劉慶豐，劉　毅，焦　正，李中東，施孝金，鐘明康

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 1.臨床藥學(xué)研究室，上?！?00040；2. 中醫(yī)科，上海　200040)

?

三黃湯對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響

劉慶豐1，劉毅2，焦正1，李中東1，施孝金1，鐘明康1

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 1.臨床藥學(xué)研究室，上海200040；2. 中醫(yī)科，上海200040)

摘要：目的研究三黃湯(SHD)對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。方法高糖高胰島素(含地塞米松)誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，給予對(duì)照藥物羅格列酮(Ros)或不同濃度SHD干預(yù)24 h，檢測培養(yǎng)上清中葡萄糖減少(消耗)量、甘油和游離脂肪酸(NEFA)濃度以及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量；以2-脫氧-[3H]-葡萄糖攝入法觀察脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率；應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT-4)的mRNA表達(dá)水平，以Western blot檢測GLUT-4蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，SHD的中高劑量(5、10、20、40 g·L-1)能使胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率增加(P<0.01)、脂肪細(xì)胞內(nèi)TG降低(P<0.01)，細(xì)胞上清液中甘油的濃度不同程度增加(P<0.01)，并明顯減少NEFA的溢出，以上變化在三黃湯5～20 g·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系；同時(shí)，Ros增加葡萄糖消耗、葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率和細(xì)胞內(nèi)TG積累(P<0.01)，對(duì)培養(yǎng)上清中甘油、NEFA無明顯影響(P>0.05)。SHD中、高劑量與Ros都能不同程度明顯上調(diào)GLUT-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。結(jié)論SHD能明顯增加3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TG分解，并減少NEFA溢出，通過調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝改善胰島素抵抗。

關(guān)鍵詞：三黃湯；葡萄糖；甘油三酯；甘油；游離脂肪酸；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4；3T3-L1細(xì)胞

現(xiàn)代研究表明，肥胖作為一種低度炎癥[1]，可以促進(jìn)以胰島素抵抗為中心環(huán)節(jié)的多種代謝綜合癥，如高血糖、高血壓、高血脂、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。脂肪細(xì)胞中糖脂代謝失衡會(huì)導(dǎo)致脂肪組織中脂肪細(xì)胞增多及腫大，引發(fā)肥胖的發(fā)生與發(fā)展。三黃湯(sanhuang decoction,SHD)主要由黃芪、黃連、蒲黃等中藥組成，依據(jù)國家自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的專利藥物益氣散聚方(公開號(hào)：CN 101530517A)的精簡方(三黃方，醫(yī)院協(xié)定處方)配制；該方具有推動(dòng)氣化、活血散瘀、清熱祛濕、調(diào)脂消炎的功效；臨床應(yīng)用多年，用于治療以糖脂異常、腹部肥胖、非酒精性脂肪肝等為主要癥狀的代謝綜合癥患者。前期，我們已報(bào)道了SHD(又名三黃口服液、益氣湯)的制備方法，并對(duì)其進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制研究，表明其主要化學(xué)成分為異喹啉類生物堿、綠原酸、黃酮類成分，另外含有少量的三萜皂苷類、倍半萜類化合物和其它有機(jī)酸類等[2-3]。本研究通過觀察SHD對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響，以及對(duì)脂肪細(xì)胞糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程起限速作用的GLUT-4表達(dá)的影響，探討SHD改善脂肪細(xì)胞糖脂代謝的作用與機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論支持。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

3T3-L1細(xì)胞株(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞典藏所)。

1.2藥品與試劑

三黃湯(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院制劑室制備，藥材總含量4.20 g·mL-1，小檗堿、巴馬汀、藥根堿、綠原酸含量分別為8.39、1.74、0.76、1.96 g·L-1，患者口服量為1.20 g·kg-1·d-1；通常由醫(yī)院制劑室統(tǒng)一煎制后發(fā)給患者，目前尚未成為正式院內(nèi)制劑)由黃芪、黃連、蒲黃、澤瀉、茵陳組成，藥材全部購自上海虹橋中藥飲片有限公司；馬來酸羅格列酮(純度>98%，鄭州荔諾生物科技有限公司)；小牛血清(Gibco，批號(hào)：1270008)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(Gibco，批號(hào)：1300001)；地塞米松(批號(hào)：123K11611)、胰島素(Sigma，批號(hào)：096K16911)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma，批號(hào)：BCBF4310 V)、油紅O (Amresco，批號(hào)：2716B062)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)：1290007)；KRP緩沖液(131.2×10-3mol·L-1NaCl、4.71×10-3mol·L-1KCl、2.47×10-3mol·L-1CaCl2、2.48×10-3mol·L-1Na3PO4、1.24×10-3mol·L-1MgSO4，10×10-3mol·L-1HEPES，pH7.4)、2-脫氧-[3H]-葡萄糖(武漢楷倫化學(xué)新材料有限公司)；脫脂奶粉、硝酸纖維膜購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；葡萄糖臨床檢測試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20081013)；甘油三酯試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20130702)，甘油含量測試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：E1002)；游離脂肪酸測試盒(日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：KMM5430)；TRIzol(Invitrogen，批號(hào)：5189701)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，批號(hào)：00057250)；SYBR Green PCR試劑盒(美國ABI公司，批號(hào)：0905051)；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140521)；蛋白Marker(Fermentas Life Science公司，批號(hào)：SM0671)；兔抗大鼠β-actin一抗(美國SantaCruz公司，批號(hào)：0807)；小鼠抗大鼠GLUT4抗體(R&D公司，批號(hào)：BKZ01)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)：ZB-2301)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(批號(hào)：ZB-2305)、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(批號(hào)：GG98315)均為美國Pierce公司產(chǎn)品；丙烯酰胺(4.21 mol·L-1)-甲叉雙丙烯酰胺(5.22×10-2mol·L-1)、2×Sample Buffer、吐溫20均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3儀器

高速冷凍離心機(jī)(德國 Sigma公司，型號(hào)：2-16PK)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)：Heracell150I)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，型號(hào)：Ti-U)，熒光定量PCR儀(ABI公司，型號(hào)：7500)，酶標(biāo)儀(BioTek，型號(hào)：SynergyHT)，電泳儀(Tanon公司，EPS 300)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司，型號(hào)：STS-8A)；凝膠成像分析儀(GE公司，型號(hào)：LAS 3000)。

2方法

2.1構(gòu)建3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型

與秦佑[4]報(bào)道方法類似，簡言之，將3T3-L1細(xì)胞株，置于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合2 d后(分化0 d)，加含0.50×10-3mol·L-13-異丁基-1-甲基黃嘌呤，1.01×10-6mol·L-1地塞米松，1.72×10-4mol·L-1(1.0 mg·L-1)胰島素，10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h(分化3 d)，換以含1.72×10-4mol·L-1胰島素的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h(分化5 d)，隨后以10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換培養(yǎng)液1次。

2.2實(shí)驗(yàn)分組

24孔板培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞，分化d 10進(jìn)行分組?？瞻讓?duì)照組(Con)：10%胎牛血清的DMEM；三黃湯分為5個(gè)劑量組：相對(duì)生藥量2.5、5、10、20、40 g·L-1；羅格列酮對(duì)照組(Ros)：羅格列酮1.0×10-5mol·L-1。每個(gè)試驗(yàn)藥物重復(fù)6孔，各孔給予同等體積培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃溫育24 h。

2.3脂肪細(xì)胞染色鑒定

采用油紅O染色方法觀察脂肪細(xì)胞分化情況[4]。3.33×10-3mol·L-1甲醛室溫下固定細(xì)胞1 h，PBS洗3次，應(yīng)用浮片法油紅O溶液室溫染色2 h，用異丙醇洗去未著色的染料，然后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，明場鏡下觀察拍攝。

2.4葡萄糖消耗與TG分解產(chǎn)物測定

收集培養(yǎng)上清，應(yīng)用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶(GOD-POD)法測定殘存的葡萄糖濃度，以未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度與之相減得出葡萄糖消耗量，同時(shí)采用bicinchoninic acid(BCA)法測定總蛋白濃度，以mol·g-1·Pro校正結(jié)果；應(yīng)用甘油激酶-甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶法測定游離甘油的濃度；應(yīng)用酯酰輔酶A合成酶-酯酰輔酶A氧化酶(ACS-ACOD)法測定NEFA濃度；各實(shí)驗(yàn)的具體步驟根據(jù)試劑說明書進(jìn)行。

2.5細(xì)胞內(nèi)TG含量測定

細(xì)胞刮刀收集脂肪細(xì)胞，37 ℃-液氮反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，應(yīng)用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-POD)法測定TG濃度，測定細(xì)胞蛋白濃度，以mol·mg-1·Pro校正細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.6葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

將上述誘導(dǎo)好的3T3-L1細(xì)胞以KRP緩沖液洗3次，再以含有胰島素(1.0×10-8mol·L-1)的KRP緩沖液孵育30 min，加入含2-脫氧-[3H]-葡萄糖(1.85×104Bq·mL-1)的KRP緩沖液孵育10 min，然后以預(yù)冷的含0.01 mol·L-1葡萄糖的PBS液快速洗滌3次終止反應(yīng)，再加入1 mL NaOH(1.0×10-4mol·L-1)，2 h后取0.2 mL細(xì)胞裂解液于閃爍液中避光放置12 h，用液體閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。另設(shè)一組細(xì)胞加入細(xì)胞松弛素B(1.0×10-5mol·L-1)作為對(duì)照，所有數(shù)據(jù)減去該值，作為各組葡萄糖攝取率。

2.7逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測GLUT-4 mRNA的表達(dá)

根據(jù)TRIzol說明書抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定濃度[5]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取3 μg總RNA以O(shè)ligo(dT)18為引物，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)總體積20 μL，其中2 μL cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GLUT-4引物上游:5′-CCCCGCTGGAATGAGGTTTTTGAGGTGAT-3′，下游：5′-CAG ACAGGGGCCGAAGATTGGGAGACAGT-3′；β-actin引物上游:5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游：5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 25 s，55℃ 25 s，72℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束由7500軟件分析結(jié)果，計(jì)算CT(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))值，為避免假陽性信號(hào)，使用熔解曲線來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)參照，使用比較法(△△CT)來計(jì)算基因的相對(duì)定量。

2.8Western blot檢測GLUT-4蛋白的表達(dá)

與袁芳[6]報(bào)道方法類似，簡要過程為：取15 μL樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再用含脫脂奶粉和Tween20的TBST室溫下封閉2 h后加入兔抗小鼠GLUT-4抗體(1 ∶1 000)和抗β-actin抗體(1 ∶1 000)孵育(一抗)，4℃搖床上過夜，然后以吐溫/PBS洗滌膜3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育膜，室溫輕搖2 h，充分洗滌后用ECL顯影曝光，洗片。掃描儀掃描電泳條帶，用“MultiGauge”(version 3.1)軟件進(jìn)行光密度積分值分析，計(jì)算出GLUT-4與內(nèi)參照β-actin的光密度積分值之比作為GLUT-4的相對(duì)含量值。

2.9數(shù)據(jù)分析

3結(jié)果

3.1脂肪細(xì)胞分化前后形態(tài)學(xué)變化

3T3-L1前脂肪細(xì)胞為梭形，呈纖維母細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無脂滴。誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞變大變圓，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逐漸出現(xiàn)脂滴，8～12 d后分化率85%以上。分化成熟的脂肪細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)大量脂滴聚集于核周，脂滴可被油紅O染成紅色。見Fig 1。

3.2三黃湯對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗與TG代謝的影響

與Con比較，三黃湯各劑量組、羅格列酮對(duì)照組不同程度促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖攝取利用，培養(yǎng)上清葡萄糖消耗量較對(duì)照組均明顯增加(P<0.01，除2.5 g·L-1組外)，其中SHD各劑量組(由低到高)、Ros較對(duì)照組分別增加102%、120%、150%、166%、154%、215%；三黃湯降低細(xì)胞內(nèi)TG積累(P<0.05或0.01)，羅格列酮使細(xì)胞內(nèi)TG積累增加(P<0.01)；中高劑量的三黃湯增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中甘油含量但降低游離脂肪酸的含量，作用明顯(P<0.01)；羅格列酮對(duì)培養(yǎng)上清中甘油和游離脂肪酸含量作用不明顯(P>0.05)。結(jié)果見Tab 1。在實(shí)驗(yàn)條件下，20 g·L-1的三黃湯對(duì)胰島素抵抗的3T3-L1細(xì)胞糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用接近最大化。

Fig 1　Morphological changes of 3T3-L1 adipocyte before and after differentiation(×200)

A:3T3-L1 adipocyte before differentiation；B:3T3-L1 adipocyte before differentiation stained with oil O;C:3T3-L1 adipocyte after differentiation stained with oil O

3.3三黃湯對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

將Con組葡萄糖攝取率設(shè)為1，較正常細(xì)胞葡萄糖攝取率下降58.1%。干預(yù)12 h后，葡萄糖攝取率發(fā)生明顯變化。由低到高三黃湯各劑量組、羅格列酮對(duì)照組不同程度促進(jìn)胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率(P<0.01，除2.5 g·L-1三黃湯組外)，它們較Con組分別增加2%、39%、78%、111%、86%、251%；2.5 g·L-1的三黃湯不能明顯增加胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率(P>0.05)，但有增加趨勢(shì)。提示干預(yù)時(shí)間為12 h的條件下，20 g·L-1三黃湯對(duì)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的作用接近最大化，見Fig 2。

3.4三黃湯對(duì)GLUT-4的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與Con組比較，三黃湯各劑量組及羅格列酮組均能不同程度升高脂肪細(xì)胞GLUT-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平；其中中高劑量的三黃湯組、羅格列酮組與Con組相比較，對(duì)GLUT-4的mRNA表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見Fig 3和Fig 4。

Tab 1　Dose-effect of SHD on glucose and lipid metabolism of insulin resistant 3T3-L1±s,n=6)

**P<0.01，*P<0.05vsCon

Fig 2　Dose-effect of SHD on glucose intake ratio

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:SHD 40 g·L-1group;7:Ros group.**P<0.01vscontrol group

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:Ros group.**P<0.01vscontrol group

Fig 4　Effect of SanHuang decoction on expression of GLUT4 protein in 3T3-L1 adipocytes by Western blot

1:Con group;2:SHD 2.5 g·L-1group;3:SHD 5 g·L-1group;4:SHD 10 g·L-1group;5:SHD 20 g·L-1group;6:Ros group

4討論

從中醫(yī)臟腑角度而言，代謝綜合征的成因主要是脾氣虛弱，加上多食肥甘，惰怠少動(dòng)。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，從而傷及中焦氣機(jī)，使中焦之氣瘀滯，脾胃升降失常，樞機(jī)不得斡旋，脾氣郁滯；脾主四肢肌肉，活動(dòng)的減少，肌肉的怠惰，也會(huì)影響脾的健運(yùn)。代謝綜合征患者，脾的運(yùn)化、散精功能出現(xiàn)障礙，精微物質(zhì)進(jìn)人體內(nèi)，不能為機(jī)體所利用。脾不散精，物不歸正化則為痰、為濕、為濁、為脂，臨床出現(xiàn)高血糖、高血脂，傷及脈道，則還會(huì)引起高血壓等一系列疾病[7]?！皾?、濁、痰、瘀”之邪積存于腹下，則成腹型肥胖，積存于全身各處，則出現(xiàn)周身肥胖，痰濁結(jié)于中焦，郁而化熱，出現(xiàn)痰熱互結(jié)；痰濁日久，因痰致瘀，或因瘀致痰，則出現(xiàn)痰瘀互阻；痰濁壅塞，阻礙氣機(jī)升降，使肝失疏泄，致氣滯血瘀痰阻，脂濁流溢皮下，積于脈道，瘀久化熱[8]。三黃湯以此立論，以益氣散結(jié)、清熱化痰為主，佐以祛濕降濁、化瘀調(diào)脂。

臨床實(shí)踐中，我們發(fā)現(xiàn)三黃湯對(duì)代謝綜合征或2型糖尿病體形肥胖或超重、肚腹碩大者具有肯定的療效，三黃湯還可明顯降低代謝綜合征人群胰島素抵抗程度，并能改善炎癥狀態(tài)，減輕致心血管病的危險(xiǎn)性[9]。3T3-L1脂肪細(xì)胞是體外研究胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制和降糖藥物作用機(jī)制的重要細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)采用高濃度葡萄糖及高濃度胰島素培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞模型，能較好模仿胰島素抵抗患者體內(nèi)高糖高胰島素血癥的病理環(huán)境。以3T3-L1脂肪細(xì)胞為載體，給予不同劑量的三黃湯，并采用過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動(dòng)劑-羅格列酮作為對(duì)照藥物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)24 h，5個(gè)劑量的三黃湯與Ros均使葡萄糖消耗量分別增加到102%、120%、150%、166%、154%、215%，5個(gè)劑量的三黃湯較Ros組稍差。在多數(shù)情況下，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)都是細(xì)胞葡萄糖利用的限制步驟，而GLUT-4是負(fù)責(zé)脂肪細(xì)胞糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白；正常生理狀態(tài)下，90%以上的GLUT-4分布于細(xì)胞內(nèi)的囊泡中，受胰島素刺激后，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜而促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)；刺激消失后，GLUT-4被細(xì)胞膜內(nèi)吞而從細(xì)胞外膜運(yùn)回細(xì)胞囊泡中[10]。三黃湯上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-4 的mRNA和蛋白的表達(dá)，與其重要組分茵陳中綠原酸以及黃連中小檗堿作用類似[11-12]；本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也驗(yàn)證了三黃湯與羅格列酮都能明顯增加胰島素抵抗的3T3-L1細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)率。

羅格列酮雖然增加胰島素敏感性，但具有增加脂質(zhì)積累、引起肥胖的不良反應(yīng)，盡管其與三黃湯都可以通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-4的表達(dá)，增加脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)用與消耗；但是與羅格列酮增加脂肪細(xì)胞胞內(nèi)TG積累不同，三黃湯使胞內(nèi)TG明顯降低，與組方中高含量的生物堿成分特別是小檗堿抗脂肪細(xì)胞脂質(zhì)生成的作用相似[13]。

胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的脂肪細(xì)胞，其甘油三酯分解加快，F(xiàn)FA過度溢出，而高濃度的FFA又可引起和加重胰島素抵抗，兩者互為因果，相互影響[14]。羅格列酮作為噻唑烷二酮類衍生物胰島素增敏劑的代表藥物，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，但對(duì)脂肪代謝作用并不明顯。三黃湯不但改善脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，還可提高其儲(chǔ)存脂肪能力，抑制外周游離脂肪酸的溢出，即三黃湯可以同時(shí)影響脂肪細(xì)胞的糖代謝與脂代謝來緩解胰島素抵抗。但是，三黃湯這種作用的確切機(jī)制及能量的去處仍不明確，而且，藥物在體內(nèi)與體外的作用機(jī)制并不完全相同，會(huì)受到多種因素的影響，因此進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的作用與影響因素將對(duì)臨床應(yīng)用帶來更多的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Herder C, Schneitler S, Rathmann W,et al. Low-grade inflammation, obesity and insulin resistance in adolescents[J].JClinEndocrMetab,2007, 92(12) :4569-74.

[2]徐璐揚(yáng),李中東,劉慶豐,等.HPLC測定三黃湯中4種成分含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2011, 28(12):1135-8.

[2]Xu L Y, Li Z D, Liu Q F, et al. Determination of four components in sanhuang Decoction by HPLC[J].ChinJModApplPharm,2011,28(12):1135-8.

[3]Liu Q F, Shi X J, Li Z D, et al. Pharmacokinetic comparisons of berberine and palmatine in normal and metabolic syndrome rats[J].JEthnopharmacol,2014,151(1) :287-91.

[4]秦佑,楊瑞儀,陳梅果,等.樹豆酮酸A抑制3T3-L1細(xì)胞脂肪合成與分解的作用研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2016, 32(2):189-93.

[4]Qin Y, Yang R Y, Chen M G, et al. Inhibitory effect of cajanonic acid on lipogenesis and lipolysis in 3T3-L1 adipocyte[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(2):189-93.

[5]張哲,王超.KLF4在糖尿病小鼠心肌組織的表達(dá)及通心絡(luò)膠囊干預(yù)作用研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015, 31(6):876-81.

[5]Zhang Z, Wang C. Expression of KLF4 in diabetic mouse myocardium and the interventional effect of Tongxinluo capsule on diabetic cardiomyopathy[J].ChinPharmacolBull,2015,31(6):876-81.[6]袁芳,李艷青,滕旭,等.慢性間歇性低壓低氧抑制線粒體途徑介導(dǎo)的代謝綜合征大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015, 31(8):1131-6.

[6]Yuan F, Li Y Q，Teng X, et al. Chronic intermittent hypobaric hypoxia ameliorates myocardial apoptosis through inhibiting mitochondrial pathway in rats with metabolism syndrome[J].ChinPharmacolBull,2015,31(8):1131-6.

[7]王文健.代謝綜合征的中西醫(yī)結(jié)合防治[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2004,2(5):390-5.

[7]Wang W J. Prevention and treatment of metabolie syndrome with integrated traditional Chinese and western medieine[J].JChinIntegrMed,2004,2(5):390-5.

[8]劉喜明,仝小林,王朋倩.試論“膏濁”致病論[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,4(12):839-42.

[8]Liu X M, Tong X L, Wang P Q. Argument on the point that“Gao Zuo” causes illness[J].WorldJIntegTraditWestMed,2009,4(12):839-42.

[9]劉慶豐,李中東,施孝金,鐘明康.三黃口服液治療代謝綜合征的療效觀察[J].中藥藥理與臨床,2012,28(4):104-6.

[9]Liu Q F，Li Z D，Shi X J，Zhong M K. Clinical study of San-Huang Decoction in treating metabolic syndrome men[J].PharmacolClinChinMatMed,2012,28(4):104-6.

[10]Zheng D, MacLean P S, Pohnert S C, et al. Regulation of muscle GLUT-4 transcription by AMP-activated protein kinase[J].JApplPhysiol,2001,91(3):1073-83.

[11]陳廣,陸付耳,王增四,等.小檗堿改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗與PI-3K、GLUT-4蛋白相關(guān)性的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(8):1007-10.

[11]Chen G, Lu F E, Wang Z S, et al. Correlation between the amelioration of insulin resistance and protein expression of PI-3K and GLUT4 in type2 diabetic rats treated with berberine[J].ChinPharmacolBull,2008,24(8):1007-10.

[12]梁秀慈,孟文,鐘英麗,等.綠原酸對(duì)高脂乳誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗形成的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2013,29(5):654-8.

[12]Liang X C, Meng W, Zhong Y L,et al. Effects of chlorogenic acid on mouse insulin resistance development induced by high fat emulsion[J].ChinPharmacolBull,2013,29(5):654-8.

[13]Zhou J Y, Zhou S W. Berberine regulates peroxisome proliferator-activated receptors and positive transcription elongation factor b expression in diabetic adipocytes[J].EurJPharmacol,2010,649(1):390-7.

[14]劉長鎖,申竹芳.游離脂肪酸與胰島素抵抗[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2005,21(2):145-9.

[14]Liu C S, Shen Z F. Free fatty acids and insulin resistanc[J].ChinPharmacolBull,2005,21(2):145-9.

Effect of Sanhuang Decoction on glucose and lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes

LIU Qing-feng1,LIU Yi2,JIAO Zheng1,LI Zhong-dong1,SHI Xiao-jin1,ZHONG Ming-kang1

(1.ClinicalPharmacyLaboratory, 2.DeptofTraditionalChineseMedicine,HuashanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Abstract:AimTo observe the effect of SanHuang Decoction(SHD) on glucose and lipid metabolism in insulin resistance(IR) 3T3-L1 adipocytes.MethodsThe IR model of 3T3-L1 adipocytes was induced by high glucose and hyperinsulinism cultivation(also containing dexamethasone). The adipocytes were treated with rosiglitazone(Ros) and different concentrations of SHD(2.5, 5, 10, 20, 40 g·L-1) for 24 h. The content of glucose disappeared from the culture medium was determined as glucose consumption of the cells. The transport of glucose was observed by 2-deoxidation-[3H]-glucose uptake method. The efflux of nonesterified fatty acids(NEFA) from adipocytes was observed by the concentration of NEFA in the culture medium. The mRNA expression of glucose transporter-4(GLUT-4) was measured by real-time polymerase chain reaction(real-time PCR). The protein expression of GLUT-4 was detected by Western blot.ResultsCompared with the Con group, SHD(5, 10, 20, 40 g·L-1) could significantly induce the glucose consumption and transportion(P<0.01), increase the glycerol content in culture supernatant(P<0.01), reduce the NEFA concentration in culture medium and accumulation of intracellular TG(P<0.01). And all of these change showed a concentration-dependent effect when SFD concentrations were from 5 g·L-1to 20 g·L-1. At the same time, Ros could also remarkably induce the glucose consumption and transportion(P<0.01), and increase the accumulation of intracellular TG(P<0.01); but the concentration of NEFA and glycerol in culture medium did not show any difference in the Ros-treated group(P>0.05).ConclusionSHD can increase insulin sensitivity by increasing glucose transportation and consumption in the 3T3-L1 adipocytes as well as decreasing the NEFA efflux from the cells.

Key words:Sanhuang Decoction; glucose; triglyceride; glycerol; free fatty acid; GLUT-4；3T3-L1 adipocytes

收稿日期:2016-01-20,修回日期:2016-03-10

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目(No 2010Y007A，20124053)

作者簡介：劉慶豐(1977-)，男，博士，主管藥師，研究方向：中藥藥動(dòng)學(xué)與藥理學(xué)，E-mail：lqf338@sina.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.025

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0868-06

中國圖書分類號(hào)：R289.5；R329.24；R343.23；R344；R458.5；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.050.html

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

鐘明康(1963-)，男，碩士，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，通訊作者，E-mail：wooo_08@163.com