小睪丸用于補償作用的情況[13,15]。但是在本研究中我們未發(fā)現(xiàn)相對睪丸不對稱性和任何一側(cè)的睪丸重有相關(guān)性。并且我們也沒有發(fā)現(xiàn)睪丸的不對稱程度同體現(xiàn)雄性質(zhì)量的特征參數(shù)(體長、年齡、身體狀況、精子密度)之間有正相關(guān)關(guān)系。同樣的結(jié)果在其它物種中也有發(fā)現(xiàn)，例如有身體狀況不能反映左右睪丸的不對稱程度的鳥類[8,62]，黑斑蛙和沼水蛙的身體狀況和年齡都與睪丸的不對稱程度無相關(guān)性[46,47]。我們的結(jié)果表明該斑腿泛樹蛙種群的睪丸不對性不符合補償假說，這種現(xiàn)象同鯽魚相似[63]。

有研究用空間限制假說來解釋相同器官在身體兩側(cè)的不對稱性，該假說認為由于體腔大小限制身體兩側(cè)的器官往往會選擇不對稱發(fā)育從而充分的利用有限的空間。根據(jù)該假說睪丸的發(fā)育就應該是方向性不對稱[64]，但是該假說似乎也不能用于解釋斑腿泛樹蛙睪丸的波動不對稱。Yu(1998)推測睪丸的不對稱可能是每個個體兩側(cè)給睪丸提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量的血管發(fā)育不同，從而導致營養(yǎng)和能量在左右睪丸的分配不同[7]。這個解釋可以解釋睪丸的波動不對稱，將來的研究需要考慮睪丸和與它們相連的血管之間的關(guān)系。

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TesticularAsymmetryinSpot-leggedTreefrog(Rhacophorus megacephalus)

CHENChenga,LOUShanglingb,MiZhipingb,ZENGYub,LIAOWenboa

(a.CollegeofLifeSciences,b.InstituteofRareAnimalandPlant,ChinaWestNormalUniversity,NanchongSichuan,637009,China)

Abstract:Testicular asymmetry in vertebrates is common and usually can be explained by compensation hypothesis which states that the smaller of the two testes increases in size to compensate the defection of the larger one,and thus the degree of directional asymmetry will positively correlate with male quality.In this study, we studied the age and testicular asymmetry in the Spot-legged Treefrog (Rhacophorus megacephalus) on Jinyun Mountain Nature Reserve.Mean adult age of this population was 2.89 ± 0.83, and the sexual maturity age and longevity were 2 and 5 years old respectively.Body size and body mass were both increased with age.We found that there was no difference between left and right testis and the distribution of left-minus-right mass conformed to normal distribution with a mean value not deviating from zero,suggesting a fluctuating asymmetry in testes in R.megacephalus.Our findings suggested that neither of the two testes correlated with relative testicular asymmetry indicating that neither of the two testes served as compensatory role.There were no correlations between the absolute testicular asymmetry and body size,age,body condition,or sperm density.And relative testicular asymmetry was also not correlated to body size,age or body condition,but it negatively correlated with sperm density.So no evidence conformed to compensation theory was found in this natural population. Moreover,we found that those individuals with larger right testis had larger sperm density than those with larger left testis.

Keywords：Rhacophorus megacephalus;age;testis size;testicular asymmetry;compensation hypothesis;sperm density

文章編號：1673-5072(2016)02-0137-07

收稿日期：2015-6-15

基金項目：四川省杰出青年科學基金項目(JQ20130016)。

作者簡介：陳成，(1988—)，男，四川巴中人，碩士研究生，主要從事兩棲類動物研究。 通訊作者：廖文波，(1979—)，男，四川遂寧人，教授，主要從事兩棲類動物研究。E-mail：Liaobo_0_0@126.com

中圖分類號：Q954.3

文獻標識碼：A

DOI：10.16246/j.issn.1673-5072.2016.02.003